Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Простые домашние инструменты для обработки фруктовых мух-Drosophila меланогастер

16.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59613

⸱

24 июля 2019 г.

1Department of Zoology and Animal Physiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University

В этой статье

Краткое содержание

Описано здесь использование нескольких самодельных инструментов для передачи, охлаждения и убить взрослых Drosophila, а также для очистки стеклянных флаконов культуры и собирать яйца. Эти инструменты просты в обработке и довольно эффективны в обращении с Drosophila.

Аннотация

Плодовая муха, Drosophila melanogaster, широко используется как в биологических исследованиях и биологии образования. Обработка взрослых мух является общим, но трудно на практике, как взрослые мухи летать. Продемонстрировано здесь, как сделать некоторые простые и экономически эффективные инструменты для решения сложных вопросов в обработке Drosophila. Отверстия в пены пробки сделаны и пипетки советы или воронки вставляются в отверстия. Мухи затем двигаться только в одном направлении в пипетки наконечник / воронка сборки, что позволяет эффективно контролировать передачу взрослых Drosophila в или из флакона. Существующие протоколы были изменены для охлаждающих мух, охлаждая в дробленом льду и перенося их на холодную, твердую поверхность ледяного покрова. Ледяной пакет покрыт куском медицинской марли, которая удерживает обездвиженных мух из сгущенной воды при обследовании под стереомикроскопом. Мухи, наконец, усыпленных для подсчета и сортировки или отбрасываются микроволновой печи. Также была разработана клетка в форме бутылки для сбора яиц, а также трудосберегающее устройство и сопутствующее протокол для очистки стеклянных флаконов культуры.

Введение

Плодовая муха, Drosophila melanogaster, является моделью организма широко используется в биологических исследованиях и биологии образования для изучения широкого круга тем1,2. Основными проблемами обработки drosophila являются передача взрослых от флакона к флакону и иммобилизации мух, чтобы они легче справиться, так как все взрослые (за исключением некоторых мутантов3,4) может летать.

Условно, исследователь передает летит из одного флакона в другой, держа два флакона рот в рот, нажав мух вниз или позволяя мух летать в другой флакон, а затем разделения и replugging обоих флаконов4. Очевидно, что для этого необходимо, чтобы открывались два флакона с одинаковым диаметром, и трудно контролировать количество передаваемых мух. Между тем, это требует быстрых рук, чтобы получить работу, и избежать бродячих мух может привести к проблемам для лаборатории или класса. Добавление экстра девственных мух или самцов мух к уже подготовленному кресту является еще одной рутинной задачей в экспериментах дрозофилы. Условно, мухи должны быть обездвижены в крест флакон перед добавлением дополнительных мух.

Взрослые дрозофилы регулярно обезболиваются эфиром, CO2или леденящей душу5. По сравнению с эфиром и CO2 воздействия, охлаждение является наиболее экономически эффективным агентом для иммобилизации взрослых Drosophila и наименее вредных как для мух и исследователей (особенно молодых студентов)6,7. Однако вода, которая непрерывно конденсируется на холодной поверхности или камере, мочит мух. Трудно определить фенотипы мокрых мух, и они могутлегко повреждаются во время манипуляции 8,9. Это удерживает метод охлаждения от становится все более широкое признание.

Инструменты для переноса мух и метод охлаждения мух ранее были описаны10. В этом вопросе сообщается, что модифицированная методика охлаждения анестезии является безопасной, надежной и осуществимой для экспериментов с дрозофилой. Также описаны в настоящем документе 1) методы для убийства взрослых для подсчета, сортировки или отбрасывания, 2) трудосберегающих устройств и протоколов для очистки стеклянных флаконов культуры, и 3) простая клетка для сбора яиц. Легко разработанные и экономически эффективные инструменты, описанные здесь, могут быть использованы для решения сложных проблем обработки мух, и эти методы были протестированы и доказали свою надежность, надежность и простота в обращении для опытных и начинающих исследователей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка инструментов и аксессуаров

  1. Наконечник/воронка пробки
    1. Получить две вилки губки (диаметр вилки должны быть немного больше, чем внутренний диаметр флаконов, используемых для передачи мух). Сделайте отверстие в центрах губки пробки с подогревом электрического паяльника железа.
    2. Получить два 1 мл пипетки советы, разрезать один пополам поперечным острым ножом, и отбросить заостренный конец. Затем, вырезать 1,5 см заостренный конец от второго кончика пипетки. Клей остатки двух кончиков пипетки вместе с универсальным клеем, чтобы сделать удлиненный кончик пипетки(рисунок 1A).
    3. Вставьте воронку и удлиненный кончик пипетки в вилки губки, чтобы сделать кончик и пробку воронки (в дальнейшем называют Т-и F-стопперов) и крышка пипетка отзыв с 100 зл. микроцентрифуг трубки (Рисунок 1A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длина стебля воронки должна быть больше, чем высота штепсельной вилки. Если он короче или равен высоте штепсельной вилки, то мухи сбегут от стволового отверстия. Конец стебля воронки должен располагаться не менее чем на 2 см над поверхностью культуры среды или на дне пустого флакона. Предпочтительны небольшие воронки (например, диаметр диска nolt;60 мм) с небольшими внутренними диаметрами открытия ствола (злт;5 мм). Либо стекло или пластиковая воронка могут быть использованы, чтобы сделать F-стоппер. Тем не менее, пластиковые воронки предпочтительнее для классов биологии, так как они ломаются менее легко, чем стеклянные воронки.
  2. Микрорассектающие иглы
    1. Получите механические карандаши, которые чувствуют себя комфортно в руке и насекомых булавки, которые соответствуют диаметрам (например, 0,5 мм, 0,7 мм) их свинца заправки.
    2. Вырезать широкие концы насекомых булавки с парой плоскогубцев и файл сократить плоский. Замените свинец булавками(рисунок 1B). Нажмите кнопку и подать 0,5-1 см булавки для проведения вскрытия. Очистите штифт и нажмите его полностью обратно в карандашный вал после вскрытия деятельности, чтобы сделать его безопасным для любого человека для обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микрорассектающие иглы полезны не только при вскрытии органов, таких как личинок слюнных желез, но и при подсчете и сортировке мертвых взрослых мух.
  3. Твердые пакеты со льдом
    1. Получить несколько refreezable твердых icepacks (большие размеры icepacks более предпочтительны). На рисунке 1С показаны ледники, которые работали хорошо, который измеряет 26,5 см х 14,5 см х 2,5 см и имеет верхнюю и нижнюю стороны, которые полностью плоские.
    2. Разрежьте медицинскую марлю (нестерильную) на кусочки, которые немного меньше, чем холодные поверхности ледниковых пакетов, которые они покрывают. Например, кусок медицинской марли чуть меньше 26,5 см х 14,5 см предпочтительнее покрыть ледяной пакет, показанный на рисунке 1С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимые аксессуары для этих инструментов охлаждения включают в себя: ледяная коробка (мы использовали 25 см х 15 см пены поле для одного человека и 37 см х 28 см х 20 см поле для более чем одного человека), который используется для хранения дробленый лед; пара тонкой точки пинцет, которые используются для захвата охлажденных мух за крылья и передать их на флакон; пара защитных рабочих перчаток, которые используются для извилина охлажденных ледников из морозильной камеры с -20 градусов; и пластиковой пленки, которая используется для покрытия стадии стереомикроскопа.
  4. Дрозофила яйцо сбора клетки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Готовые дрозофилы яйцо сбора клетки доступны из многих биотехнологических компаний11. Описана здесь небольшая акриловая бутылка формы яйцеклетки сбора клетке для 60 мм Петри блюда(рисунок 1D слева; клетка дизайн показан в середине). Его можно адаптировать для других размеров блюда Петри (например, 100 мм, 35 мм). Это позволяет легко передавать мух в или из клетки. Простая клетка может быть подготовлена следующим образом.
    1. Используйте оснастки резак, чтобы сократить безалкогольные пластиковые бутылки напитка (500 мл, внутренний диаметр около 65 мм) в приблизительное соотношение 2:1 (указанный конец: тупой конец) соотношение и отказаться от тупого конца.
    2. Оберните полоску карточной бумаги вокруг пластины яблочного сока (внутренний диаметр 60 мм) клейкой лентой «яблочный сок пластина используется для сбора яиц(рисунок 1E, справа)».
  5. Водитель щетки беспроводной трубки
    1. Получить беспроводной дрель водителя (максимальная скорость 500 об/мин).
    2. Получить трубку кисть, которая имеет щетины по бокам, а также его передней. В идеале диаметр кисти должен быть немного больше диаметра культурных флаконов, которые необходимо очистить. Вырезать конец его ручки, чтобы он мог быть вставлен в дрель патрон(Рисунок 1D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимые аксессуары для этих инструментов очистки включают губки из нержавеющей стали и длинные манжеты резиновые перчатки.

2. Перевод взрослых мух из виала А в Vial B

ПРИМЕЧАНИЕ: Перевод взрослых мух из одного флакона в другой является наиболее распространенной практикой, проводимой в экспериментах дрозофилы , например, перенос мух из старой культуры (A) в свежую культуру (B) или с креста флакон (A) в пустой флакон (B) для анестезии. Описанный здесь протокол может быть использован для любых мероприятий по переводу летающих пассажиров для взрослых. Если не указано иное, этот протокол используется для передачи мух из флакона А в флакон B на протяжении всей этой бумаги.

  1. Проверьте стебель воронки F-стоппер и кончик пипетки T-стоппер тщательно, а затем очистить любые мухи, которые остаются в пробках с резиновым воздуходувкой. Этот шаг имеет первостепенное значение, особенно когда один набор Т-и F-стопперов используется для непрерывной передачи различных линий Drosophila.
  2. Нажмите вниз мух и во флаконе И заменить его вилку с T-стоппер, а затем подключить флакон B с F-стоппер.
  3. Инвертировать флакон над флаконом B, вставьте кончик пипетки конце T-стоппера в воронку открытия F-стоппер, стучать края перевернутый флакон, чтобы мухи выскользнуть из кончика пипетки и через стебель воронки, и падение в флакон B. Если какая-либо старая еда во флаконе А становится менее компактной, она может упасть, когда флакон А переворачивается и стучится. В такой ситуации инвертировать флакон B над флаконом А и позволить мухам заползти в флакон B.
  4. Отделите T-стоппер от F-стоппера. Cap pipette кончик конца T-стоппер с 200 Л микроцентрифуг трубки, если остальные мухи во флаконе необходимо быть переданы в другие флаконы на мгновение; в противном случае, удалить T-стоппер и replug флакон A. Удалите F-стоппер и переключите флакон B.

3. Иммобилизация мух путем охлаждения

  1. Держите жесткий refreezable пакеты льда в -20 qC морозильник, по крайней мере 24 ч перед использованием.
  2. Поместите охлажденный, твердый пакет со льдом при комнатной температуре (RT) в течение 20 мин. Слегка смочите кусок неасептической медицинской марли с помощью проточной воды и дайте ему близко цепляться за поверхность ледяного покрова. Медицинская марля может быть повторно использована в следующей мухи охлаждения. В то же время, охладить пустой флакон в дробленый лед.
  3. Передача взрослых мух, которые должны быть обездвижены в охлажденный пустой флакон (CEV). Когда два переноса флаконы разделены, крышка CEV с чашкой Петри или вилкой и стучите CEV против дробленого льда, чтобы коснуться всех мух в CEV вниз на дно. Повторите этот процесс несколько раз, пока все мухи не обездвижены. Мухи будут обездвижены в течение 30 с. Затем поместите CEV во льду на 1 мин. Не рекомендуется переводить слишком много мух в одно время для анестезии.
  4. Налейте охлажденные мухи на медицинскую марлю, которая покрывает пакет со льдом. Распределите перекрывающихся мух с помощью кисти и убедитесь, что каждая муха может быть охлаждена холодной поверхностью ледяного покрова. Если охлажденный жесткий пакет со льдом набухает немного, поместите его на полотенце и работать на его плоской стороне.
  5. Снимите сценические зажимы со стереомикроскопа, накройте сцену куском пластиковой пленки и вывешив на сцену пакет со льдом. Включите верхний свет (желательным источник холодного света), сосредоточьте стереомикроскоп и переместите пакет со льдом до тех пор, пока не будут четко видны охлажденные мухи.

4. Убийство взрослых мух для подсчета, сортировки или отбрасывания

  1. Перенесите взрослых мух в пустой флакон и накройте его блюдом Петри.
  2. Перевернуть флакон, нагреть его в течение 1 мин и 20 с в микроволновой печи, и позволить мертвых мух падение в чашку Петри.
  3. Наденьте защитные рабочие перчатки и выняйте флакон из микроволновой печи. Налейте мертвых мух на белую бумажную карточку, отсчитайте или обследуете мух с помощью микрорасчленительной иглы под стереомикроскоп, и распоряжайте тела мух в мусорном баке после наблюдения.
  4. Чтобы убить нежелательных мух, нагрейте мух в течение 2-3 мин в микроволновой печи, а затем нажмите туши в мусорный бак.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не рекомендуется убивать некоторые штаммы крыла мутантов (например, мутанты длины крыла) для изучения, так как трудно судить по тушам, если крылья выходят за кончик живота, который наблюдается у мух дикого типа.

5. Передача мух в / из бутылки формы яйцо Коллекция Клетка

ПРИМЕЧАНИЕ: Как уже упоминалось выше, T- и F-стопперы используются для передачи мух в и из клетки сбора яиц. Мухи не должны быть под анестетом на протяжении всего этого процесса. Другие детали, такие как приготовление яблочного сока среды, коллекции яиц, и дехорионизации, можно найти в литературе12.

  1. Вставьте клетку коллекции яиц в тарелку яблочного сока или смонтировать тарелку яблочного сока в клетку из бутылки безалкогольных напитков. Печать сустава вокруг двух компонентов с полосой парафина пленки.
  2. Поместите как можно больше мух в клетку и переключите клетку с пеной пробкой после передачи мух.
  3. Чтобы поменять пищу для мух в клетке, перенесите мух в клетку на пустой флакон.
  4. Замените тарелку яблочного сока и запечатайте его, а затем передать мух из флакона обратно в клетку.
  5. Когда сбор яиц заканчивается, перенесите мух в пустой флакон и перенесите их в культурные флаконы.

6. Очистка стеклянных культуры виалы

ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, старый флакон культуры содержит живых мух. В протоколе, описанном здесь, эти мухи не должны быть убиты до очистки, если они не являются трансгенными мухами.

  1. Удалите любые перманентные маркерные чернила из стеклянных флаконов культуры с мокрыми губками из нержавеющей стали.
  2. Замочите культурные флаконы в проточной воде.
    1. Заполните лабораторную раковину водой, добавьте жидкое мыло для мытья посуды в воду и перемешайте.
    2. Погрузите флаконы культуры в воду, затем снимите вилку, позволяя воде запуститься в флакон. Посуда моющего средства в воде сделает любые оставшиеся взрослые мухи опуститься на дно и утонуть в воде.
    3. Замочите старые флаконы культуры в воде, по крайней мере 30 минут.
  3. Освободите патрон сверла, вставьте щетку пробирки и затяните патрон. Проверьте направление селектора вращения и убедитесь, что дрель вращается по часовой стрелке. Отрегулируйте спусковой крючок и убедитесь, что максимальная скорость меньше 500 об/мин.
  4. Очистите культурные флаконы.
    1. Очистите культурные флаконы грубо.
      1. Положите длинную резиновую перчатку на недоминирующую руку и держите флакон в воде.
      2. Держите беспроводной трубки кисти водителя с голой доминирующей рукой, сжать кисть в культуре флакон, и сжать спусковой крючок.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не окунайте батарею в воду. Вращающаяся кисть разрушит старую пищу, кукула и т.д., и удалит более 95% отходов.
      3. Сбросьте отходы в отдельный мусорный бак. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока большая часть отходов в каждом флаконе не будет очищена.
    2. Тщательно очистите культурные флаконы.
      1. Очистите щетку трубки, процедить и очистить раковину, и пополнить его чистой водой.
      2. Удалите оставшиеся отходы из каждой культуры флакон, как описано в разделе 6.4.1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

T- и F-стопперы были разработаны как набор простых инструментов, которые могут быть адаптированы и использованы в любой деятельности передачи мух. Передача мух из старой культуры в несколько свежих культур включает в себя удаление вилки свежих флаконов, заменив их F-стопперами, затем нажав вниз мух в старом флаконе, быстро удалив его вилку, и заменить его T-стоппер. Если старая еда компактна, то важно перевернуть старый флакон и вставить кончик T-стоппера в отверстие F-стоппера, а затем н...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Некоторые самодельные инструменты для обработки основных видов деятельности, связанных с воспитанием дрозофилы и эксперименты описаны в этой работе. Эти инструменты просты, но довольно эффективны. Фактически любая лаборатория может сделать эти инструменты с легкостью, и исследования или учебной лаборатории не нужно, чтобы найти готовую альтернативу, которая, возможно, не доступна на местном уровне.

Передача мух является наиболее распространенной практикой и трудной задачей в экспериме...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автору нечего раскрывать.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Плоскогубцы
Аккумуляторная дрель-шуруповертмакс. скорость: 500 об/мин
Электрический паяльник
Напильник
Диаметр воронкидиска 60 мм
Ящик
Булавки
Инфракрасный термометрHCIYET HT-830
Длинная манжета резиновые перчатки
Механические карандаши Медицинская
марля
Микроцентрифуга пробирка100 мкл
Микроволновая печь
Parafilm
Peri dishвнутренний диаметр 60 мм
Наконечники1 мл
Пластиковая пленка
Phi; 36 мм используется для покрытия пустого флакона
Точечный пинцет
Защитные рабочие перчатки
Повторно замораживаемые твердые пакеты со льдом26,5 раза; 14,5&раз; 2,5 см и более
Резиновая воздуходувка
Защелка
Бутылка500 мл, внутренний диаметр около 65 мм
Губчатая пробка
Губки
Трубчатая щетка
Флакон Фита; 34 мм & раз; 90 мм
для льдаот насекомых для пипеток Пластиковая тарелка Peri& для безалкогольных напитков из нержавеющей стали

Ссылки

  1. Jennings, B. H. Drosophila – a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
  2. JoVE Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Drosophila melanogaster. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  3. Ashburner, M., Roote, J. Laboratory Culture of Drosophila. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 585-599 (2000).
  4. Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2004).
  5. Ashburner, M., Thompson, J. The laboratory culture of Drosophila. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. 2a, Academic Press. 1-109 (1978).
  6. Ratterman, D. M. Eliminating ether by using ice for Drosophila labs. Tested Studies For Laboratory Teaching. O'Donnell, M. A. , 259-265 (2003).
  7. Culturing techniques for Drosophila . , Available from: https://www.ptbeach.com/cms/lib/NJ01000839/Centricity/Domain/113/ap%20biology%20Labs/Culturing%20techniques%20for%20Drosophila.pdf (2019).
  8. Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: A Guide to Species Identification and Use. , Academic Press. (2006).
  9. Artiss, T., Hughes, B. Taking the Headaches Out of Anesthetizing Drosophila: A Cheap & Easy Method of Constructing Carbon Dioxide Staging. The American Biology Teacher. 69 (8), e77-e80 (2007).
  10. Qu, W. -H., Zhu, T. -B., Yang, D. -X. A Modified Cooling Method and its Application in Drosophila Experiments. Journal Of Biological Education. 49 (3), 302-308 (2015).
  11. Egg-laying cages for drosophila. , Available from: https://www.kisker-biotech.com/frontoffice/product?produitId=0H-19-17 (2018).
  12. Roberts, D. B. Drosophila: a practical approach. , 2nd edn, Oxford University Press. (1998).
  13. Tang, M., Peng, Q. -F., Yang, D. Two devices for Drosophila experiments (in Chinese). Bulletin of Biology. 45 (11), 49-50 (2010).
  14. Zhou, T. -y, Gan, J., Yang, D. Preparation of sponge plug and sponge plug based fly transferring device for Drosophila experiments (in Chinese). Bulletin of Biology. 46 (6), 49-50 (2011).
  15. Yang, D. Genetics laboratory investigation. , 3rd edn, Science Press. (2016).
  16. Yang, D. Carnivory in the larvae of Drosophila melanogaster and other Drosophila species. Scientific Reports. 8, (2018).
  17. Stocker, H., Gallant, P. Getting Started: An Overview on Raising and Handling Drosophila. Drosophila: Methods and Protocols. Dahmann, C. , Humana Press. (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Drosophila
Простые домашние инструменты для обработки фруктовых мух-Drosophila меланогастер
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.