Method Article

Реализация нелинейного микроскопа на основе стимулируемого рассеяния Рамана

DOI:

10.3791/59614

⸱

July 6th, 2019

 ,  ,  , 
1National Research Council, Institute for Microelectronics and Microsystems, Naples Unit, Italy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи описана реализация стимулируемого Раманского рассеяния (SRS) микроскопа, полученного путем интеграции экспериментальной установки SRS с лазерным сканющим микроскопом. Микроскоп SRS основан на двух фемтосекундных (fs) лазерных источниках, Ти-Сапфире (Ti:Sa) и синхронизированном оптическом параметрическом осцилляторе (OPO).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стимулируемая Рамана россыпь (SRS) микроскопия использует ближний инфракрасный свет возбуждения; поэтому он разделяет многие свойства мультифотоно-микроскопических изображений. Модальность изображения SRS может быть получена с помощью коммерческих лазерных сканируя микроскопов, оснащая неотнесканированный передний детектор с правильными фильтрами bandpass и схемой обнаружения усилителя блокировки (LIA). Схематическая компоновка типичного микроскопа SRS включает в себя следующее: два импульсных лазерных луча (т.е. насос и зонд, направленные в сканирующий микроскоп), которые должны быть перекрыты как в пространстве, так и во времени на плоскости изображения, а затем сосредоточены на микроскоп цели в образец через два сканирующего зеркала (SMs), которые raster фокусное пятно через x-y плоскости. После взаимодействия с образцом передаваемые выходные импульсы собираются верхней целью и измеряются системой переднего обнаружения, вставленной в перевернутый микроскоп. Импульсы насоса удаляются стеком оптических фильтров, в то время как импульсы зонда, которые являются результатом процесса SRS, происходящего в фокусном томе образца, измеряются фотодиодом (PD). Считывание PD сглажается ЛИА для извлечения глубины модуляции. Двухмерное (2D) изображение получено путем синхронизации переднего блока обнаружения с сканирующим блоком микроскопа. В этой работе описана и успешно продемонстрирована реализация микроскопа SRS, а также отчет о безэтикетках изображениях полистироловых бусинок диаметром 3 мкм. Стоит отметить, что микроскопы SRS не доступны на коммерческой уровне, поэтому для того, чтобы воспользоваться этими характеристиками, самодельная конструкция является единственным вариантом. Поскольку микроскопия SRS становится популярной во многих областях, считается, что это тщательное описание реализации микроскопа SRS может быть очень полезным для научного сообщества.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В приложениях науки о жизни микроскопия SRS стала мощным инструментом для визуализации без этикеток. Основная идея микроскопии SRS заключается в том, чтобы объединить силу колебательных контрастов и его способность приобретать изображения в течение нескольких секунд.

SRS это процесс, в котором разница в частотах между двумя частотами лазерных лучей (сигнал насоса и топит сигнал на разных частотах) соответствует молекулярной вибрации исследуемого образца, вызывая стимулируемое рассеяние Раман и значительное увеличение сигнала Стокса. В отличие от линейной Рамане-спектроскопии, СРС обладает нелинейной зависимостью от входящих световых полей и....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Запуск лазерной системы

  1. Проверьте, поддерживается ли температура охладителей при температуре или ниже 20 градусов по Цельсию.
  2. Проверьте, работает ли блок контроля влажности должным образом, а влажность поддерживается на уровне около 40%.
  3. Включите лазер Ti:Sa, строго следуя инструкциям в руководстве.
  4. Установите длину волны до 810 нм.
  5. Включите OPO и подключенный мини-компьютер. Запустите приложение, которое управляет лазером OPO.
  6. Выберите обход, если при выходе из коробки OPO требуется 100% лазерного выхода Ti:Sa.
  7. Отбрасуйте шунтирование, если 20% лазерного выхода ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пример измерения SRS (т.е. измерение SRS в одной точке выборки) сообщается на рисунке 7. Когда лучи не перекрываются во времени или пространстве, полученный результат сообщается на рисунке 8a. Внерезонанс амплитуда сигнала, измеренного LIA, равна нулю, в то время как фаза сигнала измеряется скачками LIA между отрицательными и положительными значениями. В то время как, когда лучи перекрываются в пространстве, перемещая линию задержки в соответствующем диап.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроскопия SRS вывела изображения без этикетки на новые высоты, особенно в исследованиясложных биологических структурах, таких как липиды, которые имеют основополагающее значение для клеток и клеточной архитектуры. Липиды участвуют в нескольких физиологических путей, таких как производство биологических мембран, и они служат в качестве биосинтетических прекурсоров и преобразователей сигналов10. Липиды упаковываются в специализированные внутриклеточные органеллы, также называемые липидными каплями.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признательны В. Туфано из IMM CNR за его ценную техническую помощь и Джакомо Коцци, специалистпоув по продуктам от Nikon Instruments, за полезные обсуждения и постоянную поддержку. Эта работа была частично поддержана итальянскими национальными оперативными программами PONa3 00025 (BIOforIU) и крупномасштабным проектом общеевропейской исследовательской инфраструктуры Euro-Bioimaging.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Инструмент для аккредитацииNikonNikon C2 ИнструментПоддерживаемый инструмент
APE Программное обеспечение для управления импульсной связьюAPE-APEПрограммное обеспечение для управления импульсной связью Программноеобеспечение для управления
автокорреляторомAPEAPE PulseCheck USB 50Автокоррелятор
Детектор ThorlabsThorlabs DET10AФотодиодный
детектор картаThorlabsКарта ИК детектора Thorlabs VRC
Дихроичное зеркалоSemrockSemrock FF875-Di01-25X36Дихроичное зеркало
Дихроичное зеркалоSemrockFF875-Di01-25x36Дихроичное зеркало
EOMConoptics(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).Клетка Поккельса
Быстрый детекторThorlabsThorlabs DET025AL/MФотодиод
Быстрый зеркальный сканирующий блокNikonC2Сканирующая головка Microscpe
Фемтосекундный лазер Ti:SAКогерентныйкогерентный хамелеон Ultra IIХамелеон Ultra II
Функциональный генераторTTiTG5011 AIM – TTiГенератор функций
Инвертированный оптический микроскопNikonEclipse TE-2000-E, NikonEclipse TE-2000-E,
Nikon Lock-in усилительStandford Research SystemSR844-200 МГц двухфазныйсинхронный усилитель от Stanford Research
Systems Режекторный фильтр,SemrockNF03-808E-25Режекторный фильтр
Оптическая линия задержкиНьюпорт Ньюпорт M-ILS200CCНастраиваемая оптическая линия задержки
Оптический параметрический генераторКогерентныйкогерентный компактный OPOКогерентный компактный OPO
ОсциллографWaveRunner640Zi 4 ГГц OSC/LeCroyЦифровой осциллограф
PCI Карта НациональныйинструментNI PCIe 6363Карта сбора данных
Датчики положения ДетекторыNewportNewport Conex PSD9Датчик положения
Измерительная головкаCoherentPowerMax PM10,лазерный детектор мощности
Translation StageThorlabsThorlabs PT1/MMeachnical Translation Stage со стандартным микрометром

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  2. Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stimulated Raman ScatteringNonlinear MicroscopyLaser AlignmentLock in AmplifierForward DetectionBeam OverlapLabel free ImagingPolystyrene BeadsVibrational ContrastMicroscope Implementation

Related Articles