Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышь Модель васкуляризированной гетеротопной трансплантации селезенки для изучения биологии селезенки и трансплантации иммунитета

16.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59616

⸱

11 июня 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Comprehensive Transplant Center, Northwestern University, 2Department of surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 3Weinberg art and science college, Northwestern University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол детализирует хирургические шаги мышиной модели васкуляризированной трансплантации гетеротопической селезенки, технически сложной модели, которая может служить мощным инструментом в изучении судьбы и долговечности клеток селезенки, механизмов различных селезенки популяций клеток в прогрессировании заболевания и трансплантации иммунитета.

Аннотация

Селезенка является уникальным лимфоидным органом, который играет важную роль в гомеостазе иммунной и гематопойетической систем. Пациенты, которые подверглись спленэктомии, независимо от осаждения причин склонны к развитию подавляющего пост-спленэктомии инфекции и опыт повышенный риск глубокого венозного тромбоза и злокачественных новообразований. Недавно эпидемиологические исследования показали, что спленэктомия может быть связана с возникновением сердечно-сосудистых заболеваний, что свидетельствует о том, что физиологические функции селезенки еще не полностью признаны. Здесь мы представляем модель вылагостающих гетеротопических трансплантаций селезенки, которая не только может быть использована для изучения функции и поведенческой активности подмножеств селезенки иммунной клетки в различных биологических процессах, но и может быть мощным инструментом для тестирования терапевтический потенциал трансплантации селезенки при определенных заболеваниях. Основные хирургические шаги этой модели включают сбор донорской селезенки, удаление реципиента родной селезенки, и реваскуляризации селезенки трансплантата. Используя конгенические штаммы мыши (например, мыши с CD45.1/CD45.2 фонами), мы заметили, что после сингенной трансплантации, как донорские селезенки лимфоцитов и миелоидные клетки мигрировали из трансплантата уже после операционный день 1, в соответствии с приток нескольких типов клеток-реципиентов, тем самым генерируя уникальную химеру.  Несмотря на относительно сложные методы, эта процедура может быть выполнена с коэффициентом успеха 90%. Эта модель позволяет отслеживать судьбу, долговечность и функцию спленоцитов во время устойчивого состояния и в условиях болезни после трансплантации селезенки, тем самым предлагая прекрасную возможность открыть для себя определенную роль для селезенки полученных иммунных клеток в различных процессов заболевания.

Введение

Селезенка является крупнейшим вторичным лимфоидным органом в организме и имеет решающее значение в иммунной и гематопойетической систем. Его функции в основном выполняются двумя морфологически отдельными отсеками, красной мякотью и белой мякотью1. Красная мякоть представляет собой трехмерную сетку из венозных пазух и селезенки, которые состоят из ретикулярных волокон, ретикулярных клеток и связанных с ними макрофагов. Эта уникальная структура позволяет красной мякоти выступать в качестве эффективного фильтра крови, который удаляет посторонние материалы и старые или поврежденные эритроциты. Белая мякоть включает в себя фолликулы, маргинальные зоны, и периартериолярных лимфоидных оболочек (PALS) и является важным местом для антигена захвата и обработки, лимфоцитов самонаведения, преобразования, распространения и созревания2. Тем не менее, селезенка обычно рассматривается как незаменимый орган, потому что другие лимфатические органы, такие как лимфатические узлы, также могут выполнять некоторые из своих функций и потеря селезенки обычно не приводит к смерти. Поэтому спленэктомия широко выполняется в качестве терапевтического метода для пациентовс селезенкой или доброкачественными гематологическими заболеваниями 3. Однако пациенты с спленэктомией сталкиваются с рядом длительных осложнений. Бактериальные инфекции являются наиболее признанными осложнениями спленэктомии4,5. В последнее время подавляющее пост-спленэктомии сепсис был признан интенсивным осложнением спленэктомии, связанные с высокой смертностью6. Кроме того, последние эпидемиологические исследования показывают, что спленэктомия может быть связана с возникновением сердечно-сосудистых заболеваний, предполагая, что дальнейшие физиологические функции селезенки еще предстоит изучить7,8.

В клинике были использованы аутотрансплантация селезенки и аллотрансплантация селезенки. В настоящее время аутотрансплантация селезенки путем имплантации секций селезенки в мешки, созданные в большей области, рассматривается как единственная возможность для сохранения селезенки после травматической спленэктомии9,10. Тем не менее, эффективность этой операции является спорным, как послеоперационные осложнения, как асептический некроз селезенки и мелкой непроходимости кишечника из-за послеоперационных спаек может произойти11. Аллотрансплантация селезенки участвует в многовисцеральной трансплантации12. Клинические данные от многовисцеральной трансплантации предполагает, что аллотрансплантация селезенки может играть защитную роль в отторжении аллотрансплантата тонкой кишки, не вызывая трансплантата против хозяина болезни (GVHD)12. Однако литература о благотворном воздействии аллотрансплантации селезенки как компонента многовисцеральной трансплантации по-прежнему ограничена, и основные механизмы еще предстоит определить. В 2006 году Яир Райснер и др. сообщили, что пересадка ткани эмбриональной селезенки свиньи, которая не имеет Т-клеток для мышей, может вылечить гемофилию А, генетическое заболевание, не вызывая GVHD13, поддерживая, что трансплантация селезенки имеет терапевтические перспективы в определенных заболеваний. Поэтому необходимо провести дальнейшие исследования терапевтического потенциала трансплантации селезенки.

Модели трансплантации селезенки животных являются ценными для изучения недооцененной функции иммунных клеток селезенки при прогрессировании заболевания, а также для проверки потенциального терапевтического эффекта трансплантации селезенки. Экспериментальные модели пересадки цельной селезенки были задокументированы с начала 1900-х годов, как было рассмотрено Коэном14. В 1969 году Коберн Ричард J. и Ли и др. подробно техники трансплантации селезенки у крыс15,16. Совсем недавно, Swirski FK et al. описал модель мыши трансплантации селезенки17. По сравнению с крысиными моделями, мышиные модели трансплантации селезенки более привлекательны из-за ряда присущих ей преимуществ. Например, используя модель мыши, мы можем получить доступ к обширному разнообразию реагентов, недоступных для моделей крыс. Кроме того, с помощью конгенических мышей (например, мышей с CD45.1/CD45.2 фоне), сингенной трансплантации селезенки позволяет отслеживать судьбу, долговечность, и функции спленоцитов18. На основе работы Swirski FK et al.17, мы дополнительно установили этот упрощенный и расширенный протокол трансплантации селезенки у мышей. Описанный ниже протокол сочетает в себе как надежность, так и осуществимость в стандартизированном порядке и может быть использован в качестве инструмента для изучения биологии селезенки и иммунитета к трансплантации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры и использование животных в этом исследовании были выполнены в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Северо-Западного университета (IACUC). В этом исследовании, от 8 до 10 недель мужчин CD45.2 и CD45.1 мышей (как на BALB/c фон, из лаборатории Джексона) были использованы в качестве доноров селезенки и получателей, соответственно, для создания сингенных моделей трансплантации селезенки. Все животные были размещены в стерильной среде в животноводческой среде Северо-Западного университета. Глазная смазка была применена ко всем мышам после анестезии для предотвращения сухости.

1. Хирургическая подготовка, анестезия и режим обезболивании

  1. Поместите стерильную одноразовую драпировку (45,7 см х 66 см) на хирургическую платформу. Аккуратно возьмите мышь, введите кетамин (50 мг/кг) и ксилазин (10 мг/кг) интраперитонеально (ивр) для анестезии, и введите 0,05 мг/кг бупренорфина подкожно для обезболивания.
  2. Обеспечьте глубину анестезии занозой, побрить волосы во всей области живота бритвой и поместить мышь на стерильной хирургической платформе под операционным микроскопом при 6-10x увеличении.

2. Урожай селезенки донора

  1. Стерилизовать живот с алкоголем подготовительной площадки, закрепите конечности хирургической лентой, и сделать 3-4 см средней линии вертикального разреза кожи от лобка к процессу xiphoid с ножницами.
  2. Утилищать брюшную стенку стерильными ретракторами из скрепок. Переместите кишечник на правый фланг живота (левый) стороны хирурга с стерильным ватным тампоном, чтобы разоблачить селезенку. Катеризизировать короткую желудочное вену, прикрепленную к селезенке, стерильной низкотемпературной каутерией(рисунок 1A). Поместите кусок стерильной марли, пропитанной солевым раствором 37 градусов по Цельсию над селезенкой, чтобы она была влажной(рисунок 1B).
  3. Отделить и мобилизовать портальную вену из ткани поджелудочной железы(рисунок 1С)путем отливания ветвей венпортала (превосходная панкреатикодуоденальная вена и правая желудочная вена); поместите шов вокруг портала вены distal из селеблии(рисунок 1D).
  4. Переверните селезенку на правую сторону, чтобы разоблачить ствол аорты и целиакии с селезенкой артерии(рисунок 1E). Вскрыть и мобилизовать аорта-целиакию-селеник артерии путем отливания печеночной артерии и желудочной артерии; поместите шов вокруг проксимальной аорты к целиакии артерии(рисунок 1F-G).
  5. Введите 100 международных единиц (IU) гепарина в нижней полывены вены (IVC), чтобы гепаринизировать все тело и ждать 3 мин, чтобы обеспечить гепарин принимать эффекты. Ligate аорты проксимальной к целиакии артерии, трансектировать портальную вену, а затем пронизать все тело с помощью 10 мл гепаринизированного холода (4 кВ) сольника (10 мл/20 с) от брюшной аорты дистальной до целиакии ствола(рисунок 1H).
  6. Соберите трансплантатселей для селезенки с соответствующим аортальным селезенко-селенным сегментом и портальной веной вместе с сегментом селезенки и небольшой порцией ткани поджелудочной железы. Сохранить трансплантат в 5 мл 4 градусов по Цельсию сольный раствор перед пересадкой. Эвтаназия мышь шейки матки дислокации.

3. Имплантация спленэктомии и селезенки трансплантата

  1. Поместите грелку на хирургическую платформу и отрегулируйте температуру до 37 градусов по Цельсию. Поместите стерильную драпировку (45,7 см х 66 см) на верхней части грелки, чтобы создать стерильную хирургическую платформу. Повторите шаги 2.1 и 2.2 для хирургической подготовки и анестезии. Сделайте разрез средней линии 3-4 см и урепровите брюшную стенку, как описано в шаге 2.1 и шаге 2.2.
  2. Тщательно переместите кишечник на правую сторону мыши стерильным ватным тампоном, чтобы разоблачить селезенку получателя. Свайство селезенки вены и артерии и удалить селезенку.
  3. Аккуратно переместите кишечник в левую сторону мыши и накройте кишечник влажной марлей (пропитанной стерильным солевым раствором 37 градусов Цельсия). Вскрыть и сваить поясничные ветви инфрагенной аорты и IVC; перекрестный зажим инфрачной аорты и IVC с помощью двух 4 мм микрососудистых зажимов.
  4. Поместите 11-0 нейлоновый шов через инфрагенную аорту (полная толщина) и вмагистрайте для создания эллиптической аортомии одним разрезом с микросцисорами (длина должна соответствовать диаметру донорской аорты, рисунок 2А). Пирс IVC с помощью 30 G иглы для создания эллиптической венотомии и расширить открытие донорского портала вены соответствует длина с помощью микроскисаторов(рисунок 2A).
  5. Очистить внутрилюмиевную кровь или сгусток крови (в аорте и IVC) с 500 зл игеля гепаринизированного солинового раствора (10 единиц/мл).
  6. Поместите трансплантат селезенки в правом фланге живота мыши получателя; тщательно определить аортальные манжеты донора и портал вены донора. Убедившись, что сосуды не скручиваются, накройте пересадку селезенки марлей, пропитанной холодным (4 кВС) солевым раствором.
  7. Соедините аортальную манжету донора к проксимальной и дистальной вершине аортаотомии реципиента с двумя швами пребывания (11-0 нейлоновых швов, так же, как ниже)(Рисунок 2B,C). Сделать анастомоз с 2-3 укусов непрерывного 11-0 нейлоновых швов между аорты манжеты донора и аортаотомии реципиента (передняя стенка) (Рисунок 2D). Переверните пересадку селезенки на левую сторону получателя; сделать анастомоз между аорты манжеты донора и аортотомии реципиента (задняя стенка) (Рисунок 2E).
  8. Выполните анастомоз для подключения вены портала донора к задней стенке IVC получателя, используя от 4 до 5 укусов непрерывных швов на внутренней стороне IVC, а затем закрыть шов на внешней стороне IVC(Рисунок 2F,G).
  9. Отпустите зажимы сосуда и используйте стерильный ватный тампонад, чтобы кровотечение тампонады, пока цвет селезенки не будет восстановлен(рисунок 2H).
  10. Закройте брюшную полость с 5-0 синтетический абсорбируемый шов vicryl в непрерывном рисунке. Закройте слой кожи 5-0 нейлоновым швом в прерванном рисунке.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Для шагов 4.7-4.8, в качестве альтернативы, сделать анастомоз между портала вены донора и IVC реципиента первый (шаг 4.8); затем сделать анастомоз между аорты манжеты донора и задней стенки аортоми реципиента, используя от 2 до 3 непрерывных швов внутри аорты и закрыть шов на внешней стороне аорты.

4. Восстановление животных

  1. Вводят 1 мл теплого сосудистого подкожного через 4 отдельных места (0,25 мл/локации) после закрытия брюшной полости.
  2. Держите мышь в контролируемом температурой инкубаторе (30 градусов по Цельсию) в течение первых нескольких часов после операции, следите за мышью до тех пор, пока она не придет в себя достаточное сознание, а затем перенесите мышь в новую чистую клетку с обычной пищей и водой, с грелкой (30 градусов по Цельсию) ) под клеткой. Держите мышь после операции в отдельной клетке.

5. Послеоперационное управление болью

  1. Вводят 0,05 мг/кг бупренорфина подкожно 24 ч и 48 ч после операции для поддержания режима анальгезии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Вся процедура пересадки мышечной селезенки может быть завершена в течение 90 минут опытными микрохирургами. Наша лаборатория провела более 100 пересадок селезенки у мышей. Коэффициент успеха составляет более 90%, как это определено выживанием мыши получателя и пересадки селезенки до послеоперационного дня (POD) 1 или POD 7 (наша конечная точка исследования). Выживание пересадки селезенки было подтверждено макроскопическим внешним видом и анализом цитометрии спленоцитов. Основываясь на наш...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Убедительные данные свидетельствуют о том, что моноциты селезенки играют важную роль в стерильных воспалительных процессах, таких как атеросклероз19, острый ишемический мозг20 или травмы легких18, а также травмы имиокарда I /R и реконструкция21,22,23. В этих докладах подчеркивается недопознавающая роль селезенки во многих хронических заболеваниях, сердечно-с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодаря Северо-Западного университета Всеобъемлющий центр трансплантации и Фейнберг школы медицины исследований программы для ресурсов и финансирования поддержки. В частности, поток Цитометрии и гистологии услуги были предоставлены Северо-Западного университета потока цитометрии основных средств и мышь гистологии и фенотипирования лаборатории, соответственно, оба из которых поддерживаются NCI P30-CA060553 награжден Роберт H Лурье Всеобъемлющий онкологический центр. Мы благодарим мистера Нейта Эспарсу за коррективы этой рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
КетаминWyeth206205-01
КсилазинLloyd Laboratories139-236
Раствор гепаринаAbraxis Pharmaceutical Products504031
Инъекционный класс нормального физиологическогораствора Hospira Inc.NDC 0409-4888-20
70% этанолPharmco Products Inc.
ThermoCare Система интенсивной терапии для мелких животныхThermocare, Inc.
Щипцы AdsonRoboz Хирургические инструментыRS-5230
Derf ИглодержательRoboz Хирургические инструментыRS-7822
Сверхтонкие микродиссекционные ножницыRoboz Хирургические инструментыRS-5881
МикрозажимRoboz Хирургические инструментыRS-5420
7-0 шелкBraintree ScientificSUT-S 103
11-0 нейлон на игле 4 мм (3/8) SharpointDR4AK-2119
Ms CD45.2 антителоBDBioscience 553772
Ms CD45.1 антителоBD Bioscience553776
Ms CD11b антителоBD Bioscience557657
Ms B220 антителоBD Bioscience553089
Ms Ly6C антителоeBioscience48-5932-80
Ms Ly6G антителоBD Bioscience561236
Ms F4/80 антителоBD Bioscience565614
Ms CD11c антителоBD Bioscience558079
Ms CD3 антителоeBioscience48-0032-82
Ms CD4 антителоBD Bioscience552051
Антитело к Ms CD8BD Bioscience563786
LIVE/DEAD&торговля; Исправляемый набор для удаления фиолетовых пятен от мертвых клетокThermo FisherL34955
111000140

Ссылки

  1. Cesta, M. F. Normal structure, function, and histology of the spleen. Toxicologic Pathology. 34 (5), 455-465 (2006).
  2. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
  3. Misiakos, E. P., Bagias, G., Liakakos, T., Machairas, A. Laparoscopic splenectomy: Current concepts. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 9 (9), 428-437 (2017).
  4. Kristinsson, S. Y., Gridley, G., Hoover, R. N., Check, D., Landgren, O. Long-term risks after splenectomy among 8,149 cancer-free American veterans: a cohort study with up to 27 years follow-up. Haematologica. 99 (2), 392-398 (2014).
  5. Thai, L. H., et al. Long-term complications of splenectomy in adult immune thrombocytopenia. Medicine (Baltimore). 95 (48), e5098(2016).
  6. Sinwar, P. D. Overwhelming post splenectomy infection syndrome - review study. International Journal of Surgery. 12 (12), 1314-1316 (2014).
  7. Rorholt, M., Ghanima, W., Farkas, D. K., Norgaard, M. Risk of cardiovascular events and pulmonary hypertension following splenectomy - a Danish population-based cohort study from 1996-2012. Haematologica. 102 (8), 1333-1341 (2017).
  8. Crary, S. E., Buchanan, G. R. Vascular complications after splenectomy for hematologic disorders. Blood. 114 (14), 2861-2868 (2009).
  9. Di Carlo, I., Pulvirenti, E., Toro, A. A new technique for spleen autotransplantation. Surgical Innovation. 19 (2), 156-161 (2012).
  10. Holdsworth, R. J. Regeneration of the spleen and splenic autotransplantation. British Journal of Surgery. 78 (3), 270-278 (1991).
  11. Tzoracoleftherakis, E., Alivizatos, V., Kalfarentzos, F., Androulakis, J. Complications of splenic tissue reimplantation. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 73 (2), 83-86 (1991).
  12. Kato, T., et al. Transplantation of the spleen: effect of splenic allograft in human multivisceral transplantation. Annals of Surgery. 246 (3), discussion 445-436 436-444 (2007).
  13. Aronovich, A., et al. Correction of hemophilia as a proof of concept for treatment of monogenic diseases by fetal spleen transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (50), 19075-19080 (2006).
  14. Cohen, E. A. Splenosis; review and report of subcutaneous splenic implant. Archives of surgery. 69 (6), 777-784 (1954).
  15. Coburn, R. J. Spleen transplantation in the rat. Transplantation. 8 (1), 86-88 (1969).
  16. Lee, S., Orloff, M. J. A technique for splenic transplantation in the rat. Surgery. 65 (3), 436-439 (1969).
  17. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325 (5940), 612-616 (2009).
  18. Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  19. Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).
  20. Kim, E., Yang, J., Beltran, C. D., Cho, S. Role of spleen-derived monocytes/macrophages in acute ischemic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (8), 1411-1419 (2014).
  21. Bronte, V., Pittet, M. J. The spleen in local and systemic regulation of immunity. Immunity. 39 (5), 806-818 (2013).
  22. Wang, N. P., et al. Recruitment of macrophages from the spleen contributes to myocardial fibrosis and hypertension induced by angiotensin II. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 18 (2), 1470320317706653(2017).
  23. Tian, Y., et al. The spleen contributes importantly to myocardial infarct exacerbation during post-ischemic reperfusion in mice via signaling between cardiac HMGB1 and splenic RAGE. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 62(2016).
  24. Jang, Y., et al. Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection. Journal of Immunology. 200 (6), 1982-1987 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

analysis
Мышь Модель васкуляризированной гетеротопной трансплантации селезенки для изучения биологии селезенки и трансплантации иммунитета
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.