Здесь мы представляем протокол для обработки свежего костного мозга (БМ), изолированного от мыши или человека для высокомерной массовой цитометрии (Цитометрия Time-Of-Flight, CyTOF) анализ нейтрофил-линии клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка цельного костного мозга для анализа массовой цитометрии нейтрофил-линейных клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этой статье мы представляем протокол, который оптимизирован для сохранения нейтрофил-линии клеток в свежем БМ для всего анализа BM CyTOF. Мы использовали миелоидно-предвзятый 39-антитела CyTOF панели для оценки гематопоитической системы с акцентом на нейтрофил-линии клеток с помощью этого протокола. Результат CyTOF был проанализирован с помощью алгоритма уменьшения измерения с открытым ресурсом, viSNE, и данные были представлены, чтобы продемонстрировать результаты этого протокола. Мы обнаружили новые популяции нейтрофилов линий клеток на основе этого протокола. Этот протокол свежего целого препарата БМ может быть использован для 1), анализ CyTOF, чтобы обнаружить неопознанные популяции клеток из всего БМ, 2), исследуя целые дефекты БМ для пациентов с заболеваниями крови, такими как лейкемия, 3), помогая оптимизации Флуоресценция активированный поток цитометрии протоколы, которые используют свежий весь БМ.
Введение
В последние несколько десятилетий, методы цитометрии были мощным инструментом для исследования гематопоетической системы в БМ. Эти методы включают флуоресценцию активированный поток цитометрии и новый метод CyTOF с использованием тяжелых металлов помечены антителами. Они привели к открытиям многих типов клеток в неоднородном биологическом образце, идентифицируя их уникальные профили выражения поверхностных маркеров. Увеличенное перекрытие спектра, связанное с большим количеством каналов, приводит к более высокой неточности данных в приложениях цитометрии с активацией флуоресценции. Таким образом, нежелательные клетки регулярно удаляются для того, чтобы обогатить группы клеток, представляющих интерес для флуоресценции активированный анализ цитометрии потока. Например, Ly6G (или Gr-1) и CD11b считаются зрелыми маркерами миелоидных клеток, а Ly6G (или Gr-1) и CD11b - клетки обычно удаляются из образцов БМ с помощью комплектов магнитного обогащения до анализа цитометрии гематопоитических стволовых и прародителей клеток (HSPCs) или путем объединения этих маркеров в одном канале свалки коктейль1,2,3. Другим примером является то, что нейтрофилы обычно удаляются из образца крови человека, чтобы обогатить периферические моноядерные клетки крови (PBMC) для иммунологических исследований. Весь костный мозг, изолированный от мыши или человека, однако, редко исследуются нетронутыми для анализа цитометрии.
В последнее время CyTOF стал революционным инструментом дляисследования гематопойтической системы 4,5,6. С CyTOF, флюорофор-маркированные антитела заменены тяжелыми антителами репортер-маркированного элемента. Этот метод позволяет замерить более 40 маркеров одновременно без беспокойства перекрытия спектра. Это позволило провести анализ нетронутых биологических образцов без предистоистой меры или канала свалки. Таким образом, мы можем просматривать гематопоиетическую систему комплексно с высокой объемностью содержания из обычных 2-D потока цитометрии участков. Популяции клеток, опущенные в прошлом во время процесса истощения или gating, теперь могутбыть выведены на свет с помощью высокомерных данных, генерируемых CyTOF 4,5. Мы разработали антителой панели, которая одновременно измеряет 39 параметров в гематопоетической системе с акцентом на миелоидный linage7. По сравнению с обычными данными цитометрии потока, интерпретация и визуализация беспрецедентных одноклеточных высокомерных данных, генерируемых CyTOF, является сложной задачей. Вычислительные ученые разработали методы уменьшения размерности для визуализации высокомерных наборов данных. В этой статье мы использовали алгоритм viSNE, который использует t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) для анализа данных CyTOF и представления высокомерного результата на 2-мерной карте, сохраняя при этом высокомерную структуру данных8,9,10. На участке tSNE похожие ячейки группируются в подмножества, и цвет используется для выделения особенностей ячеек. Например, на рисунке 1 миелоидные клетки распределены по нескольким подмножествам клеток на основе сходства их моделей выражения 33 поверхностных маркеров в результате CyTOF (Рисунок 1)4. Здесь мы исследовали мыши костного мозга с нашими ранее сообщалось 39-маркер CyTOF панели viSNE анализа7. ViSNE анализ наших данных CyTOF показал неопознанную популяцию клеток, которые показали, как HSPC (CD117)и нейтрофил (Ly6G)характеристики (Рисунок 2)7.
В заключение, мы представляем протокол для обработки свежего костного мозга для анализа CyTOF. В этой статье мы использовали костный мозг мыши в качестве примера, в то время как этот протокол также может быть использован для обработки образцов костного мозга человека. Детали, характерные для образцов костного мозга человека, также отмечены в протоколе. Преимущество этого протокола в том, что он содержит такие детали, как время инкубации и температура, которые были оптимизированы для сохранения нейтрофил-линии клеток в целом костного мозга, чтобы исследование на нетронутыми весь костный мозг. Этот протокол также может быть легко изменен для флуоресценции активированный поток цитометрии приложений.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты следовали утвержденным руководящим принципам Института аллергии и иммунологии Ла Хойя по уходу за животными и использованию комитета, и разрешение на использование грызунов было получено от Института аллергии и иммунологии Ла Хойя в соответствии с критериями, изложенными в Руководство по уходу и использованию лабораторных животных от Национальных институтов здравоохранения.
1. Урожай мышь костного мозга (BM)
- Покупка c57BL/6J мышей от коммерческого поставщика. Кормите стандартный грызун чау диеты и дома в микроизолатор клетки в патоген-бесплатно объекта.
- Используйте мышей мужского пола, возраст 6-10 недель, для экспериментальных целей. Эвтаназия путем вдыхания CO2 с последующим вывихом шейки матки.
- Поместите мышь на стерильную хирургическую площадку с стороной живота вверх. Стерилизовать кожу живота и задних конечностей области путем распыления 70% этанола. Используйте пару вскрытия хирургических ножниц, чтобы сократить брюшной полости открытым.
- Удалите кожу, чтобы разоблачить задние конечности. Используйте пару тупых наконечников одевания щипцы держать мышь голени прямо под лодыжкой. Используйте еще одну пару изогнутых щипцы для стабилизации голени ниже тупой кончик одевания щипцы. Перерыв голени и разоблачить кости, срывая мышцы с тупым наконечником одевания щипцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Голени свободно прилагается к коленному суставу и может быть легко выбрал с помощью тупой кончик одевания щипцы. - Поместите голени в холодный 1x PBS.
- Затем переместите стабилизирующие изогнутые декораты вниз к бедренной кости. Слайд тупой кончик одевания щипцы ниже коленного сустава и удерживайте коленную чашу. Вывихните коленную чашечку, осторожно потянув его вверх. Разоблачить бедренную киша, срывая мышцы, прикрепленные к коленной чашечке. Держите подвергаются бедренной кости на изогнутые щипцы и отрезать бедренную кость от нижней части кости с помощью вскрытия хирургических ножниц.
- Поместите бедренную княженку в холодный 1x PBS.
- Пробить отверстие в 0,5 мл микроцентрифуговой трубки с 18 G иглы.
- Поместите обе голени и бедренной кости в тот же 0,5 мл микроцентрифуговой трубки с открытым концом костей, обращенных вниз к отверстию.
- Поместите трубку 0,5 мл, содержащую как голени и бедренной кости, в микроцентрифугную трубку 1,7 мл.
- Вращайте двухслойные трубки, содержащие как голени, так и бедренную кишну при 5510 х г на 30 с в микроцентрифуге.
- Убедитесь, что БМ извлекается из костей и гранулирует в нижней части трубки. Подготовьте трубку 0,5 мл, содержащую священные кости. Мышь BM готова к следующим шагам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Человек БМ собирают на клинических ресурсах, как ранее описано11.
2. Пятно БМ клетки для CyTOF
- Resuspend БМ в 1 мл 1x Красная кровяная клетка (РБК) лиза буфера. Для человека БМ, resuspend весь БМ в 10-х объем1x Красная кровяная клетка (РБК) лиза буфера. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре (RT).
- Спин трубки на 350 х г в течение 5 мин при 4 c. Для человека БМ, повторить шаг 2.1 и 2.2, прежде чем приступить к шагу 2.3.
- Тщательно аспирируйте супернатант и оставьте гранулы ненарушенными. Отрежь гранулы с 1 мл холодного 1x PBS. Фильтр гранулы в 15 мл конической трубки через 70 мкм ячейки ситечко. Клетки BM теперь вполне изолированы в пробку от твердых частиц мышцы и косточки. Вымойте клетки, добавив 9 мл холодного 1x PBS в трубку.
- Спин 15 мл трубки на 350 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
- Тщательно аспирируйте супернатант и resuspend клетки BM с 10 мл холодной PBS. Возьмите аликвот клеток для подсчета. Подсчитайте клетки с помощью гемоситометра.
- Aliquot 5 x 106 БМ-клеток в новую трубку 15 мл для окрашивания CyTOF.
- Спин 15 мл трубки aliquot на 350 х г в течение 5 мин при 4 c.
- Тщательно аспирируйте супернатант и повторно езмите бМ-клетки с 125 нм цисплатин в 1 мл CyTOF окрашивания буфера в качестве индикатора жизнеспособности для образца. Инкубировать в течение 5 мин на RT.
- После инкубации добавьте 4 мл буфера окрашивания CyTOF в трубку. Спин трубки на 350 х г в течение 5 мин при 4 c. Для человека БМ, добавить 10% человека AB сыворотки в CyTOF окрашивая буфер.
- Тщательно аспирируйте супернатант и повторно ездовые клетки БМ с 50 ЗЛ Fc Receptor блокируя решение. Инкубировать в течение 10 мин при 4 градусах По Цельсию. Пропустить этот шаг для человека БМ.
- Добавьте 50 зл домашних антител CyTOF5 к образцу, так что общий объем окрашивания составляет 100 л. Аккуратно пипетка для смешивания. Инкубировать в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия. Окончательный объем коктейля антитела составляет 100 л как для мыши БМ, так и для образцов БМ человека.
- Добавьте 2 мл буфера окрашивания CyTOF к каждой трубке после инкубации, чтобы вымыть клетки, вращайте трубку при 350 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
- Повторите шаг 2.12 для в общей сложности двух стир.
- Приготовьте свежий раствор формальдегида 1,6% из 16% бульонного ампулы. Разбавить 1 часть бульона формальдегидом с 9 частями 1x PBS.
- Тщательно аспирируйте супернатант и resuspend гранулы с 1 мл свежий 1,6% FA раствор. Инкубировать в течение 15 минут на RT.
- Спин трубки на 800 х г в течение 5 мин при 4 c.
- Тщательно аспирируйте супернатант и resuspend клеточной гранулы с 125 нм интеркалации раствора в 1 мл исправить / пермский буфер.
- Инкубировать образец в растворе интеркалации на ночь при 4 градусах Цельсия.
3. Подготовка ячеек для приобретения CyTOF
- Аккуратно вихревые и спиновые клетки при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
- Вымойте клетки, добавив 2 мл буфера окрашивания CyTOF, спиновые клетки на 800 х г в течение 5 минут при 4 кв с и удалить супернатант с помощью аспирации.
- Resuspend клетки в 1 мл diH2O. Зарезервируйте небольшой объем (примерно 10 л) из каждой трубки для подсчета клеток.
- Спиновые клетки при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
- Повторите шаг 3.3 и 3.4.
- Тщательно аспирируйте супернатант и оставьте клетки в гранулах. Клетки БМ теперь готовы к повторной приостановке до концентрации 1 х 106 ячеек/мл для приобретения CyTOF.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1 представлен в качестве примера экспериментов CyTOF. На этом участке tSNE клетки через несколько тканей мыши были сгруппированы в подмножества на основе сходства их профилей выражения поверхности маркера, измеренных 33-параметрной панелью CyTOF. Клетки с более похожими свойствами были автоматически сгруппированы вместе, такие как нейтрофилы, макрофаги или DCs на основе выражения 33 маркеров на каждой клетке.
Рисунок 2 предста...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В последние десятилетия цитометрия на основе флуоресценции была использована вкачестве основного метода изучения клеточных линий и неоднородности 1,2,3. Хотя цитометрия потока предоставила многомерные данные, этот метод ограничен выбором параметров и спектральным перекрытием. Чтобы преодолеть слабость цитометрии потока, мы воспользовались CyTOF, который использует изотопы тяжелых металлов вместо фторофоров для обозначения антите...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить ядро Цитометрии Потока LJI за помощь в процедуре массовой цитометрии. Эта работа была поддержана грантами NIH R01HL134236, P01HL136275 и R01CA202987 (все до C.C.H) и ADA7-12-MN-31 (04) (в C.C.H. и Y.P.).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| CyTOF Антитела (мышь) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Клон 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Клон RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (клон MJ7/18)-Очищенный | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Антимышиный CD115 (CSF-1R) (клон AFS98) - очищенный | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Клон 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Клон M17/4)-Очищенный | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Клон M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Клон N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Клон A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (Fcγ RIV) (Клон 9E9)-Очищенный | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Антимышиный CD162 (клон 4RA10 (RUO))-очищенный | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Анти-мышиный CD169 (Siglec-1) (Клон 3D6.112)-Очищенный | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Антимышиный CD182 (CXCR2) (клон SA044G4)-очищенный | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Антимышиный CD183 (клон CXCR3-173) - очищенный | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Анти-мышь CD335 (NKp46) (Клон 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Антимышиный CD34 (клон MEC14.7) - очищенный | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Анти-мышь CD41 (клон MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Анти-Мышь CD43 (Клон S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Анти-Мышь CD48 (Клон HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Анти-мышь CD62L (Клон MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Анти-мышиный CD71 (клон RI7217) - очищенный | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Антимышиный CD90 (клон G7) - очищенный | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse Fcε RIα (Клон MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Антимышиный GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Очищенный | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Клон M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Клон B56 (RUO))-Очищенный | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Антимышиный Ly-6A/E (Sca-1) (Клон D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Антимышиный Ly6B (Клон 7/4)-Очищенный | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Антимышиный Ly-6G (клон 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Очищенный | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Антимышиный TCR&бета; (Клон H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Клон H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Эритроидные клетки (клон TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Антитела Стабилизатор | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Бычий сывороточный альбумин | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Набор буферов для окрашивания транскрипционного фактора | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Четырехэлементные калибровочные бусины | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Фосфат Буферизованный Солевой Раствор | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| Наборы для мечения антител MAXPAR | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Параформальдегид | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Азид | натрияSigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Экспериментальная модель: организм/штаммы | |||
| мышь: C57BL/6J | Лаборатория Джексона | Артикул: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Нормализатор на основе бусин | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten и Хинтон, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
Ссылки
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
- Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
- Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).
- Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386(2018).
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579(2018).
- Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nature Reviews in Immunology. , (2019).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
