Method Article

Изоляция и количественная оценка вируса Зика из нескольких органов в мыши

DOI:

10.3791/59632

⸱

August 15th, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Saint Louis University, 2School of Veterinary Medicine University of California Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать методы, используемые для исследования вирусных заболеваний путем изоляции и количественной оценки вируса Зика, от нескольких органов в мыши после инфекции.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленные методы демонстрируют лабораторные процедуры для изоляции органов от инфицированных вирусом Зика животных и количественную оценку вирусной нагрузки. Целью процедуры является количественная оценка вирусных титрав в периферических и ЦНС областях мыши в разных точках времени после инфекции или в различных экспериментальных условиях для выявления вирусологических и иммунологических факторов, которые регулируют вирусную инфекцию зика. Продемонстрированные процедуры изоляции органов позволяют как формировать фокус-формировать количественную оценку, так и количественную оценку ПЦР вирусных титров. Методы быстрой изоляции органов предназначены для сохранения вируса титра. Вирусная количественная оценка титра путем проведения спомощьи фокус-формирования позволяет быстро оценить пропускную стоимость вируса Зика. Преимуществом фокусобразующего ассса является оценка инфекционного вируса, ограничение этого анализа является потенциалом токсичности органов, уменьшающей предел обнаружения. Вирусная оценка титра сочетается с количественным ПЦР, а с помощью рекомбинантного РНК-копировальный контроль вирусного генома в органе оценивается с низким пределом обнаружения. В целом эти методы обеспечивают точный быстрый метод высокой пропускной связи для анализа вирусных титеров Зика на периферии и ЦНС инфицированных животных вирусом Зика и могут быть применены для оценки вирусных титр в органах животных, инфицированных большинством патогенных микроорганизмов, включая вирус Денге.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус Зика (ЗИКВ) является арбовирус, который принадлежит к семейство flaviviridae, который включает в себя важные нейроинвазивные человеческие патогены, такие как вирус Powassan (POWV), японский вирус энцефалита (JEV), и вирус Западного Нила (WNV)1. После его изоляции и идентификации, периодически поступают сообщения оинфекциях, инфекциях, инфицированных людьми в Африке и Азии 2,3,4,5,и эпидемиях в Центральной и ссылка6). Тем не менее, он не был до недавнего времени, что ЗИКВ считалось причиной тяжелой болезни7. В настоящее время существуют тысячи случаев неврологических заболеваний и врожденных дефектов, связанных с инфекциями ЗИКВ. Быстрое появление ЗИКВ вызвало много вопросов, связанных с: почему наблюдается увеличение тяжести заболевания, какова иммунологическая реакция на инфекцию ЗИКВ и существуют вирусные и/или иммунные опосредованные патологии, связанные с увеличением неврологических проявления и врожденные дефекты. В настоящее время существует спешка, чтобы понять, центральной нервной системы (ЦНС), связанных с болезнью, связанной с ЗИКВ, а также необходимость быстрого тестирования эффективности противовирусных препаратов и вакцин против ЗИКВ. Именно на этом фоне мы разработали методы быстрого анализа титров ЗИКВ как на периферии, так и в ЦНС с использованием анализа фокус-образующих фокусов (FFA) с помощью анализа, формирующего фокусы ,IKV).

Малые модели животных важны для понимания прогрессирования заболевания и для ранней оценки вакцин, терапевтических препаратов и противовирусных препаратов. Мы создали небольшие модели животных для изучения арбовирусной болезни с помощью различных штаммов мыши для моделирования инфекции человека и защиты от вирусных патогенов8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Используя этот предыдущий опыт, мы начали изменять методы, используемые для оценки WNV и денге вирус, связанный флавивирус для оценки ЗИКВ титер в обоих периферических органов, а также ЦНС21,23, 24. Преимущества этих методов по сравнению с другими анализами: 1) что они сочетают в себе способность собирать как периферийные, так и cnS органов для анализа; 2) методы адаптируются для цитометрии потока, для измерения врожденных и адаптивных иммунных реакций, наряду с вирусными титерами на одном животном в том же органе; 3) техника сбора урожая адаптируется для гистологического анализа; 4) FFA зиКВ является быстрым методом высокой пропускной их возможности для анализа вирусного титра; и 5) эти методы могут быть применены для оценки вирусных титр в органах животных, инфицированных большинством патогенов25.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры настоящего исследования соответствуют руководящим принципам, установленным Комитетом по уходу и использованию животных Университета Сент-Луиса. SLU полностью аккредитованАссоциацией Ассоциации по оценке и аккредитации Организации По уходу за животными International (AAALAC).

1. Изоляция органов

ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус не стабилен при комнатной температуре (RT), поэтому количество животных, собранных в одно время, необходимо тщательно спланировать, чтобы сохранить вирусные титры.

  1. Заразить мышей, используя выбранную дозу и маршрут, на основе фенотипа требуется. Для этого протокола, заразить 8-10 недель мужчины и женщины типа I интерферона рецепторов недостаточно (Ifnar1-/-) C57BL/6 мышей.
    1. Анестезия Ifnar1-/- мышей с коктейлем кетамина (90 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Тест педали рефлекс твердого ног щепотку для подтверждения анестезии. Администрирование 1 х 105 фокусобразующих единиц (FFU) ИЗЗИВ в 50 qL подкожно (SC) через подножку.
  2. Подготовьте все материалы, необходимые для сбора урожая накануне: 2 ножница, щипцы и 20 мл 70% этанола (EtOH) в 50 мл конического для дезинфекции инструментов.
    1. Приготовьте шприцы и иглы: шприц 20 мл для перфузии, 23 G иглы (примерно 1 на клетку) и 1 мл шприца с 25 G иглы (1 на 3-5 мыши). Перед взвешиванием труб, добавить стальные бусы (в капоте) до 1,5 мл O-кольцо винт крышки труб (по одному для каждого органа). Трубки должны быть подходящими для гомогенизации.
  3. Подготовьте день сбора урожая материалы, необходимые для перфузии и замораживания органов.
    1. Заполните ведро со льдом с сухим льдом и 70% EtOH, чтобы сделать ледяную ванну. Подготовьте стерильный фосфат буферного соления (PBS), предполагая, что 25-30 мл на мышь PBS для каждой перфузии требуется 5-10 мл для спинного мозга). Получить анестезию, коктейль из кетамина и ксилазина, и принять 300 л на мышь. Поместите все материалы и любые дополнительные трубки, необходимые для цитометрии потока и т.д., во вторичном контейнере для транспортировки на животное объекта.
  4. Соблюдайте все необходимые процедуры для въезда, включая надевание и доффинг личного оборудования защиты во время входа и выхода на животное объекта.
    ПРЕДЕКТО: Все процедуры должны проводиться в сертифицированном шкафу биобезопасности в лаборатории 2-го уровня биобезопасности (BSL-2).
  5. Администрирование анестезии, 200-500 Л, интраперитоневически в зависимости от размера и веса животного. При работе в одиночку, ввести анестезию на одно животное в то время, чтобы избежать убийства животных до сбора органов.
    1. Подтвердите дозу анестезии, щипать ног щипцы с щипцы для оценки педали рефлекс. Не продолжайте, если полностью не отвечает. Используйте булавки для защиты мыши к восковой доске. На данный момент, облить мышь в 70% этанола, чтобы избежать загрязнения волос в процедуре сбора органов
  6. Неизлечимо кровоточит на пункцию сердца.
    1. Используя ножницы и щипцы, откройте животное через грудную полость, чтобы разоблачить сердце. Сбор крови через прокол сердца (800 евро), это может быть использовано для нескольких анализов, включая клиническую химию, гематологию, цитометрию потока для обнаружения специфических реакций антигена, и в реальном времени количественные ПЦР (qRT-PCR) для анализа вирусного номера копии.
    2. Для вирусного анализа РНК qRT-PCR, собирать кровь в трубке EDTA при извлечении из цельной крови или в микроцентрифуговой трубке при извлечении из сыворотки. (Для сыворотки, спин трубки на максимальной скорости в центрифуге, комнатной температуре, в течение 20 минут и удалить сыворотку в отдельную трубку). Добавьте линейный полиакриламид в качестве носителя в образец сыворотки после окончания. РНК может быть проанализирована или сохранена при -80 градусов по Цельсию для дальнейшего процесса на более поздний срок.
  7. Заполните 20 мл шприц с PBS, при комнатной температуре (или 37 градусов по Цельсию), и наполнить мышей, вставив иглу бабочки в левый желудочек. Проколите правое предсердие, чтобы кровь и PBS вышли. Медленно управлять PBS при проверке цвета печени, чтобы подтвердить, что животное полностью проникнуты. Печень должна меняться от темно-красного до розового лосося цвета.
    1. При подготовке органов к гистологии, оставьте бабочку иглу на месте, а затем пронизать 20 мл льда холодно 4% параформальдегида. Если это так, то удобно иметь шприц подключен к 3-путь стоп-кокс с обоими шприцы прилагается к нему, превращая клапан ON и OFF, как один чередует между PBS и PFA.
  8. Урожай органов в помечены, взвешенные трубки. Для периферических органов следуйте установленному порядку сбора урожая: печень, селезенка, почки и легкие.
    1. Возьмите только одну долбу из печени; не имеет значения, какой из них, но для всех экспериментов всегда старайтесь взять одну и ту же кому с одинаковым размером. Аналогичным образом, для почек и легких, принимать те же почки и легкие. Если цитометрия потока также должна быть завершена, любой орган может быть разрезан пополам. Храните половину, которая будет использоваться для цитометрии в Розуэлл Парк Мемориальный институт среднего (RPMI) при комнатной температуре, пока урожай не будет завершен.
    2. Сразу после сбора урожая положите каждый орган в маркированную трубку и поместите в сухую ледяную ванну. Вирус титр уменьшает с течением времени при комнатной температуре, так что количество времени, необходимое для сбора органов является чрезвычайно важным. Между мышами должна быть согласованность, поэтому после безопасности следующим приоритетом является скорость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если сбор органов для вирусных титра, это очень полезно иметь второй индивидуальный урожай мозга в этой точке, чтобы сохранить вирусные титры.
  9. Удалите оставшиеся органы из полости тела мыши, чтобы получить доступ к позвоночнику и черепу.
    1. Снимите мышь с доски и снимите шкуру, после чего снимите руки и ноги.
      Удалите голову мыши с обезглавливание, тупые или хирургические ножницы для сбора мозга, разрезая череп зубчатыми ножницами LaGrange через foramen magnum. Затем снимите череп с щипками и вычерпывайте мозг шпателем.
    2. Используя сильные, притупленные ножницы, удалите ребра и другие кости, окружающие позвоночник. Затем, нарезать тазовой кости, подвергая позвоночных foramen на поясничном уровне. Небольшой кончик спинного мозга должен быть виден в этой точке.
    3. Используйте 10 мл шприц заполнены PBS и 18 G иглы, чтобы изгнать спинного мозга, "промывка" шнур от поясничного отдела до шейного отдела позвоночника над чашкой Петри.
    4. Осторожно, поместите слеженный кончик иглы внутри позвоночных foramen, избегая чрезмерного давления, чтобы предотвратить иглу вторгаясь в тело позвонка. Держите сильно оказывать давление на тело позвонка и иглы и нажмите шприц поршень, чтобы изгнать шнур. Немедленно перенесите спинной мозг в маркированную трубку и поместите в сухую ледяную ванну.
  10. Повторите процедуру со всеми животными до завершения сбора урожая. Поместите инструменты для сбора урожая в 70% этанола между животными. Сосредоточьтесь на согласованности и скорости. Продолжительность между каждым органом урожая должна оставаться последовательной, с тем чтобы не смещение вирусных результатов титра.
  11. После завершения, дезинфицировать биобезопасности шкаф и все материалы до удаления его из животного объекта.
  12. Удалите каждую трубку из ледяной ванны и взвесьте трубки, чтобы определить вес органов. Чтобы определить вес органов, вычесть вес пустой трубки из веса органа, содержащего трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент органы могут быть заморожены при -80 градусов по Цельсию для дальнейшего процесса на более поздний срок или органы могут быть однородны непосредственно перед замораживанием отдельных aliquots. Замораживание оттаивания образцов несколько раз уменьшает вирусный титр. Поэтому важно сделать ту же процедуру для всех экспериментов в рамках одного проекта.

2. Гомогенизация органов

  1. Подготовьте 3 помеченных, 1,5 мл оснастки крышкой трубки для каждого органа, чтобы быть однородным.
  2. Если образцы не гомогенизированы сразу после сбора урожая, удалите трубки от -80 градусов по Цельсию. Образцы не нужно размораживать, чтобы гомогензировать.
  3. Положите образцы на лед, чтобы держать их холодными, чтобы свести к минимуму потерю вирусного титра. Затем добавьте 1 мл холодного DMEM, содержащего 5% FBS к каждому органу, содержащему трубку.
  4. Сразу же бить трубки в бисере загонщик в соответствии с инструкциями производителя. Гомогенизировать все органы со стальными бусинами в бисеро-гомогенизатор инструмент. Проверьте, чтобы убедиться, что каждый орган был полностью однороден.
  5. Спин вниз орган мусора в микрофуге на 12000 х г в течение 5 минут в микрофуге, которая была охлаждена до 8 градусов по Цельсию. Затем верните трубки в ведро со льдом. В шкафу биобезопасности, aliquot образцов в трубки для необходимых анализов. Затем верните трубки в ведро со льдом.
  6. Для фокус-формирования асссе, aliquot 500 Зл в помечены трубки. Затем поместите трубки в стойку на ведро со льдом. Aliquot 50 qL в трубку для РНК для флуорогенных количественных RT-PCR (qRT-PCR) для измерения вирусного числа копий генома.
  7. Изолировать общую РНК из органов инфицированных животных с помощью коммерческого комплекта изоляции РНК. Определить флавивирусвирусной вирусной РНК с помощью грунтового зонда наборы конкретных для ЗИКВ, который признает уникальные последовательности в каждом геноме флавивируса. Определите вирусный номер копии с помощью плазмида контроля копирования, содержащего определенную положительную одноцепочечную РНК, генерируемую в пробирке с использованием полимеразы T7, содержащей целевые последовательности ЗИКВ.
  8. Aliquot оставшийся образец, который составляет примерно 300 qL, в третью трубку и хранить при -80 градусов по Цельсию, если это необходимо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы ранее не были заморожены, заморозьте при -80 градусов по Цельсию. Если образцы были ранее заморожены, продолжайте на фокус формирования асссы и / или РНК изоляции перед остановкой.

3. Вирус Зика Фокус Формирование Ассаи26

ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы включить отсутствие контроля над вирусом и положительный контроль. Положительный контроль представляет собой серию разбавления вирусных запасов с известной концентрацией. Не все элементы управления должны быть на одной пластине, но, как самосазможет становится больше, чем 5 пластин, больше элементов должно быть добавлено, и распространяется между пластинами. Позаботьтесь, чтобы не поцарапать монослой либо с трубчатыми кончиками или энергичной стирки. Несколько органов могут быть тизерсированы в один и тот же день или в разные дни. Но индивидуальный орган не должен быть titered в течение нескольких дней, потому что различные условия ассеев может повлиять на вирусный титр. Настоятельно рекомендуется запустить отдельный орган в один день.

  1. До дня ассоса, подготовить клетки и реагенты, необходимые для фокусформирования асссе.
    1. Подготовьте средства роста, содержащие 500 мл DMEM с 5 мл HEPES и 25 мл FBS. Иметь Vero-Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) клетки растет в среде роста на 37 КС, 5% CO2 до начала ассе. Клетки Веро не должны быть высоким проходом или когда-либо выросли более 100% выпуклость до начала асссе.
    2. Приготовьте 500 мл раствора метилцеллюлозы 2%, автоматизируя 1 л стеклянной бутылки для мультимедиа с 10 г метилцеллюлозы и большой баром для перемешивания и отдельной стеклянной бутылкой для мультимедиа 1 л с 500 мл H2O. Если автоклавная вода охлаждается разогреть в микроволновой печи, пока бутылка не нагревается на ощупь, но не кипит.
    3. Аккуратно налейте теплую/горячую воду в бутылку метилцеллюлозы, находясь в капюшоне культуры тканей. Частично крышка бутылки и перемешать на плите до метилцеллюлозы в растворе (1-4 ч). Aliquot 2% раствор метилцеллюлозы в стерильную коническую трубку 50 мл. 2% метилцеллюлозы могут храниться при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока это необходимо.
    4. Подготовьте 5% раствор параформальдегида в PBS для фиксации пластин и хранится при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока это необходимо. Подготовьте 1x фокус формирования ассса мыть буфер, добавив 0,05% Triton X-100 к PBS и хранится в RT. Подготовьте 1x FFA окрашивания буфера, добавив 1 мг / мл сапонина в PBS и хранится при 4 кК КС до тех пор, пока это необходимо. Они могут быть подготовлены за одну-две недели вперед.
  2. Рассчитайте количество плоских нижних 96 хорошо пластин, необходимых для assay так, что каждый орган покрывается в тройной. Включите достаточное количество дополнительных скважин для позитивного и отрицательного контроля.
    1. Вырастите вверх достаточно клетки Vero в средстве роста для того чтобы завершить асссес конструированный. Трипсинизуйте клетки Веро и подсчитайте их повторной приостановки их на 1,5 х 105 клеток на мл в среде роста. Плита Vero клеток в 96 хорошо плоские нижние пластины на 3,0 х 104 Веро-ВОЗ клетки / хорошо в среде роста, добавив 200 л на хорошо.
    2. Инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию при 5% CO2 ночь, убедитесь, что пластины уровня в инкубаторе, чтобы клетки равномерно распределены в колодец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая лаборатория выращивает клетки Веро немного по-разному; целью является 90-95% слияние монослой в каждой скважине в день проведения асссея на вирус Зика.
  3. Разбавить образцы вируса Зика в день асссея. Если образцы органов были ранее однородны, удалите образцы из морозильной камеры -80 градусов и дайте им разморозиться перед тем, как поместить образцы на лед для проверки.
    1. На льду, подготовить круглое дно 96 хорошо пластины, добавив 180 л холодного роста средств массовой информации к строкам B через H оставляя строку пустой. Добавьте 150 л каждого гомогенизированного образца органа, чтобы погреть А круглой нижней пластины.
    2. Подготовьте серийные 10-кратные разбавления каждого образца, используя многоканальный пипетка. Разбавить образцы в круглой нижней пластине 96 скважины, добавив 20 л образца в 180 л роста носителей, изменяя кончики пипетки между каждым разбавлением.
  4. Подготовьте плиту фокуса формируя путем извлекать носители от плоско-нижней части плиты 96 наилучшим образом покрывая клетки Vero. Сделайте это непосредственно перед добавлением образцов вируса, чтобы предотвратить высыхание монослой.
    1. Добавьте 100 л разбавления вируса к каждой скважине в пластине Веро. Добавьте образец, используя тот же набор подсказок, перейдя от самой низкой к самой высокой концентрации. Каменные пластины из стороны в сторону 2-4 раза будьте осторожны, чтобы не закружить.
    2. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 на 1-2 ч. Убедитесь, что пластины находятся на одном уровне в инкубаторе. Во время инкубации разогрейте 2% метилцеллюлозы на RT.
    3. Разбавить 2% метилцеллюлозы раствор в среде роста. Разбавление должно быть в соотношении примерно 2:1 2% метилцеллюлозы к росту средств массовой информации. Держите в комнате темп, пока не пришло время, чтобы использовать его. Добавьте 1-2 капли/хорошо (установите трубу до 125 л) метилцеллюлозы: средства роста к каждой скважине из 96 хорошо пластины.
    4. Инкубировать 32-40 ч при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. Поскольку все клетки Веро растут немного по-разному, и факторы, включая клеточную сложение и штамм вируса Зика, могут изменить время инкубации.
  5. Зафиксировать клетки Веро, используя подготовленный 5% раствор параформальдегида.
    1. Добавьте 50 кл. 5% параформальдегида к каждому хорошо поверх слоя метилцеллюлозы в шкафу биобезопасности. Инкубировать в течение 60 минут на RT. Фиксация может пойти на ночь при 4 градусах По Цельсию, но покрыть пластину парафильмом, чтобы уменьшить испарение.
    2. Свалка наложения и средств массовой информации от клеток в контейнер для удаления внутри шкафа биобезопасности. Вымойте осторожно с PBS, 150 л/хорошо. Снимите PBS с пластин и снимите пластину с BSL-2.
    3. Повторите PBS мыть 2x добавив 150 Лл / хорошо. Затем удалите PBS. Добавьте 150 л/хорошо 1x буфер промывки FFA и дайте сидеть в течение 5-10 минут на RT, чтобы проницать фиксированные клетки.
  6. Обнаружить инфекцию с помощью первичных антител Зика. Подготовьте первичное антитело 4G2 (D1-4G2-4-15) в концентрации 1 мг/мл в буфере окрашивания FFA. Приготовьте достаточно ели для всего асссея.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держитесь подальше от лабораторных подгузников или других высоко-ворсасованный абсорбциентный материал, как волокна негативно повлияет на визуализацию очагов.
    1. Удалите буфер промыть FFA с пластин. Добавьте 50 л/хорошо первичных антител в буфере окрашивания FFA. Печать пластин с parafilm и инкубировать на ночь при 4 градусах по Цельсию на качалке платформы. Ассес можно сделать с инкубации для 2 ч на RT.
  7. Визуализируйте инфекцию путем добавления вторичного спряженого антитела HRP. Подготовьте вторичное анти-мышь Козы HRP-маркированные антитела на концентрации 1:5,000 в буфере окрашивания FFA. Приготовьте достаточно ели для всего асссея.
    1. Вымойте клетки 3x с буфером промыть FFA, удалив буфер стирки, щелкнув в раковину каждый раз. Пятно клеток со вторичными антителами в БУФЕРе окрашивания FFA на 50 Л/хорошо. Инкубировать 1-2 ч на RT.
    2. Вымойте клетки 3x с буфером промыть FFA, удалив буфер стирки, щелкнув в раковину каждый раз. Добавьте 50 л/колодец субстрата Trueblue.
    3. Внимательно следите за пластинами, ожидая 2-15 мин, пока пятна не будут полностью определены и минимальный фон. После того, как пятна видны, мыть осторожно с водой, используя руку, чтобы оградить монослой от силы воды работает. Нажмите сухой на бумажные полотенца (НЕ DIAPERS) и изображение как можно скорее.
    4. Пятна можно пересчитать вручную или с помощью автоматизированного счетчика точек. При подсчете вручную, расчленение сферы может быть использовано для оказания помощи в визуализации.
    5. Для каждого образца выберите разбавление с легко отличительной точки зрения (например, от 20 до 200 на скважину) и вычислите титр в фокус-образующих единицах на мл (FFU/ml), используя среднее значение дубликатов скважин: FFU/mL (средний foci/well) и (фактор разбавления) (mL inoculum).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для оценки титеров ЗИКВ с помощью протокола, описанного выше Ifnar1-/- мыши были инфицированы ЗИКВ (PRVABC59) с помощью подкожной (SC) инъекции в подножку. Здесь, администрация 1 х 105 FFU из ЗИКВ до 8-12 недель Ifnar1-/- мышей SC не является смертельным, но вирус может реплицироваться как на периферии и ЦНС. Эта доза и маршрут используются для изучения иммунных реакций принимающего патогена и патогенности. Администрация 1 х 105

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инфекция ЗИКВ может вызвать неврологическое заболевание, поэтому нынешние модели животных для изучения патогенеза, иммунных реакций и защитной эффективности вакцин и противовирусных препаратов должны сосредоточиться на вирусном контроле в рамках ЦНС. Одна из проблем в фокусировке на болезни ЦНС является то, что он часто происходит за счет изучения периферической инфекции. Предложенные здесь методы изоляции органов сосредоточены на необходимости быстрой оценки инфекции ЗИКВ как на периферии, так и в ЦНС для оценки связанн...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Д-р Пинто финансируется за счет семенного гранта от Университета Сент-Луиса школы медицины и запуска средств из Университета Сент-Луиса школы медицины. Д-р Бриен финансируется K22AI104794 раннего следователя награду от NIH NIAID, а также семян грант от школы Университета Сент-Луиса. Для всех финансируемых лиц спонсоры не имели никакой роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-бром-3-хлорпропан (BCP)MRC генBP151
10 мл шприцThermo Fisher ScientificBD 309642
18 г иглаThermo Fisher Scientific22-557-145
1 мл TB шприцThermo Fisher Scientific14-823-16H
20 мл шприцThermo Fisher Scientific05-561-66
24-трубная бисерная мельницаThermo Fisher Scientific15 340 163
3,2 мм нержавеющая стальThermo Fisher ScientificNC9084634
37 ° C Инкубатор для культуры тканейNuair5800
4G2 антителав доме
96 луночных плоских донных пластинMidsciTP92696
96 луночных круглодонных пластинMidsciTP92697
Basix 1,5 мл пробирки eppendorfThermo Fisher Scientific02-682-002
Концентрированные бактерицидные отбеливатели30966CT
CTL S6 АнализаторCTLCTL S6 Универсальный анализатор
Изогнутые ножницы для резкиFine Science Tools14061-11
Dulbecco s Модифицированный Eagle' s Средний - высокий уровень глюкозы С 4,500 мг/лглюкозы MilliporeSigmaD5671
Этанол (класс молекулярной биологии)MilliporeSigmae7023
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаMilliporeSigmaF0926-500ML
ЩипцыИнструменты для тонкой науки11036-20
Ледяная уксусная кислотаMilliporeSigma537020
Коза антимышиное HRP-меченое антителоMilliporeSigma8924
HEPES 1 MMilliporeSigmaH3537-100ML
Изопропанол (класс молекулярной биологии)MilliporeSigmaI9516
Коктейль кетамина/ксилазинаСравнительная медицина
L-глутаминMilliporeSigmag7513
Magmax RNA набор для очисткиThermo Fisher ScientificAM1830
МетилцеллюлозаMilliporeSigmaM0512
МикроцентрифугаEpendorf5424R
MiniCollect 0,5 мл пробирки ЭДТАBio-one450480
Уплотнительное кольцо пробиркиThermo Fisher Scientific21-403-195
Одноступенчатая смесь для ОТ-ПЦРThermo Fisher Научный4392938
ПараформальдегидThermo Fisher ScientificEMS- 15713-S
Фосфат буферизованный физиологический растворMilliporeSigmad8537-500ml
Многоканальные пипеткиProline Sartorius72230/72240
Одноканальные пипетки ProlineSartorius728230
РНКаза свободной водыThermo Fisher Scientific10-977-023
RNAzol BDMRC geneRB192
Rocking PlatformThermo Fisher Scientific11-676-333
RPMI 1640FisherMT10040CV
СапонинMilliporeSigmas7900
Ложка/шпательFine Science Tools10090-17
Straight ножницы для резкиFine Science Tools14060-11
Triton X-100MilliporeSigmat8787
True Blue SubstrateVWR95059-168
ТрипсинMilliporeSigmaT3924-100ML

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
  2. Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
  3. Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
  4. McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
  5. Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
  6. Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
  7. Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
  8. Brien, J. D. Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , Oregon Health & Science University. (2007).
  9. Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
  10. Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
  11. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  12. Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823(2010).
  13. Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230(2011).
  14. Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407(2011).
  15. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
  16. Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
  17. Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343(2013).
  18. Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
  19. Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
  20. Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086(2014).
  21. Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
  22. Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
  23. Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237(2018).
  24. Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086(2014).
  25. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
  26. Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237(2018).
  27. Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
  28. Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zika Virus IsolationViral Titer QuantificationFocus Forming AssayQuantitative PCROrgan HarvestingSpinal Cord ExtractionViral Load AnalysisMouse Infection ModelFlavivirus DetectionViral Pathogenesis

Related Articles