Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка опухолевой микросреды метастазов Doorway-Mediated Сосудистая проницаемость, связанная с распространением раковых клеток с помощью интравитального изображения и фиксированного анализа тканей

8.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59633

⸱

26 июня 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology, Montefiore Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем два метода оценки преходящей сосудистой проницаемости, связанной с микроокружением опухоли метастазов (TMEM) функции дверного проема и интравацией раковых клеток с использованием внутривенной инъекции высокомолекулярного веса (155 кДа) декентна у мышей. Методы включают интравитальная визуализация у живых животных и анализ фиксированной ткани с использованием иммунофлюоресценции.

Аннотация

Наиболее распространенной причиной смертности, связанной с раком, является метастаз, процесс, который требует распространения раковых клеток от первичной опухоли до вторичных участков. Недавно мы установили, что распространение раковых клеток в первичном раке молочной железы и в метастатических участках в легких происходит только в дверях называется Опухолевая микроокружающая среда метастазов (TMEM). Номер дверного проема TMEM является прогностичным для отдаленного рецидива метастатических заболеваний у больных раком молочной железы. TMEM дверные проемы состоят из раковой клетки, которая чрезмерно выражает актин регуляторного белка Mena в прямом контакте с периваскулярным, проангиогенным макрофагом, который выражает высокий уровень TIE2 и VEGF, где обе эти клетки плотно связаны с кровью сосуд эндотелиальной клетки. Раковые клетки могут интравироваться через дверные проемы TMEM из-за преходящей сосудистой проницаемости, организованной совместной деятельностью ассоциированного макрофага TMEM и тМЭм-ассоциированной раковой клетки Mena. В этой рукописи мы описываем два метода оценки преходящей проницаемости ТМЭм: интравитальная визуализация и иммунофлуоресценция фиксированной ткани. Хотя оба метода имеют свои преимущества и недостатки, объединение этих двух методов может обеспечить наиболее полный анализ проницаемости сосудов, опосредованных ТМЭМ, а также микроэкологических предпосылок для функции ТМЭм. Поскольку метастатический процесс при раке молочной железы, и, возможно, другие виды рака, включает в себя распространение раковых клеток через tMEM дверные проемы, важно использовать хорошо зарекомендовавшие себя методы для анализа TMEM дверной проем деятельности. Два описанных здесь метода обеспечивают комплексный подход к анализу активности дверных проемов TMEM, как у наивных, так и в фармакологически обработанных животных, что имеет первостепенное значение для доклинических испытаний агентов, предотвращающих раковые клетки распространения через TMEM.

Введение

Недавние достижения в нашем понимании метастазов рака обнаружили, что эпителиальный переход к мезенхимальному переходу (ЭМТ) и индукции мигрирующих/инвазивных субпопуляций раковых клеток сами по себе не являются достаточными для распространения гематогенов 1. Действительно, ранее считалось, что метастазирующие раковые клетки интравируются через всю всю вызванное раком эндотелия, так как неваскулярность опухоли часто характеризуется низким охватом перицитов, и как таковой, очень проницаема и нестабильный2,3,4. Хотя очень наводящий дефектных функций в опухоли, сосудистые изменения во время канцерогенеза не дают доказательств как таковых, что опухолевые клетки могут проникать кровеносные сосуды легко и неконтролируемым образом. Исследования интражизненной визуализации (IVI), в которых опухолевые клетки флуоресцентно помечены и сосуды помечены через внутривенную инъекцию флуоресцентных зондов (таких как декренилий или квантовые точки), показывают, что, в то время как опухолевые сосуды равномерно проницаемый до низкого молекулярного веса декстранс (например, 70 кД), высокомолекулярный вес декстранс (155 кД) и опухолевые клетки могут пересекать эндотелий только на специализированных участках интравазации, которые преимущественно расположены в сосудистой точке5, 6 , 7. Иммуногистохимический (IHC) анализы с использованием моделей животных и человеческого человека, полученных материал омичи показали, что эти сайты являются "дверные проемы", которые специализируются на регулировании проницаемости сосудов, локально и преходяще, обеспечивая краткое окно возможность для мигрирующих/инвазивных раковых клеток для входа в кровообращение. Эти дверные проемы называются "Tumor Microenvironment of Metastasis" или "TMEM", и, вполне ожидаемо, их плотность коррелирует с повышенным риском развития метастатического заболевания у больных раком молочной железы8,9, 10.

Каждый дверной проем TMEM состоит из трех различных типов клеток: периваскулярный макрофаг, опухолевые клетки, чрезмерно выражающие актин-регуляторный белок млекопитающих включен (Mena), и эндотелиальной клетки, все в прямом физическом контакте друг с другом1, 5,9,10,11,12,13. Ключевым событием для функции TMEM как внутривазивного дверного проема является локализованное высвобождение сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) на основной сосуд периваскулярным макрофагом14. VEGF может нарушить гомотипические соединения между эндотелиальными клетками15,16,17,18,19, явление, которое приводит к переходной утечки сосудов, также известный как "взрыв" проницаемость, как описано в исследованиях IVI 5. TMEM макрофаги были показаны, чтобы выразить рецептор тирозинкиназы TIE2, который необходим для VEGF-опосредованной функции TMEM и самонаведения этих макрофагов в периваскулярной нише5,20,21 , 22. В дополнение к регулированию распространения раковых клеток и метастазов, TIE2и макрофаги, как было показано, центральные регуляторы опухолевого ангиогенеза21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Таким образом, макрофаги TIE2и представляют собой критический компонент микроокружения опухоли и основной регулятор метастатического каскада.

Для лучшей концептуализации TMEM-опосредованной сосудистой проницаемости (т.е. "взрыв"), очень важно отличить его от других способов проницаемости сосудов, которые не связаны с роспуском эндотелиальных клеточных соединений. В нетронутом эндотелии (тот, чьи тесные и адепты не нарушены), есть три основных типа проницаемости сосудов: а) пиноцитоз, который может или не может быть связан с трансцитозом проглоченного материала; b) транспортировка материала через эндотелиальную фенестру; и с) транспортировка материала по параклеточному пути, который регулируется эндотелиальными узкими соединениями15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. Хотя дерегулированы во многих опухолей, вышеупомянутые способы проницаемости сосудов были описаны в основном в контексте нормальной физиологии тканей и гомеостаза, крайности которых являются ткани с ограниченной проницаемостью ( например, гематоэнцефалический барьер, гематоэнцефалический барьер), или обильная проницаемость (например, фенестрированные капилляры почечного гломерулярного аппарата)34,35,36,37.

Используя мультифотонную интравитальная визуализацию и мультиплексированную иммунофлуоресценционную микроскопию, мы можем различать проницаемость сосудов tMEM ("взрыв") и другие способы проницаемости сосудов при опухолях молочной железы. Для этого мы выполняем одну внутривенную инъекцию высокомолекулярного веса, флуоресцентно маркированного зонда у мышей. Спонтанное взрывное время событий может быть захвачено с помощью интравитентной визуализации у живых мышей; или, в качестве альтернативы, экстравазивание зонда может быть количественно путем совместного исследования локализации с сосудами крови (например, CD31 или Эндомуцин)и TMEM дверные проемы с использованием иммунофлюоресценции микроскопии. Представленные здесь протоколы описывают оба этих метода, которые могут использоваться либо самостоятельно, либо в сочетании друг с другом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты с использованием живых животных должны проводиться в соответствии с руководящими принципами и правилами в отношении использования животных и ухода за животными. Процедуры, описанные в данном исследовании, были проведены в соответствии с национальными правилами здравоохранения, касающимися ухода и использования экспериментальных животных, а также с одобрения Медицинского колледжа и использования животных Колледжа Альберта Эйнштейна (IACUC).

1. Оценка "взрывной проницаемости" с использованием изображений живых животных

  1. Трансплантация сингенных опухолей молочной железы в хосты мыши с флуоресцентными макрофагами
    1. Генерировать кусочки опухолевой ткани, пригодные для трансплантации.
      1. Создание флуоресцентно помеченных опухолей в моделях рака молочной мыши мыши, пересекая спонтанной, аутохтонической, генетически инженерии мыши молочной модели MMTV-PyMT мышей с трансгенными мышами, выражающими флуоресцентные репортеры38, 39 (например, улучшенный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), улучшенный циановый флуоресцентный белок (ECFP), или Dendra2.
      2. Разрешить mMTV-PyMT мышей с флуоресцентно помечены опухоли расти до размера не более 2 см (примерно 10-12 недель).
      3. Эвтаназия опухоли подшипника MMTV-PyMT мышей, поместив их в камеру с 5% изофлуран до 30 секунд после того, как все дыхание остановить.
      4. Выполните вывих шейки матки.
      5. Удалить волосы из живота эвтаназии мыши с помощью актуальных депиляционных крем.
      6. Поместите чашку Петри с средой культуры клеток DMEM/F12 на льду.
      7. Поместите мышь и чашку Петри на лед в капот дыма.
      8. Обезвитрить живот мыши с 70% этилового спирта.
      9. Использование стерильных перчаток и хирургических инструментов (стерилизованные ножницы, щипцы и лезвие) удалить опухоли и поместить их в чашку Петри.
      10. Разрежьте опухоль на мелкие кусочки (2 мм х 2 мм х 2 мм в размерах), отбрасывая любые некротические части, в то время как они находятся в чашке Петри.
    2. Перегрузите опухолевые кусочки в принимающие реципиенты.
      1. Поднимите мышей с генетически модифицированными флуоресцентно маркированными макрофагами, например, MacGreen40 или MacBlue 41 мышами (Csf1r -GAL4VP16/UAS-ECFP)
      2. Разрешить FVB мышей с флуоресцентно помечены макрофаги расти до возраста 4-6 недель).
      3. Анестезия FVB мышей с флуоресцентно помечены макрофаги в камере с использованием 5% изофлуран с кислородом в качестве носителя газа.
      4. Уменьшить анестезию до 3% изофлуран и применять офтальмологические мази для глаз мыши, чтобы предотвратить сушки.
      5. Удалите волосы из более чем4-й молочной железы мыши.
      6. Очистите кожу бетадином. Важно поддерживать стерильные условия на протяжении всей процедуры. Это включает в себя использование стерилизованных инструментов и реагентов.
      7. Сделайте небольшой разрез на 2-3 мм, просто уступая4-й сосок.
      8. Вскрыть до тех пор, пока молочный жир подушечка подвергается.
      9. Возьмите кусок опухоли из чашки Петри и пальто в искусственной внеклеточной матрицы.
      10. Трансплантация опухолей под4-й молочной жировой площадки.
      11. Закройте разрез с помощью цианоакрилата клея.
      12. Постоянно следите за животным до полного выздоровления и способен поддерживать строгое затишье. Также не возвращать животное в компанию других животных до полного выздоровления.
      13. Чтобы свести к минимуму инфекции, добавьте 1 мл 100 мг/мл антибиотика энрофлоксацина в бутылку питьевой воды животного (8 fl oz).
      14. Разрешить опухоли расти до ощутимого (5 мм; 4 недели).
      15. В зависимости от эксперимента, выделить мышей в группы лечения, и выполнить соответствующие методы лечения, если это применимо.
  2. Настройка для интравитальной визуализации
    1. Включите двухфотонный лазер микроскопа и детекторы.
    2. Включите нагревательную коробку и предварительно разогрейте стадию x-y микроскопа.
    3. Поместите на заказ этапвую вставку42 в стадию x-y.
  3. Приготовление окна изображения
    1. Перед настройкой для визуализации, автоклав на заказ круговой каркас окна изображения42.
    2. Используйте пипетку или инсулиновый шприц, чтобы поместить тонкий слой клея цианоакрилата к оконной раме и прикрепить на месте 8 мм круглого стекла крышки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Важно, чтобы избежать получения остатков на ясной диафрагмы крышки стекла. 2) Важно придерживаться крышки стекла к оконной раме по крайней мере 1 ч перед использованием для визуализации.
    3. Тщательно протрите очистить любой избыток цианоакрилата на прозрачной диафрагме крышки стекла с помощью лабораторной протрите смачивают с небольшим количеством ацетона.
  4. Приготовление катетера хвостовой вены для введения жидкостей и флуоресцентных красителей во время визуализации
    1. Вырезать 30 см кусок полиэтиленовой трубки, чтобы построить катетер хвостовой вены.
    2. Отсоедините иглу часть иглы 30 G от его Luer конус, мягко согнув иглу вперед и назад, пока он не ломается.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Игла должна быть проведена близко к Luer конус, а не кончик иглы. Это может быть выполнено с плоскогубцами или щипцами, чтобы схватить иглу для того, чтобы предотвратить травму иглы палкой.
    3. Вставьте тупой конец иглы в один конец полиэтиленовой трубки.
    4. Вставьте острый конец еще 30 G иглы, сохраняя его Luer конус прилагается, на противоположном конце трубки.
    5. Заполните 1 см шприц с фосфатами буферизированного сольника, прикрепите его к Luer конус собранного катетера, и промыть катетер хвостовой вены убедившись, что Есть нет пузырьков воздуха в системе.
    6. Для сосудистой маркировки заполните 1 см шприц 1 см 100 л 10 мг/кг 155 кДа dextran-тетраметилродамин (TMR) или квантовыми точками.
  5. Подготовка мыши для визуализации
    1. Анестезия мыши в клетке под (No 1 фут ниже) тепловой лампы с использованием 4%-5% изофлуран смешивается со 100% кислорода установить на поток 1,5-2 л на мин.
    2. Включите тепловую лампу над хирургической рабочей зоной. Этот шаг имеет решающее значение для поддержания основной физиологичной температуры тела мыши во время операции.
    3. Поместите мышь под тепловую лампу и опустите анестезию до 2%-3% на время операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте держать тепловую лампу на безопасном расстоянии (1 фут) от мыши, чтобы избежать перегрева.
    4. Поместите офтальмологическую мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить высыхание глаз и слепоту.
    5. Проверьте, что мышь обезвлеживается, выполняя тест на нос.-пинч. Если животное уходит, увеличьте дозировку изофлуран на 1% и повторно проверьте через 1-2 мин.
    6. Вставьте катетер хвостовой вены в самую дистальную точку на хвосте.
    7. Прикрепите катетер хвостовой вены к хвосту небольшим кусочком лабораторной ленты, которая обматывает сядки вокруг хвоста и прилипает к игле, чтобы убедиться, что она не выбита.
    8. Вводят 50 л л на ч PBS через катетер хвостовой вены, чтобы обеспечить адекватное увлажнение. Очень важно, чтобы избежать инъекций слишком много жидкости (не более 200 л на ч) или любые пузырьки в катетер, поскольку это может быть фатальным для мыши.
    9. Удалите волосы на животе на4-й и5-й молочные железы с помощью крема для депилатории.
    10. Очистите кожу бетадином и дайте коже высохнуть.
    11. Сделайте продольное разрез средней линии, начиная сразу же превосходит половых органов и нести разрез до уровня высшего аспект4-й молочной железы.
    12. Носите разрез поперечный к начальнику аспекту4-й молочной железы. Очень важно, чтобы избежать ущерба для кровоснабжения в этой точке.
    13. Вскрыть молочный жир площадку от peritoneum создания ткани лоскут с помощью стерильных щипцы и ножницы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кожа лоскут изображения восприимчива к значительным артефактов движения и обезвоживания тканей. Эти избежать, как описано ранее43,44, путем прикрепления жесткой кусок резины позади кожи стороне лоскута (для ужесточения мягких тканей и изолировать его от остальной части тела), а затем размещение опухоли в мелкой визуализации окно для сохранения гидратации. Это имеет решающее значение для стабильной визуализации, как опухоль и окружающие ткани в этой обстановке очень совместимы.
    14. Стабилизировать лоскут кожи путем крепления (с клеем цианоакрилата) небольшой кусочек жесткой резины размером 2 см х 2 см к стороне кожи лоскута. Опухоль должна быть в центре области стабилизируется резиной.
    15. Держите подвергаются ткани гидратированных с каплями PBS.
    16. Нанесите небольшую пленку цианоакрилата на внешний край специально сделанной кадровой рамы для окна изображения.
    17. Нанесите небольшую капельку PBS (10-20 л) на центр крышки стекла.
    18. Высушите окружающую ткань лоскута лабораторной салфеткой. Очень важно, чтобы убедиться, что цианоакрилат на оконной раме не вступает в контакт с PBS на стекле, так как это может привести к цианоакрилат полимеризации и установить преждевременно.
    19. Прикрепите небольшое окно изображения к лоскуту ткани с опухолью в центре ясной диафрагмы.
    20. Снимите нагревательную коробку со сцены.
    21. Перенесите анестезирующую мышь и катетер хвостовой вены на стадию микроскопа. Используйте крайнюю осторожность, чтобы убедиться, что катетер хвостовой вены не выпадает.
    22. Поместите мышь на сцену в положении склонного.
    23. Поместите носовой конус изофлюрани над мордой, чтобы обеспечить поддержание анестезии.
    24. Вставьте окно в отверстие на пользовательской пластине X-y.
    25. Поместите нагревательную коробку обратно на сцену для поддержания физиологической температуры.
    26. Мониторинг жизненно важных признаков животного путем присоединения пульс оксиметр зонд через датчик клипа к задней лапе.
    27. Медленно уменьшить изофларан до 0,5%-1% для поддержания адекватного кровотока и избежать более анестезии мыши.
  6. Интравитальная визуализация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение мы описываем в этом разделе была выполнена на специально построенном двухлазерный мультифотоновый микроскоп, который был ранее описан5,39,45. Короче говоря, фемтосекундный лазер используется для генерации 90 фемтосекундный импульсный лазерный свет по центру на 880 нм. Флуоресценция света обнаруживается с тремя из четырех одновременно приобретающих детекторов (Синий No 447/60, Зеленый 520/65, и красный 580/60; центральная длина волны / пропускная способность) после отделения от возбуждающего света на дихротический (Chroma, 720DCXXR). Подставку микроскопа содержит объектив объективного объектива 25x, 1.05 NA (числовая диафрагма) с длинным рабочим расстоянием (2 мм). Важно отметить, что, хотя мы использовали специально созданный микроскоп, протокол, описанный ниже, может быть выполнен на любом коммерчески доступном мультифотонном микроскопе.
    1. Поместите каплю дистиллированной воды между 25x, 1,05 NA микроскоп цели и крышка окна стекла, чтобы оптический контакт.
    2. Используйте микроскоп окуляр, чтобы сосредоточиться на областях с флуоресцентными опухолевыми клетками рядом с поверхностью окна.
    3. Найти протекающих кровеносных сосудов и помечены макрофагов. Очень важно иметь протекающие кровеносные сосуды для оценки динамики сосудов.
    4. Переключите микроскоп в мультифотонный режим.
    5. Установите верхние и нижние пределы z-серии, которая измеряет приблизительно 50 мкм.
      1. Установите верхний предел z-серии, используя регулятор фокусировки для перемещения цели в нужное место начала, в наиболее поверхностном положении, и маркировка этой позиции как нулевая в программном обеспечении, нажав на кнопку «Положение Сверху».
      2. Установите нижний предел z-серии, перемещая цель к самому глубокому слою (обычно 50-70 мкм сверху для небольших опухолей) и нажимайте кнопку «Положение Нижний».
      3. Установите размер z-шага до 5 мкм.
    6. Нажмите кнопку Time-Lapse панели и установить временной интервал между приобретениями, по крайней мере 10 с, чтобы обеспечить достаточное время для пополнения воды над объективом цели. Это делается вручную с помощью пипетки на цель в течение длительного промежуток времени.
    7. Удалите шприц с PBS в катетере хвостовой вены и замените его другим шприцем, содержащим 155 kDa dextran-TMR (тетраметил родамин).
    8. Вводят 100 л из 155 kDa dextran-TMR через катетер хвостовой вены.
    9. После инъекции замените шприц ПМР шприцем на шприц PBS.
    10. Приобретите изображения замедленного промежутки z-stack, нажав на кнопки «Стек» и «Время-Lapse», а затем нажмем на кнопку записи.
    11. Вводят 50 л PBS каждые 30-45 мин для поддержания адекватной гидратации животного. Избегайте инъекций более 200 л во время, так как это может привести к перегрузке жидкости.
  7. Эвтаназии
    1. Увеличьте изолюран до 5% и держите животное под 5% изолюраном с носовым конусом на месте до 30 s после прекращения дыхания.
    2. Удалите мышь со сцены.
    3. Выполните вывих шейки матки.
  8. Обработка изображений
    1. Загрузите все изображения в ImageJ и отформатируйте их в 5-мерный гиперстек (x, y, z, t и цветной канал).
    2. Выполните разделение спектрального перекрытия (т.е.: GFP и CFP) и устранение дрейфа x-y от гиперстеков с помощью установленных методов38.
    3. Используйте регулировку яркости и контрастности для увеличения белого уровня канала крови, чтобы фоновый сигнал стал видимым.
    4. Для каждого z ломтик, тщательно проверять каждый фильм на наличие признаков переходной утечки сосудов ("взрыв"). Запуск фильмов с быстрой частотой кадров (40 кадров в секунду) может помочь этой идентификации.
    5. После того, как всплеск был определен, вернуть яркость для этого канала на нормальный уровень и обрезать гиперстек в этом регионе и z-ломтик.

2. Оценка внесосудистого экстран с использованием анализа фиксированной ткани

  1. Подготовка опухоли и образца
    ПРИМЕЧАНИЕ:2-й части этого протокола предполагает, что опухоли молочной железы были собраны из ортотопической трансплантации мыши модель рака молочной железы (т.е. MMTV-PyMT). Эта модель может быть такой же, как описанная в1-й части протокола, хотя флуоресцентно помеченные опухоли не являются необходимыми на данный момент.
    1. После прекращения экспериментального трубопровода (т.е. медикаментозного лечения и т.д.), выполнить хвостовую инъекцию 100 л 10 мг/мЛ 155 кДа dextran-tetramethyl родамин, 1 ч, прежде чем жертвовать мышей.
    2. Пожертвуйте мышами и собирайте урожай опухолей молочной железы.
    3. Исправить опухоли в 10% формалин для 48-72 ч и приступить к парафинам встраивания.
    4. Используя микротом, вырезать два 5 мкм толщиной последовательных слайдов из формалина фиксированной парафин-встроенных (FFPE) тканей. Один слайд используется для окрашивания декекрена, в то время как другой будет использоваться для выполнения TMEM тройной IHC, для справки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол TMEM тройной иммуногистохимии был описан в другом месте 10.
  2. ЕСЛИ окрашивание и сканирование для первого из двух последовательных секций
    1. Отправить слайды в стандартный протокол депарфинизации. Это включает в себя два последующих погружения в ксилен (10 мин каждый), а затем обезвоживание в последовательно разбавленных растворов алкоголя (100%, 95%, 70%, и 50% EtOH в H2O в течение 2 мин каждого погружения).
    2. Выполняйте извлечение антигена путем нагревания (близко к точке кипения) секций, погруженных в цитрат (pH 6.0-adjusted) в течение 20 мин.
    3. Дайте образцам остыть до комнатной температуры в течение 15-20 мин, а затем промыть в PBS 3x в течение 2 минут каждый стирку.
    4. Блок для 60-90 мин в блокирующем буфере (10% FBS; 1% BSA; 0.0025% желатин кожи рыб; 0.05% PBST, т.е. PBS с 0.05% Tween-20).
    5. Инкубировать образцы со смесью первичных крыс и кролика антитела, которые нацелены на эндомуцин и ПМР, соответственно, а затем мыть в PBST 3x, 2 мин каждый.
    6. Инкубировать образцы со смесью вторичных антител осла против крыс IgG (конъюгированный Alexa-647) и кролика IgG (конъюгированный Alexa-488), а затем мыть в PBST 3x 2 мин каждый.
    7. Выполните рутинное окрашивание DAPI (т.е. погружение в раствор DAPI в течение 5-6 минут), смонтируйте слайды с помощью «жесткого» монтажа без глицерола и храните в темном месте до сканирования.
    8. Для достижения оптимальных результатов сканирует слайды на цифровом сканере слайдов.
  3. Анализ изображений
    1. Захват 10 высокомощных полей (HPFs) в случае, используя любое программное обеспечение, подходящее для цифровой патологии.
    2. Сохранить эндомуцин (красный) и TMR (зеленый) каналы отдельно как TIFF.
    3. Используя ImageJ, загрузите файлы TIFF и преобразуйте их в 8-битные изображения.
    4. Забронируйте 8-битные изображения до уровня отрицательного контроля и создайте два бинаризированных изображения, показывающие «маски» Эндомуцина и ПМР.
    5. Из двоичных инструментов выберите заполнить отверстия на маске Endomucin.
    6. Создание и сохранение следующих пяти регионов, представляющих интерес: 1) Пороговое изображение декексна как "Dextran ROI" (ROI1), 2) пороговое изображение эндомуцина как "Сосудистая ROI" (ROI2), 3) перевернутое изображение эндомуцина как "Extravascular ROI" (ROI3), 4) пересекается " Внесосудистая рентабельность инвестиций" и "Dextran ROI" изображение (ROI1 - ROI3) как "Внесокулярная dextran ROI" (ROI4), и 5) все изображение как "Tumor ROI" (ROI5).
    7. Разделите область ROI4 на область ROI5 и умножайте на 100, чтобы создать процентную площадь, которую внесосудистое декетрен покрывает во всей опухоли.
    8. Повторите процесс для 10-20 HPFs в случае (в зависимости от наличия ткани) и генерировать средний внесосудистый Dextran (% области) для каждого случая.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Экспериментальные процедуры, описанные в настоящей статье протокола, кратко обобщены и проиллюстрированы на рисунке 1A-C.

Для измерения проницаемости сосудов TMEM ("всплесковой активности") и снижения экспериментального шума от других способов проницаемости сосудов (т.е. трансклеточных и параклеточных, как поясняется во введении), мы выполнили внутривенно (т.е.) инъекции зондов высокого молекулярного веса, таких как 155 kDa Dextran, спрягались с т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы намечаем два протокола, которые могут быть применены для визуализации и количественной оценки определенного типа сосудистой проницаемости, которая присутствует в дверных проемах TMEM и связана с нарушением сосудистой плотности и связей. Этот тип проницаемости сосудов является переходным и контролируется трехсторонним клеточным комплексом TMEM, как поясняется выше5. Способность выявлять и количественно определять сосудистую проницаемость, связанную tMEM, имеет решающее значение для оценки ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не раскрывают никакого конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Аналитический центр визуализации (AIF) в Медицинском колледже Альберта Эйнштейна за поддержку изображений. Эта работа была поддержана грантами NCI (P30CA0133330, CA150344, CA 100324 и CA216248), SIG 1S10OD019961-01, Центр биофотоники Gruss-Lipper и его комплексная программа визуализации, а также Рут Грантштейн из Montefiore для исследования микроокружения опухоли (CA200561).

ГСК совместно писала рукопись, выполняла визуализацию для фигур 1С и 3В, разработала протокол анализа фиксированной ткани, проанализировала и интерпретировала все данные; JMP совместно написал рукопись, и выполнил операцию и интравитальной визуализации для рисунка 1B,2C и 3A; LB и AC выполнили операцию и интравитальной визуализации для Рисунок 2B; RJ выполнил операцию и интравитальной визуализации для Рисунок 2A; ОАО является соавтором рукописи, проанализировало и интерпретировало все данные; MHO совместно написал рукопись и проанализировал и интерпретировал все данные; и DE выполнили операцию и интравитальной визуализации для рисунка 2D, соавтором рукописи, разработал и разработал анализ фиксированной ткани и внутрижизненной протоколы визуализации, а также проанализировали и интерпретировали все данные.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антикроличий IgG (Alexa 488)Life Technologies CorporationA-11034
Антикрысиный IgG (Alexa 647)Life Technologies CorporationA-21247
Бычья сыворотка АльбуминFisher ScientificBP1600-100
ЦитратEng Scientific Inc9770
Покровное стекло СкользкиЭлектронная микроскопия науки72296-08
Цианоакрилатный клейHenkelAdhesive 1647358
DAPIPerkin ElmerFP1490
Декстран-тетраметил-родаминSigma AldrichT1287
DMEM/F12Gibco11320-033
Эндомуцин (первичное антитело)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
ЭнрофлоксацинBayer84753076 v-06/2015
Фетальная бычья сывороткаSigma AldrichF2442
Желатин рыбьей кожиFisher ScientificG7765
Инсулиновый шприцBecton Dickinson309659
изофторанHenry ScheinNDC 11695-6776-2
MatrigelCorningCB40234Игла для искусственного внеклеточного матрикса
(30 г)Becton Dickinson305128
фосфат буферизованный солевым растворомLife Technologies CorporationPBS
Полиэтиленовая трубкаScientific Commodities IncBB31695-PE/1
пульсоксиметрKent ScientificMouseOx
Puralube Vet OintmentDechraNDC 17033-211-38
Квантовые точкиLife Technologies CorporationQ21561MP
RubberMcMaster Carr1310N14
TMR (первичное антитело)InvitrogenA6397
Tween-20MP BiologicalsTWEEN201
XyleneFisher Scientific184835

Ссылки

  1. Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Raza, A., Franklin, M. J., Dudek, A. Z. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American Journal of Hematology. 85 (8), 593-598 (2010).
  4. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research. 316 (8), 1324-1331 (2010).
  5. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  6. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  7. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  8. Sparano, J. A., et al. A metastasis biomarker (MetaSite Breast Score) is associated with distant recurrence in hormone receptor-positive, HER2-negative early-stage breast cancer. npj Breast Cancer. 3, 42(2017).
  9. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (8), (2014).
  10. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clinical Cancer Research. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  11. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Science Signaling. 7 (353), 112(2014).
  12. Oktay, M. H., Jones, J. G. TMEM: a novel breast cancer dissemination marker for the assessment of metastatic risk. Biomarkers in Medicine. 9 (2), 81-84 (2015).
  13. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (Mena(INV)) and Mena11a isoforms play distinct roles in breast cancer cell cohesion and association with TMEM. Clinical & Experimental Metastasis. 28 (6), 515-527 (2011).
  14. Harney, A. S., et al. The Selective Tie2 Inhibitor Rebastinib Blocks Recruitment and Function of Tie2(Hi) Macrophages in Breast Cancer and Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (11), 2486-2501 (2017).
  15. Bates, D. O., Lodwick, D., Williams, B. Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation. 6 (2), 83-96 (1999).
  16. Lee, Y. C. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Current Opinion in Investigational Drugs. 6 (11), 1124-1130 (2005).
  17. Roberts, W. G., Palade, G. E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Cancer Research. 57 (4), 765-772 (1997).
  18. Stan, R. V., et al. Immunoisolation and partial characterization of endothelial plasmalemmal vesicles (caveolae). Molecular Biology of the Cell. 8 (4), 595-605 (1997).
  19. Roberts, W. G., Palade, G. E. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2369-2379 (1995).
  20. Arwert, E. N., et al. A Unidirectional Transition from Migratory to Perivascular Macrophage Is Required for Tumor Cell Intravasation. Cell Reports. 23 (5), 1239-1248 (2018).
  21. Kadioglu, E., De Palma, M. Cancer Metastasis: Perivascular Macrophages Under Watch. Cancer Discovery. 5 (9), 906-908 (2015).
  22. Hughes, R., et al. Perivascular M2 Macrophages Stimulate Tumor Relapse after Chemotherapy. Cancer Research. 75 (17), 3479-3491 (2015).
  23. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, 75(2014).
  24. Squadrito, M. L., De Palma, M. Macrophage regulation of tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 123-145 (2011).
  25. Ferrara, N. Role of myeloid cells in vascular endothelial growth factor-independent tumor angiogenesis. Current Opinion in Hematology. 17 (3), 219-224 (2010).
  26. Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 86 (5), 1065-1073 (2009).
  27. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  28. Lewis, C. E., De Palma, M., Naldini, L. Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Cancer Research. 67 (18), 8429-8432 (2007).
  29. Mazzieri, R., et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 19 (4), 512-526 (2011).
  30. Lewis, C. E., Ferrara, N. Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors. Cancer Cell. 19 (4), 431-433 (2011).
  31. Gabrusiewicz, K., et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy-induced glioma invasion is associated with accumulation of Tie2-expressing monocytes. Oncotarget. 5 (8), 2208-2220 (2014).
  32. Karagiannis, G. S., Condeelis, J. S., Oktay, M. H. Chemotherapy-induced metastasis: mechanisms and translational opportunities. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  33. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  34. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  35. Satchell, S. C., Braet, F. Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 296 (5), 947-956 (2009).
  36. Stan, R. V. Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 621-643 (2007).
  37. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Reviews. 36 (5), 564-591 (2015).
  38. Entenberg, D., et al. Imaging Tumor Cell Movement in Vivo. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-19 (2013).
  39. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  40. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  41. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (2), 430-433 (2008).
  42. Entenberg, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  43. Pastoriza, J. M., et al. Black race and distant recurrence after neoadjuvant or adjuvant chemotherapy in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  44. Williams, J. K., et al. Validation of a device for the active manipulation of the tumor microenvironment during intravital imaging. Intravital. 5 (2), 1182271(2016).
  45. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042(2016).
  46. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  47. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2120-2131 (2011).
  48. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  49. Chang, Y. S., Jalgaonkar, S. P., Middleton, J. D., Hai, T. Stress-inducible gene Atf3 in the noncancer host cells contributes to chemotherapy-exacerbated breast cancer metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (34), 7159-7168 (2017).
  50. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  51. Winkler, F., et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell. 6 (6), 553-563 (2004).
  52. Goel, S., et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiological Reviews. 91 (3), 1071-1121 (2011).
  53. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  54. Carmeliet, P., Jain, R. K. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  55. Meijer, E. F., Baish, J. W., Padera, T. P., Fukumura, D. Measuring Vascular Permeability In Vivo. Methods in Molecular Biology. 1458, 71-85 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

TMEM DoorwayTMR
Оценка опухолевой микросреды метастазов Doorway-Mediated Сосудистая проницаемость, связанная с распространением раковых клеток с помощью интравитального изображения и фиксированного анализа тканей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.