Строительство плазмидов CRISPR и обнаружение эффективности нокаутов в клетках млекопитающих с помощью системы репортеров Dual Luciferase

Summary

Здесь мы представляем протокол, описывающий обтекаемый метод эффективного поколения плазмидов, выражающей как фермент CRISPR, так и связанные с ним одногидные РНК (sgRNAs). Ко-трансфекции клеток млекопитающих с этим вектором sgRNA/CRISPR и двойной вектор люциферазы репортер, который рассматривает двойной прядь перерыв ремонт позволяет оценку эффективности нокаута.

Abstract

Несмотря на высокую эффективность, модификация геномного участка ферментом CRISPR требует заранее генерации sgRNA, уникальной для целевого участка. В этой работе описаны ключевые шаги, ведущие к строительству эффективных векторов sgRNA с использованием стратегии, которая позволяет эффективно обнаруживать положительные колонии ПЦР до секвенирования ДНК. Поскольку эффективное редактирование генома с использованием системы CRISPR требует высокоэффективной sgRNA, предварительный отбор кандидатов sgRNA целей необходимо, чтобы сэкономить время и усилия. Двойная система репортер luciferase была разработана для оценки эффективности нокаута путем изучения двойной пряди перерыва ремонт через одну прядь annealing. Здесь мы используем эту систему репортеров, чтобы подобрать предпочтительную цель xCas9/sgRNA от векторов кандидата sgRNA для конкретного редактирования генов. Протокол, изложенный обеспечит предпочтительный вектор фермента sgRNA/CRISPR в течение 10 дней (начиная с надлежащим образом разработанных олигонуклеотидов).

Introduction

SgRNAs CRISPR состоит из 20-нуклеотидной последовательности (протопространственника), которая дополняет геномную целевую^{последовательность 1,2.} Несмотря на высокую эффективность, способность системы CRISPR/Cas изменять данный геномный сайт требует генерации вектора, несущего эффективную sgRNA, уникальную для целевого сайта^{(ы) 2.} В настоящем документе описаны ключевые шаги в генерации этого вектора sgRNA.

Для успешного редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas использование высокоэффективных sgRNAs является важнейшим^{условием 3,}....

Protocol

1. конструкция sgRNA oligonucleotide

1. Дизайн sgRNAs с помощью онлайн-инструментов, таких как Cas-Designer онлайн инструмент (http://www.rgenome.net/cas-designer/). Последовательность PAM важна на основе используемого Cas9. Для xCas9, соответствующие последовательности PAM являются NG и бывший упомянутый Cas-Designer онлайн инструмент может генерировать xCas9 соответствующих sgRNAs.
   1. Используйте инструменты проектирования sgRNA, которые охватывают алгоритмы для прогнозирования на и вне цели (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)¹¹. Предпочтительнее оценка 0,2 или больше.
2. Выб....

Results

Методы, изложенные в этом протоколе, для строительства векторов экспрессии sgRNA и xCas9, а затем для оптимизации скрининга sgRNA oligos с относительно более высокой эффективностью таргетинга генов. Здесь мы помечим репрезентативный пример 3 целей sgRNA для овец DKK2 exon 1. SgRNA и xCas9 выражая векторы могут быть построены путем predigesting вектор позвоночника (Рисунок 2), а затем лигатирование его в серии коротких двухструнные фрагменты ДНК через annealing олиго пар. Положительн.......

Discussion

Описанные здесь процедуры клонирования вектора sgRNA облегчают эффективное производство sgRNAs, при этом большая часть затрат приходится на заказ олигонуклеотида и секвенирование векторов. В то время как изложенный метод предназначен, чтобы позволить пользователям генерировать sgRNAs для использования с CRISPR/Cas9, протокол может быть легко адаптирован для использования с Cas9 ортологами или другими РНК-управляемых эндонуклеазов, таких как Cpf1, вводя незначительные изменения в вектор позвоночника и олигонуклеотид навис.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Новое поколение градиентного ПЦР-инструмента с полным сенсорным экраном	LongGene	A200	Амплификация целевого гена
Ферменты рестрикции AscI Новая	Англия Biolabs	R0558V	Режущие целевые векторы
Фермент рестрикции BBSI Новая	Англия Biolabs	R0539S	Режущие целевые векторы
Чистый верстак	AIRTECH	SW-CJ-2FD/VS-1300L-U	Устройство частичной очистки в виде вертикального ламинарного потока, которое создает локальную среду высокой чистоты воздуха
DH5&альфа; Компетентные клетки	TaKaRa	K613	Плазмидная векторная трансформация
Двойная люциферасная репортерная система	Promega	E1910	Двойная люциферасная репортерная
баня Электрическая термостатическая водяная баня	Sanfa Scientific Instruments	DK-S24	Нагревательный реагент постоянной температурой в водяной бане
Электрофорез	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	DYY-6C	Управление напряжением, током и т.д.
Eppendorf Reference 2	Eppendorf China Ltd.	Ссылка 2	Точное рисование и перенос следов жидкого
геля Анализатор визуализации	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	WD-9413B	Для анализа изображений геля для электрофореза
GloMax 20/20 Люминометр	Promega	E5311	Обнаружение двойной активности люциферазы
Высокоскоростная охлаждаемая центрифуга	BMH	sigma 3K15	Экстракция и очистка нуклеиновых кислот
Интеллектуальный биохимический инкубатор	Sanfa Scientific Instruments	SHP-160	Обеспечьте подходящую температурную среду для эксперимента по расщеплению ферментов
LB Broth Agar	Sangon Biotech	A507003-0250	Для выращивания E.coli
Lipofectamine 3000 Набор реагентов для трансфекции	Thermo Fisher	L3000015	ДНК Трансфекция
SalI рестриктивные ферменты New	England Biolabs	R3138V	Режущие целевые векторы
SanPrep Column DNA Gel Набор для экстракции	Sangon Biotech	B518131-0050	Переработка фрагментов ДНК
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit	Sangon Biotech	B518191-0100	Экстракция плазмидной ДНК
T4 ДНК-лигаза	New England Biolabs	M0202V	Link Фрагмент ДНК
TaKaRa MiniBEST Набор для очистки фрагментов ДНК Ver.4.0	TaKaRa	9761	Очистка ДНК
Вертикальная Паровой стерилизатор давления	JIBIMED	LS-50LD	Высокотемпературный и автоклав для уничтожения бактерий, грибков и других микроорганизмов в лабораторном оборудовании
Термостат водяной бани	Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.	ШЗ-82	Дайте бактериям продолжать трястись, что хорошо для контакта с воздухом.