Методическая статья

В Vivo Функциональное исследование связанных с болезнями редких человеческих вариантов с использованием дрозофилы

DOI:

10.3791/59658

⸱

20 августа 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью данного протокола является описание дизайна и выполнения экспериментов in vivo в Drosophila melanogaster для оценки функциональных последствий редких вариантов генов, связанных с болезнями человека.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Достижения в области технологии секвенирования сделали наборы данных всего генома и цельно-экзома более доступными как для клинической диагностики, так и для передовых исследований генетики человека. Хотя ряд алгоритмов силико были разработаны для прогнозирования патогенности вариантов, определенных в этих наборах данных, функциональные исследования имеют решающее значение для определения того, как конкретные геномные варианты влияют на функцию белка, особенно для неправильного Варианты. В Сети недиагностированных болезней (UDN) и других редких консорциумов исследований заболеваний, модель организмов (MO), включая Drosophila, C. elegans,зебрафиш, и мышей активно используются для оценки функции индикативного заболевания человека, вызывающих Варианты. Этот протокол описывает метод функциональной оценки редких человеческих вариантов, используемых в Центре скрининга модельных организмов Drosophila Core UDN. Рабочий процесс начинается со сбора информации о человеке и МО из нескольких общедоступных баз данных, используя веб-ресурс MARRVEL для оценки того, может ли этот вариант способствовать состоянию пациента, а также разрабатывать эффективные эксперименты на основе имеющихся знаний и ресурсов. Далее, генетические инструменты (например, T2A-GAL4 и UAS-человеческий cDNA линии) создаются для оценки функций вариантов интереса к Drosophila. После разработки этих реагентов для оценки функции вариантов могут проводиться двусторонние функциональные анализы, основанные на спасательных и переэкспрессивных экспериментах. В спасательной ветви эндогенные гены мухи «очеловечены», заменяя ортолотеозный ген дрозофилы эталонным или вариантом человеческих трансгенов. В ветви переэкспрессии, справочные и варианты человеческих белков экзогенно приводится в различных тканях. В обоих случаях любой фенотип (например, летальность, морфология глаз, электрофизиология) может использоваться в качестве считывания, независимо от заболевания, представляющих интерес. Различия, наблюдаемые между эталонными и вариантными аллелями, указывают на разновидно-специфический эффект и, таким образом, вероятную патогенность. Этот протокол позволяет быстро, in vivo оценки putative человека болезнетворных вариантов генов с известными и неизвестными функциями.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пациенты с редкими заболеваниями часто проходят трудное путешествие называют "диагностическая одиссея", чтобы получить точный диагноз1. Большинство редких заболеваний, как полагают, имеют сильное генетическое происхождение, что делает генетический / геномный анализ критических элементов клинической работы. В дополнение к последовательности генной панели кандидата и анализа вариаций числа копий на основе хромосомных микроаррей, технологий секвенирования всего генома (WES) и секвенирования всего генома (WGS) стали все более ценными инструментами за последнее десятилетие2, 3. В настоящее время, диагностическая ставка для выявления известных патогенных вариантов в WES и WGS составляет 25% (выше в детских случаях)4,5. В большинстве случаев, которые остаются невыявленными после клинической WES/WGS, общая проблема заключается в том, что существует много генов и вариантов кандидатов. Секвенирование следующего поколения часто определяет новые или ультра-редкие варианты во многих генах, и интерпретация того, способствуют ли эти варианты фенотипам болезни, является сложной задачей. Например, хотя большинство ерунда или frameshift мутации в генах, как полагают, потеря функции (LOF) аллели из-за ерунды опосредованного распада закодированного транскрипта, усечение мутаций, найденных в последних экзонов избежать этого процесса и может функционировать как доброкачественные или прироста функций (GOF) аллели6.

Кроме того, прогнозирование последствий аллеля неправильного зрения является сложной задачей, так как это может привести к ряду различных генетических сценариев, как впервые описано Германом Мюллером в 1930-х (т.е. аморф, гипоморф, гиперморф, антиморф, неоморф, или изоморф)7 . Многочисленные программы силико и методологии были разработаны для прогнозирования патогенности вариантов неправильности, основанных на эволюционной сохранении, типами изменения аминокислот, положением в функциональной области, частотой аллелей в общей популяции, и другие параметры8. Однако эти программы не являются комплексным решением для решения сложной проблемы интерпретации вариантов. Интересно, что недавнее исследование показало, что пять широко используемых алгоритмов прогнозирования патогенности (Полифен9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Мутация Taster) согласны на патогенность 80% времени8 . Примечательно, что даже когда все алгоритмы согласны, они возвращают неправильное предсказание патогенности до 11% времени. Это не только приводит к недостаткам клинической интерпретации, но и может отговорить исследователей от последующих на новые варианты, ложно перечисляя их как доброкачественные. Один из способов дополнить нынешнее ограничение в силико моделирования является предоставление экспериментальных данных, которые демонстрируют эффект функции варианта in vitro, ex vivo (например, культивированные клетки, органоиды), или in vivo.

In vivo функциональные исследования редких вариантов заболеваний, связанных в MO имеют уникальные сильные13 и были приняты многими редкими инициативами исследования заболеваний по всему миру, в том числе Недиагностированные болезни сети (UDN) в Соединенных Штатах и редких Болезни Модели и механизмы (RDMM) Сети в Канаде, Японии, Европе и Австралии14. В дополнение к этим скоординированным усилиям по интеграции исследователей МО в рабочий процесс диагностики редких заболеваний и механистических исследований в национальном масштабе, ряд индивидуальных совместных исследований между клиническими и MO исследователей привели к открытию и характеристика многих новых генов и вариантов, вызывающих болезни человека,82,83,84.

В UDN, централизованный модельНые органы скрининговый центр (MOSC) получает представления генов-кандидатов и вариантов с описанием состояния пациента и оценивает, является ли вариант может быть патогенным с помощью инструментов информатики и in vivo Эксперименты. В фазе I (2015-2018) UDN, MOSC состоит из Drosophila Core (Бейлор колледж медицины (BCM) и Зебрафиш ядро (Университет штата Орегон), которые работали совместно для оценки случаев. Используя анализ информатики и ряд различных экспериментальных стратегий в Drosophila и зебрафиш, MOSC до сих пор способствовали диагностике 132 пациентов, выявление 31 новых синдромов55, открытие нескольких новых человеческих гены заболеваний (например, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) и фенотипическое расширение известного заболевания гены (например, CACNA1A21,ACOX122).

В дополнение к проектам в рамках UDN, исследователи MOSC Drosophila Core внесли свой вклад в новые открытия генов болезни в сотрудничестве с Центрами менделианской геномики и другими инициативами (например, ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) с использованием того же набора информатики и генетики стратегии, разработанные для UDN. Учитывая значение исследований МО по диагностике редких заболеваний, MOSC был расширен, чтобы включить ядро C. elegans и второе ядро зебрафиш (оба в Университете Вашингтона в Сент-Луисе) для фазы II (2018-2022) UDN.

Данная рукопись описывает протокол функционального исследования in vivo, который активно используется в UDN MOSC Drosophila Core, чтобы определить, имеют ли варианты неправильного зрения функциональные последствия для белка, интересуемого с помощью трансгенных мух, которые выражают человека Белки. Цель этого протокола состоит в том, чтобы помочь исследователям МО работать совместно с клиническими исследовательскими группами, чтобы предоставить экспериментальные доказательства того, что вариант кандидата в гене интереса имеет функциональные последствия, тем самым облегчая клиническую диагностику. Этот протокол является наиболее полезным в сценарии, в котором исследователь Drosophila подошел клинический исследователь, который имеет редкое заболевание пациента с конкретным вариантом кандидата в гене интереса.

Этот протокол может быть разбит на три элемента: (1) сбор информации для оценки вероятности варианта интереса, ответственного за фенотип пациента и осуществимость функционального исследования в Drosophila, (2) сбор существующих генетических инструментов и создания новых, и (3) выполнения функциональных исследований in vivo. Третий элемент можно также разделить на два подэлемента на основе того, как можно оценивать функцию варианта интереса (спасательный эксперимент или стратегии, основанные на перевыражении). Важно отметить, что этот протокол может быть адаптирован и оптимизирован для многих сценариев, не связанных с исследованиями редких моногенных заболеваний (например, распространенные заболевания, взаимодействие генно-экологических и фармакологических/генетических экранов для определения терапевтических целей). Способность определять функциональность и патогенность вариантов не только принесет пользу интересуемому пациенту, обеспечивая точную молекулярную диагностику, но и окажет более широкое влияние как на трансляционные, так и на фундаментальные научные исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Сбор информации человека и МО для оценки: Вероятность варианта интересов, ответственного за фенотипы болезней и целесообразность функциональных исследований в Дрософиле

  1. Выполните обширные поиски базы данных и литературы, чтобы определить, являются ли конкретные гены и варианты интересов хорошими кандидатами для объяснения фенотипа интересуемого пациента. В частности, соберите следующую информацию.
    1. Оцените, если ген интереса был ранее вовлечен в другие генетические расстройства (фенотипическое расширение известного гена болезни) или это совершенно новый ген кандидата болезни (вариант гена неопределенного значения (GVUS)».
    2. Оценить частоту аллелей вариант анабиозвого интереса к базам данных популяций болезней или контролировать его.
    3. Оцените, есть ли вариации числа копий (CNV), которые включают этот ген в базы данных болезни или контролируют популяционные базы данных.
    4. Оцените, какие ортолотовые гены находятся в различных видах MO, включая мышь, зебра, Дрозофилу, C. elegans и дрожжи, а затем далее исследовать известные функции и модели экспрессии этих ортоломных генов.
    5. Оцените, присутствует ли вариант интереса в функциональной области белка и сохраняется ли аминокислота эволюционно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ответы на эти пять вопросов (шаги 1.1.1-1.1.5) можно получить, получив доступ к ряду баз данных человека и MO по отдельности или с помощью веб-ресурса MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant Exploration) (см. таблицу 1 для интернет-ресурсов)30, который подробно описан в сопроводительной статье31. Для конкретных примеров можно найти раздел «Репрезентативные результаты». Сайт Monarch Initiative32 и Gene2Function33 также предоставляют полезную информацию.
  2. Соберите дополнительную информацию для дальнейшей оценки того, является ли вариант хорошим кандидатом на болезнь из белковой функции и структуры точки зрения.
    1. Оцените, если вариант интереса, по прогнозам, будет разрушительным на основе алгоритмов прогнозирования силико.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вариант патогенности алгоритмы были разработаны многими исследовательскими группами в течение последних 15 лет, и некоторые из них также отображаются в результатах поиска MARRVEL. Более поздние программы, в том числе два перечисленных ниже, объединить несколько вариантов патогенности алгоритмов редикции и машинного обучения подходов для создания патогенности оценка. Для получения дополнительной информации об алгоритмах прогнозирования вариантов и их производительности, обратитесь к Ghosh, и др.8. i) CADD (комбинированное истощение, зависящее от аннотации): интегративный инструмент аннотации, построенный из более чем 60 геномных особенностей, который обеспечивает баллы для человеческих SNVs, а также короткие вставки и удаления11. ii) REVEL (редкий экзомический вариант ансамбля): сочетает в себе алгоритмы патогенности нескольких вариантов (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVEAN, MutationAssessor, MutationTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP и phastCons) для обеспечения комплексного балла для всех возможных вариантов человеческой ощутвия34.
    2. Определите, если человеческий ген / белок интерес или его MO ортологи были показаны генетически или физически взаимодействовать с генами / белками, ранее связанных с генетическими заболеваниями. Если это так, оценить, если пациент интерес экспонатов перекрывающихся фенотипов с этими расстройствами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько инструментов были разработаны для анализа генетических и белково-белковых взаимодействий на основе публикаций MO, а также крупномасштабных протеомики с экранов нескольких видов. STRING (инструмент поиска для повторяющихся экземпляров соседних генов)35: база данных для известных и предсказанных белково-белковых взаимодействий. Он интегрирует наборы данных генетического взаимодействия и совместного выражения, а также инструменты для интеллектуального анализа генов и белков, которые могут функционировать вместе в различных организмах. MIST (инструмент поиска молекулярного взаимодействия)36: база данных, которая интегрирует генетические и белковые данные взаимодействия от основных генетических МО (дрожжи, C. elegans, Drosophila, зебрафиш, лягушка, крыса, мышь) и людей. Прогноз взаимодействия, выведенные из ортолотовых генов/белков (интерлоги) также отображаются.
    3. Определите, была ли решена или смоделирована трех-D структура интересуемого белка. Если это так, определите, где вариант карты интереса относительно ключевых функциональных доменов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Белковые структуры, решенные рентгеновской кристаллографией, ядерным магнитным резонансом (ЯМР) и криоэлектронной микроскопией, можно найти в общедоступных базах данных, включая PDB (банк данных о белках) и EMDatabank37. Хотя нет единой базы данных для предсказанных/смоделированных белковых структур, для выполнения белкового моделирования пользователям доступны несколько алгоритмов (т.е. SWISS-MODEL38,Modeller39и Phyre240).
  3. Общайтесь с клиническими сотрудниками для обсуждения информации, собранной в анализах информатики в разделах 1.1-1.2. Если клинические сотрудники также считают, что вариант и ген интереса являются хорошими кандидатами, чтобы объяснить фенотипы видели у пациента, перейти к разделу 2. Если есть конкретные вопросы о генотипе и фенотипе пациента, обсудите их с клиническими сотрудниками, прежде чем двигаться вперед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если считается, что вариант интереса вряд ли объяснить фенотип интереса (например, идентичный вариант, найденный в высокой частоте в контрольной популяции), обсудить это с клиническими сотрудниками, чтобы определить, является ли вариант хорошим кандидата, так как может не быть соответствующего опыта для интерпретации клинических фенотипов.

2. Сбор существующих генетических инструментов и создание новых реагентов для изучения конкретного варианта интересов

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как вариант интереса был определен хороший кандидат проводить экспериментально, собирать или генерировать реагенты для выполнения in vivo функциональных исследований. Для функциональных исследований, описанных в этом протоколе, некоторые ключевые drosophila меланогастер реагенты необходимы: 1) вверх по течению активации последовательности регулируемых человеческих cDNA трансгенных штаммов, которые несут ссылку или вариант последовательности, 2) потеря функции аллель гена мухи интерес, и 3) GAL4 линии, которые могут быть использованы для спасательных экспериментов.

  1. Поколение конструкций УАЗ-человека кДНК и трансгенных мух
    1. Определите и получите соответствующие конструкции кДНК человека. Многие клоны доступны из MGC (mammalian коллекция генов)43 и могут быть приобретены у отдельных продавцов. Для генов, которые в качестве альтернативы сращиваются, проверьте, какие изоформные кДНК соответствует использованию Ensembl или RefSeq.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Многие cDNAs доступны в рекомбиназе-опосредованной системы клонирования совместимых реагентов44, что упрощает подклонирование шаг. cDNAs может прийти в формате "открытый (без остановки кодон)" или "закрытый (с эндогенным или искусственным стоп-кодоном)" формат. В то время как открытые клоны позволяют C'-пометки белков, которые полезны для биохимических (например, западная поника) и клеточных биологических (например, иммуномаркировки) анализы для мониторинга экспрессии белка интерес, это может помешать функции белка в некоторых случаях.
    2. Субклон ссылка и вариант cDNA в Drosophila трансгенный вектор. Используйте систему трансгенеза, опосредованный ц31, так как это позволяет интегрировать справочно-вариант cDNA в одно и то же место в геноме45. Для этого проекта, MOSC Drosophila Core регулярно использует вектор pGW-HA.attB46.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если человек cDNA находится в рекомбиназе-опосредованной системы клонирования совместимых векторов (например, pDONR221, pENTR221), перейти к разделу 2.1.4, который объясняет LR реакции на субклон cDNAs в pGW-HA.attB.
      1. Если кДНК человека не находится в системе клонирования, опосредованной рекомбиназой, совместимой с плазмидом, подклон человеческого cDNA в вектор входа шлюза с использованием стандартных молекулярно-биологических методов (пример такого протокола описан ниже).
        1. Выполните навес ПЦР, чтобы ввести attB1 и attB2 оружия. Передняя грунтовка должна иметь attB1 последовательность 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAGCAAGCTTTTCACC-3', а затем первые 22 нуклеотидов целевой кДНК. Обратный грунт должен иметь attB2 последовательность 5'-GGGGACCACTTGTACAAGAAGCTGGGTCTTTTA-3', а затем обратный дополнение последних 25 нуклеотидов кДНа интереса. Исключите стоп-кодон кДНК, затем добавьте тег C', если хочется "открыть" клон, или добавьте стоп-кодон, чтобы "закрыть" клон.
        2. Подготовьте 100 л высокой точности PCR смеси, состоящей из 50 зЛ высокой точности PCR мастер-микс, 36 л дистиллированной воды, 5 л каждой вперед и обратных грунтовки, перечисленные в шаге 2.1.2.1.1 разбавленной до 10 км., и 4 л целевого КДН (150 нг/Л).
        3. Выполните ПЦР с использованием стандартного протокола мутагенеза, чтобы добавить attB1 и attB2 оружия на cDNA интереса. Условия будут варьироваться в зависимости от конструкции и вариантов интереса.
        4. Изолировать целевую кДНК с добавлением гомологических рукояток с помощью геля электрофорасиса и извлечения геля. Создайте 1% агарозного геля и выполняйте электрофорус с использованием стандартных методов. Акциз полосы, которая соответствует размеру кДНК плюс дополнительная длина гомологических оружия. Извлекайте ДНК из геля стандартными методами95. Коммерческие комплекты извлечения геля доступны от нескольких компаний.
        5. Выполните реакцию в ибробры рекомбиназы на основе протокола клонирования, опосредованного рекомбиназой, в соответствии с используемой системой.
        6. Преобразуйте смесь реакции ВР в химически компетентные клетки кишечной палочки. Компетентные ячейки могут быть сделаны в доме или приобретены у коммерческих поставщиков. Культура преобразованных клеток на ночь на пластине LB, содержащей соответствующие антибиотики для выбора колонии. На следующий день выберите несколько колоний и выращивайте их в независимых жидких культурах в одночасье.
        7. Изолировать ДНК от ночных культур через мини-подготовку. Сэнгер последовательность положительных клонов, чтобы убедиться, что кДНК имеет правильную последовательность96. Поддержание клеток из культур, которые являются положительными для желаемой последовательности в 25% глицерола хранится при -80 градусов по Цельсию.
    3. Выполните сайт-направленный мутагенез, чтобы ввести вариант интереса к плазмид gateway с ссылкой человека cDNA97. Подробный протокол для этого метода можно найти на веб-сайте поставщика48,49. Проверить наличие варианта в мутировавшей плазмид через Sanger секвенирования всего открытого кадра чтения (ORF), чтобы убедиться, что Есть никаких дополнительных вариантов, введенных через этот шаг мутагенеза.
    4. Subclone справка и вариант человека cDNAs в плазмида дарителя (Плазмиды шлюза с attL1 и attL2 местами) в transgenic плазмида (например, pGW-HA.attB с attR1 и attR2 местами) через реакцию clonase LR.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть UAS C31 векторов, предназначенных для обычных ограничений фермента на основе подклонирования (например, pUAST.attB50), если предпочтительнее субклон человека cDNAs с помощью методов ограничения фермента.
    5. Выберите стыковочные площадки СК31, в которых можно интегрировать трансгены UAS-human cDNA. Ряд стыковочных площадок были созданы несколькими лабораториями и являются общедоступными из фондовых центров50,52,53.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку это удобно иметь человеческий трансген на хромосоме, которая не содержит мухи ортолог гена интерес, рекомендуется использовать вторую хромосомы стыковки сайт "VK37 (BDSC фондовых #24872" когда муха ортолог находится на X , третья или четвертая хромосомы, и используйте третью хромосомную стыковку (VK33 (BDSC stock #24871), когда ортолог мухи находится на второй хромосоме.
    6. Впрысните конструкции UAS-human cDNA в мухи, выражающие интегразу С-31 в их зародышевой линии (например, ваз-C31, nos-C31).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микроинъекция может быть выполнена в доме или отправлены на основные объекты или коммерческие объекты для трансгенеза. Подробный протокол для генерации трансгенных мух можно найти в цитируемой главе книги51.
    7. Создание стабильных трансгенных штаммов из инъекционных эмбрионов. Впрыскивает 100-200 эмбрионов на конструкцию94. На рисунке 1Аизображена репрезентативная схема пересечения трансгенной вставки во вторую хромосому стыковки (VK37). Ссылайтесь на приведенные книги54,55 для основной информации drosophila генетики.
  2. Получить или создать линию T2A-GAL4, которая облегчает функциональные анализы на основе спасения (см. рисунок 2 и раздел 3.1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта линия будет служить двум целям. Во-первых, большинство проверенных линий T2A-GAL4 ведут себя как сильные аллели LOF, действуя как аллель генной ловушки. Во-вторых, линии T2A-GAL4 функционируют как драйвер GAL4, что позволяет экспрессию конструкций UAS (например, UAS-GFP, UAS-человеческие cDNA) под эндогенными элементами регуляции гена интереса56,57 (Рисунок2A-C).
    1. Поиск публичных фондовых коллекций для доступных линий T2A-GAL4, включая Drosophila Gene Disruption Project (ВВП)58, в котором было создано59линий T2A-GAL4. Эти штаммы в настоящее время доступны из Блумингтон Drosophila фондовый центр (BDSC) и доступны для поиска через ВВП и BDSC веб-сайтов.
    2. Если линия T2A-GAL4 для гена мухи, представляющих интерес, проверьте, доступнали соответствующая линия кодирования intronic MiMIC (Minos-mediated integration cassette) для преобразования в линию T2A-GAL4 с помощью рекомбинационной кассетной биржи (RMCE) )60 (рисунок 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: RMCE позволяет интроническим элементам MiMIC, которые находятся между двумя кодирующими экзонами, которые будут преобразованы в линию T2A-GAL4 через микроинъекцию донорской конструкции (пример схемы пересечения показан на рисунке 1B) или серии кресты, как описано в деталях57,59.
    3. Если линия T2A-GAL4 недоступна и соответствующего кодирования интронного MiMIC не существует, изучите возможность создания линии T2A-GAL4 через систему CRIMIC (CRISPR-опосредованная интеграционная кассета)59.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта методология использует CRISPR-опосредованное расщепление ДНК и гомология-направленный ремонт (HDR) для интеграции MiMIC-как кассета в кодирование интрон в гене интереса.
    4. Если ген интереса не имеет большой интрон (No gt;150 bp) или не имеет интронов, попытка стучать в GAL4 трансгена в ген мухи с системой CRISPR/Cas9 с использованием HDR, как описано20,61,62.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если поколение T2A-GAL4 или GAL4 стук в аллель трудно, попытка выполнить спасательные эксперименты с использованием этих уже существующих аллелей или RNAi линий и вездесущие или ткани конкретных GAL4 драйверов, как описано92 (REF).

3. Выполнение функционального анализа человеческого варианта интереса в Vivo в Drosophila

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните спасательный анализ (раздел 3.1), а также исследования экспрессии (раздел 3.2) с использованием инструментов, собранных или сгенерированных в разделе 2 для оценки последствий варианта интереса к vivo в Drosophila. Рассмотрите возможность использования обоих подходов, поскольку эти два подхода дополняют друг друга.

  1. Выполнение функционального анализа с помощью спасательных экспериментов
    Примечание: Гетерологические спасательные эксперименты вDrosophilaс помощью человеческих белков определить, является ли молекулярная функция двух ортолотовых генов были сохранены в течение 500 миллионов лет эволюции. Они также оценивают функцию варианта в контексте человеческого белка63. Хотя систематический анализ, изучающий сотни генных пар, не был зарегистрирован, несколько десятков генов человека и млекопитающих (например, мыши) способны заменить функциюDrosophilaГены13.
    1. При подходе, основанном на спасении, сначала определите, есть ли очевидные, scorable, и воспроизводимые фенотипы в LOF мутантов в мухи ортолог аортолог перед оценкой функций вариантов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущая литература по гену мухи является хорошим местом для данных шахты во-первых, и она может быть найдена с помощью баз данных, включая FlyBase и PubMed. Дополнительные базы данных, такие как MARRVEL, Monarch Initiative и Gene2Funcion, также полезны для сбора этой информации.
    2. Выполните глобальное исследование scorable фенотипов в гомозиготных и hemizygous (T2A-GAL4 аллель над молекулярно определенным хромосомным дефицитом животных, особенно если T2A-GAL4 аллель является первой мутацией, которая будет характеризоваться для конкретного гена. Оцените фенотипы, такие как летальность, бесплодие, долговечность, морфологические (например, размер и морфология глаза) и поведение (например, ухаживания, полет, альпинизм и дефекты чувствительности челки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если Есть нет основных фенотипов, выявленных с этого первичного экрана, более тонкие фенотипы, такие как неврологические дефекты, измеренные электрофизиологических записей могут быть использованы, если они высоко воспроизводимы и конкретные. Например, функциональные исследования с использованием электроретинограммы (ERG) описаны в шаге 3.2.3. Если не обнаруживается какой-либо фенотип, перейдите на раздел 3.2 и выполните функциональное исследование на основе переэкспрессии.
    3. После того, как scorable фенотип определяется в мухе LOF мутант, проверить ли ссылка человека cDNA может заменить функцию мухи ортолога, пытаясь использовать человека cDNA, чтобы спасти мутанта летать линии. Фенотипический асси, который будет проводиться здесь, зависит от результатов шага 3.1.2 и будет специфичен для изучаемого гена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если "гуманизация" гена мухи является успешным, в настоящее время существует платформа для сравнения эффективности спасения для варианта интереса по сравнению с эталонным аналогом. Спасение видел со ссылкой человека cDNA не должны быть совершенными. Частичное спасение мухи мутант фенотипа с помощью человеческого cDNA по-прежнему обеспечивает точку отсчета для выполнения сравнительных исследований с использованием варианта штамма кДНК человека.
    4. Используя систему анализа, выбранную в шаге 3.1.2, сравните наблюдаемое спасение со ссылкой на кДНК человека с наблюдаемым спасением с вариантом человеческой кДНК, чтобы определить, имеет ли вариант интереса последствия для гена интереса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вариант человеческой кДНК выполняет хуже, чем ссылка аллель, это говорит о том, что вариант интереса является вредным для функции белка. Если вариант и ссылка не могут быть функционально различимы, то 1) аллель может быть изоморф (вариант, который не влияет на функцию белка) или 2) анализ не является достаточно чувствительным, чтобы обнаружить тонкие различия.
    5. Если вариант оказывается вредным аллелем, то дальнейшую оценку экспрессии и внутриклеточной локализации эталонных и вариантных белков, представляющих интерес в vivo через западную помотку, иммунофлюоресцентное окрашивание, или другие методы93.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если UAS-человеческий cDNA генерируется из открытого клона в векторе pGW-HA.attB, используйте анти-HA антитела для выполнения этих биохимических и клеточных анализов. Если оригинальный клон является закрытым клоном, проверьте, могут ли коммерческие антитела против человеческих белков использоваться для этих анализов. Разница в уровнях экспрессии и внутриклеточной локализации может показать, как вариант интереса влияет на функцию белка.
  2. Выполнение функционального анализа с помощью исследований переэкспрессии
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повсеместный или ткани конкретных переэкспрессии человека cDNAs в противном случае диких летмующих может предоставить информацию, которая дополняет спасательные эксперименты, обсуждаемые в разделе 3.1. В то время как спасательные анализы в первую очередь предназначены для обнаружения вариантов LOF (аморфных, гипофофических), анализы на основе переэкспрессии могут также выявить варианты усиления функций (GOF), которые труднее оценить (гиперморфные, антиморфные, неоморфные).
    1. Выберите набор драйверов GAL4, чтобы переэкспрессировать интерес у человека cDNA. Ряд вездесущих и тканевых/сценических драйверов GAL4 можно приобрести в государственных фондовых центрах (например, BDSC), некоторые из которых используются чаще, чем другие. Сначала сосредоточьтесь на вездесущих драйверах и легко разослательных фенотипах (летальность, стерильность, морфологические фенотипы), затем перейдите к тканевым драйверам и более специфическим фенотипам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверить выражение драйверов GAL4 с помощью строки репортера (например, UAS-GFP), чтобы подтвердить шаблоны выражений перед использованием в экспериментах.
    2. Выразить ссылку и вариант человеческого cDNAs с использованием того же драйвера в том же состоянии (например, температура) путем пересечения 3-5 девственных женщин из линии GAL4 (например, ey-GAL4 для глаз имитального выражения диска) с 3-5 мужчин мух из линий UAS ,например, UAS-TBX2 (кв) или UAS-TBX2 (p.R305H) для примера, показанного в разделе 4.2 в одном флаконе.
      1. Перенесите кресты каждые 2-3 дня, чтобы иметь много животных, вычеркиваемых из одного креста.
    3. Изучите потомство и обнаружите любые различия между эталонными и вариантными штаммами (например, морфологией глаз) под микроскопом вскрытия. Изображение мух с помощью камеры, прикрепленной к микроскопу вскрытия для документирования фенотипа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если фенотип виден только в ссылке, но не в строке варианта, то вариант может быть аморфным или сильным гипоморфным аллелем. Если фенотип виден в обоих генотипах, но ссылка вызывает более сильный дефект, то вариант может быть мягким до слабого гипоморфного аллеля. Если ссылка не показывает фенотип или только показывает слабый фенотип, но вариант показывает сильный дефект, то вариант может быть аллелем GOF.
    4. Если фенотип не виден в стандартных условиях культуры (RT или при температуре 25 градусов по Цельсию, то установите кресты при различных температурах в диапазоне 18-29 градусов по Цельсию, так как система UAS/GAL4, как известно, чувствительны к температуре64,65). Как правило, экспрессия трансгенов UAS выше при более высоких температурах.
  3. Выполняйте дополнительные функциональные исследования, связанные с генами и интересующий населенность белка.
    Примечание: В дополнение к изучению общих дефектов, система анализов может быть выбрана для зондирования молекулярных функций гена и варианта. В одном примере, обсуждаемом в репрезентативных результатах (TBX2случае), записи ERG были использованы для того чтобы обусловить влияния варианта на функции фоторецептора, в виду того что ген лету интереса (bifid) были изучены широко в контексте развития визуальной системы. Подробные протоколы для ERG вDrosophilaможно найти в том виде, в каком было опубликовано ранее66,67,68.
    1. Генерировать мух для проверки на функциональные дефекты в зрительной системе. Крест девственных женщин от родопсина 1 (Rh1)-GAL4 линии для мужчин со ссылкой или вариант Омской кДНК трансгенов, чтобы выразить человеческие белки, представляющие интерес в R1-R6 фоторецепторов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крест 3-5 девственных самок до 3-5 самцов летит в одном флаконе и передать кресты каждые 2-3 дня, чтобы иметь много животных eclosing от одного креста. Все кресты должны храниться в инкубаторе, установленном при экспериментальной температуре, для получения последовательных результатов.
    2. Как только мухи начинают приседать (при 25 градусах Цельсия, 10 дней после установки первоначального креста), соберите потомство(Rh1-GAL4/) UAS-человек cDNA / )в свежие флаконы и поместить их обратно в инкубатор установлен при экспериментальной температуре в течение дополнительных 3 дней для визуальной системы, чтобы созреть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя ERG может быть выполнена на 1-2 дней старых мух, вновь закрытых мух может иметь большие колебания в их ERG сигнала. Если желательно изучить возрастной фенотип, эти мухи могут быть выдержаны в течение нескольких недель до тех пор, пока они регулярно (например, каждые 5 дней) передаются в новый флакон, чтобы избежать утопления во влажной пище.
    3. Подготовка мух для записи ERG путем первого обезвреживания мух с использованием CO2 или размещения их в флакон на льду. Аккуратно приклейте одну сторону мухи к стеклянному микроскопу слайда, чтобы обездвижить их.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько ссылок и вариантов мух могут быть приклеены к одному слайду. Поместите все мухи примерно в той же ориентации с одним глазом быть доступным для записи электрода. Будьте осторожны, чтобы не получить клей на глаз и оставить хоботок бесплатно.
    4. Подготовьте записи и эталонные электроды. Поместите 1,2 мм стеклянный капилляр в иголку и активируйте. Разбейте капиллярную трубку, чтобы получить два резких конические электроды. Полученные электроды должны быть полыми и иметь окончательные диаметры 0,5 мм.
    5. Заполните капилляры сольным раствором (100 мМ NaCl), убедившись, что нет пузырьков воздуха. Сдвиньте стеклянные капилляры над электродами серебряной проволоки (как записывающий электрод, так и эталонный электрод, см. Рисунок4) и защитите капилляры на месте.
    6. Нарежьте стимулятор и усилитель. Подробную настройку можно найти в Lauwers, и др.67. Установка UDN Drosophila MOSC состоит из оборудования, указанного в разделе материалов.
      1. Установите усилитель на 0,1 Гц фильтр высокого прохода, 300 Гц фильтр низкопроходимых, и 100 усиления.
      2. Установите стимулятор до 1 с периода, 500 мс ширина импульса, 500 мс задержка импульса, режим запуска, и 7 Amp.
      3. Подготовьте источник света для фотостимуляции. Используйте галогенный источник света для активации фоторецепторов мухи.
      4. Подготовьте программное обеспечение для записи на компьютере, подключенном к настройке ERG. Создайте протокол стимуляции с моделью приобретения "фиксированные события длины" и 20 s продолжительность.
    7. Акклиматизировать мух и полностью темноту, прежде чем начать записи ERG. Поместите мух в полную темноту, по крайней мере 10 минут до начала эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку мухи не могут обнаружить красный свет, используйте источник красного света в период темного привыкания.
    8. Поместите слайд, содержащий мух, на аппарат записи и переместите микроманипуляторы, несущие эталонные и записывающие электроды, в точку, близкую к интересной мухе на слайде. Следите за кончиком электрода и аккуратно поместите эталонный электрод в грудную клетку мухи (проникайте в кутикулу). После того, как эталонный электрод вставляется, поместите звукозаписывающий электрод на поверхность глаза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точное положение этого эталонного электрода не оказывает существенного влияния на сигнал ERG. Электрод записи должен быть помещен на поверхности глаза, так как ERG является полевой потенциальной записью, а не внутриклеточной записью. Надлежащее давление, применяемое к записи электрода вызывает небольшой ямочка без проникновения в глаз.
    9. Выключите все огни еще на 3 мин, чтобы акклиматизировать сяхов в темную среду.
    10. Настройка программного обеспечения для записи и начать запись сигнала. При использовании галогенного источника света с ручным затвором включите источник света с закрытым затвором. Начните запись сигнала.
    11. Разоблачить летать глаза на свет, открывая и закрывая затвор каждые 1 с для 20 s продолжительность одного запуска.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выключение /выключение галогенного источника света можно управлять вручную или запрограммировать, чтобы стать автоматизированным с помощью белого источника светодиодного света. Более надежная и надежная ERG может быть получена с помощью галогенного источника света по сравнению с белым светом LED, вероятно, из-за более широкого спектра света, испускаемого из галогенного источника света.
    12. Запись ERGs от всех мух, которые установлены на стеклянной горке. Выполняйте ERGs от 15 мух на генотип в состоянии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые параметры, которые могут быть изменены, чтобы найти условие, которое показывает надежные различия между ссылкой и вариантом cDNAs может включать температуру, возраст или условия окружающей среды (например, воспитанный в светло-темном цикле или постоянном свете / темноте).
    13. Выполните анализ данных: сравните ERG со ссылкой, вариантом и элементами управления, чтобы определить, есть ли различия. Оцените данные ERG для изменений в переходных, деполоризация, внепереходных, и repolarization69 (Рисунок 4B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Деполяризация и реполяризация отражают активацию и инактивацию каскада фототрансдукции в фоторецепторах, в то время как на- и вне переходных являются мерами деятельности пост-синапических клеток, которые получают сигналы от фоторецепторов. Снижение амплитуды и измененная кинетика реполяризации часто связаны с дефектами с функцией фоторецепторов и здоровьем, в то время как дефекты в на-и-переходных встречаются у мутантов с дефектным развитием синапса, функцией или обслуживанием 70.
    14. При выявлении различий в фенотипах ERG с переэкспрессией эталонных против варианта человеческих cDNA, определить, является ли этот электрофизиологический фенотип связан со структурными и ультраструктурными дефектами в фоторецепторах и их синапсы, выполняя гистологический анализ и передачу электронной микроскопии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейшее обсуждение интерпретации дефектов ERG и структурного/ультраструктурного анализа было ранее описано69.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Функциональное исследование de novo Missense Variant в EBF3 связано с фенотипами нейроразвития
У 7-летнего мужчины с фенотипами нейроразвития, включая гипотонию, атаксию, глобальную задержку развития и выразительное нарушение речи, врачей и генетиков человека в Национальном проекте недиагностированных болезней здравоохранения (UDP) определены de novo missense вариант (p.R163 ) в EBF3 (Ранний B-Cell Factor 3)15, ген, который кодирует COE (Collier/Olfac...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальные исследования с использованием Drosophila melanogaster обеспечивают надежную систему ассеев для оценки последствий связанных с болезнью человеческих вариантов. Это связано с большим объемом знаний и разнообразных генетических инструментов, которые были созданы многими исследователями в области летать за последнее столетие89. Как и любая другая экспериментальная система, однако, важно признать оговорки и ограничения, которые существуют.

...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Хосе Салазара, Джулию Ван и д-ра Карен Шульце за критическое прочтение рукописи. Мы признаем, д-р Нин Лю и Си Луо для функциональной характеристики TBX2 варианты обсуждаются здесь. Недиагностированные болезни Сети Модель Органы Скрининговый центр был поддержан через Национальные институты здравоохранения (NIH) Общий фонд (U54 NS093793). H. T. C. была дополнительно поддержана NIH-CNCDP-K12 и NINDS (1K12 NS098482) " , Американской академией неврологии (Неврология исследований грант), Берроуз Wellcome фонд (Карьера премии для медицинских ученых), Детское общество неврологии и детской неврологии фонда ( PERF Elterman грант), и NIH директора ранней независимости премии (DP5 OD026426). М. Ф.В. получил поддержку Фонда Симонса (Премия SFARI: 368479). S. Y. была также поддержана NIH (R01 DC014932), Фондом Симонса (Премия SFARI: 368479), Ассоциацией Альцгеймера (Новый грант исследователей: 15-364099), Наманским семейным фондом фундаментальных исследований и Фондом права Кэролайн Висс в Молекулярная медицина. Конфокальная микроскопия в BCM частично поддерживается NIH Grant U54HD083092 в Центр евразийных и опытно-конструкторских исследований (IDDRC) Neurovisualization Core.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection штаммы для трансгенеза (D. melanogaster)BDSC#24871Специфический реагент: VK33 (3-я хромосома) Инъекционная линия
Инъекционные штаммы для трансгенеза (D. melanogaster)BDSC#24872Специфический реагент: VK37 (2-я хромосома) Линия инъекций
Plasmid DNA
Cloning vectorThermo Fisher#12536-017Специфический реагент: pDONR221
Drosophila вектор трансгенезаПодарок от докторов Йоханнеса Бишофа и Конрада Баслера (Bischof et al., 2013 PNAS)Специфический реагент: pGW-HA.attB
Наборы и реагенты для молекулярной биологии
AgaroseSigma-Aldrich#A2790Специфический реагент: Agarose (класс молекулярной биологии)
Химически компетентные клетки (E. coli)Thermo Fisher#18265017Специфический реагент: DH5α
Набор для экстракции геля ДНКThermo Fisher#K210012Специфический реагент: Набор для экстракции геля PureLink
Набор для выделения и очистки ДНК Qiagen#27104Специфический реагент: QIAprep Spin Miniprep Набор
для высокоточной полимеразыNEBСпецифический реагент: набор для полимеразы Q5 Система
клонирования, опосредованная рекомбиназойThermo Fisher#11789020Специфический реагент: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning systemThermo Fisher#11791100Специфический реагент: Gateway LR Clonase II Набор ферментов
Site Directed Mutagenesis kit Agilent#200523Специфический реагент: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Оборудование, связанное с буровой установкой
ERG AnalysisМолекулярные приборыН/АСпецифический реагент: Axon pCLAMP 10 Пакет программного обеспечения
ERG Сбор данныхLabX#R150358Специфический реагент: ISO-DAM Изолированный биологический амплификатор
Стимулятор ЭРГAstro-Med#S48Специфический реагент: Квадратный импульсный стимулятор
#M0491 ,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870(2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880(2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225(2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l, Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688(2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041(2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , Forthcoming (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905(2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , Forthcoming (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer's Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327(2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , Forthcoming (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), Cambridge, England. 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135(2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189(2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, Clifton, N.J. 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, Clifton, N.J. 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , Forthcoming (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62(2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), Cambridge, England. 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE--Collier/Olf1/EBF--transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21(2012).
  81. Chao, H. -T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097(2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743(2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143(2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing and Wiley-Interscience. New York. (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DrosophilaMARRVELin vivo

Похожие статьи