Здесь мы представляем протокол, который использует инфракрасные красители в сочетании с иммуногистохимии и сканирование с высоким разрешением на белки анализа в областях мозга.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование ближнего инфракрасного флуоресценции и высокого разрешения сканирования для измерения экспрессии белка в мозге грызунов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нейробиология – это изучение того, как клетки головного мозга опосредуют различные функции. Измерение экспрессии белка в нейроне и глии имеет решающее значение для изучения нейронауки, поскольку клеточная функция определяется составом и активностью клеточных белков. В этой статье мы описываем, как иммуноцитохимия может сочетаться с сканированием с высоким разрешением в высоком разрешении, чтобы обеспечить полуколичественное измерение экспрессии белка в отдельных областях мозга. Этот метод может быть использован для одного или двойного выражения белка в том же регионе мозга. Измерение белков в этой моде может быть использовано для получения относительного изменения в экспрессии белка с экспериментальной манипуляции, молекулярные подписи обучения и памяти, активность в молекулярных путей, и нейронной активности в нескольких регионах мозга. Используя правильные белки и статистический анализ, можно также определить функциональную связь между регионами мозга. Учитывая легкость внедрения иммуноцитохимии в лабораторных условиях, использование иммуноцитохимии с инфракрасным сканированием с высоким разрешением может расширить способность нейробиолога рассматривать Нейробиологические процессы на системном уровне.
Введение
Изучение неврологии касается исследования того, как клетки мозга опосредуют специфические функции1. Они могут быть сотовой характер, например, как глии клеток придать иммунитет в центральной нервной системе или может включать эксперименты, которые направлены, чтобы объяснить, как активность нейронов в спинной гиппокамп приводит к пространственной навигации. В широком смысле, клеточная функция определяется белками, которые выражаются в клетке и активностью этих белков2. В результате измерение экспрессии и/или активности белков в клетках головного мозга имеет решающее значение для изучения нейронауки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Следующий протокол был утвержден институциональным Комитетом по уходу и использованию животных (ИАКУК) университета штата Делавэр. Для этого протокола были использованы мужчины-крысы Спраг даули, приблизительно 55 – 75 дней.
1. Извлечение мозга и тканевые приготовления
- Обезболивание крыс с изофлуран в анестезии индукционной камере, пока крыса больше не проявляет ответ на ногу щепотку.
- Жертва крыс через быстрое обезглавливание использованием гильотины.
- Вырезать кожу на черепе задней передней и ясно сверху черепа.
- Использование rongeурс для тщательного удаления задней части черепа, а затем с помощью неб....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Перед использованием сканирования с высоким разрешением для иммуногистохимии, необходимо убедиться, что протокол работает. Это может быть достигнуто с помощью анализа проверки, где отделы мозга от одного и того же животного инкубировали с первичными и вторичными антителами, вторичным антителом только, или ни первичного, ни вторичного антитела. Результаты для такого анализа проверки отображаются на рисунке 2. В этой реакции мы были обнаружения немедленного ран.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Результаты, представленные в этой статье, показывают, что почти инфракрасная иммуноцитохимия в сочетании с сканированием с высоким разрешением может быть использована для получения полуколичественного измерения экспрессии белка в тканях головного мозга. Он также может быть использован для обозначения двух белков одновременно в одной и той же области мозга. Мы ранее использовали околоинфракрасную иммуногистохимию для измерения немедленного раннего экспрессии генов в нескольких регионах мозга9,.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Исследование в этом отчете финансировалось за счет целевого гранта от NIГРОССМЕЙСТЕРОВ (1P20GM103653), присужден ДК.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| для экстракции | |||
| Kent Scientific | VetFlo-0530SM | ||
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | используется для удаления задней части черепа |
| Деликатные препарирующие ножницы | Fischer Scientific | 08-951-5 | используется для разреза вверх по средней линии черепа |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | используется для вычерпывания мозга |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Иммуногистохимическая реакция | |||
| Triton X-100 | Используется в качестве мягкого моющего средства для проникновения клеток после фиксации в параформальдегиде, также используется в качестве мягкого моющего средства в сочетании с сывороткой хозяина и вторичными антителами. | ||
| Tween-20 | Используется в качестве небольшого количества моющего средства, добавляемого в TBS для получения TBS-T после покровного скольжения слайдов с первичным антителом | ||
| Licor Odyssey сканер | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Фотостудия | Licor Biotechnology Inc. |
Ссылки
- Kandel, E. R. Principles of Neural Science. , McGraw Hill. New York. (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , Academic Press/Elsevier. (2009).
- Salami, A., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
