Методическая статья

Применение биослойной интерферометрии (BLI) для изучения белково-белковых взаимодействий в транскрипции

DOI:

10.3791/59687

⸱

26 июля 2019 г.

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Robert Wood Johnson Medical School, Rutgers University, 2Graduate Program in Physiology and Integrative Biology, School of Graduate Studies, Rutgers University, 3Department of Plant Biology, School of Environmental and Biological, Rutgers University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Взаимодействие транскрипционных факторов (TFs) с РНК-полимеразой обычно изучается с помощью анализов свау. Мы применяем технологию биослойной интерферометрии (BLI) для характеристики взаимодействия GrgA с хламидиальной РНК-полимеразой. По сравнению с анализами стягивания, BLI обнаруживает ассоциацию и диссоциацию в реальном времени, обеспечивает более высокую чувствительность и является высокой количественной.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фактор транскрипции (TF) является белок, который регулирует экспрессию генов, взаимодействуя с РНК-полимераза, другой TF, и / или шаблон ДНК. GrgA является новым активатором транскрипции, найденным специально в облике внутриклеточного бактериального патогена Хламидиоз. Белковые анализы с использованием бисера сродства показали, что GrgA связывает два фактора, а именно:66 и28,которые распознают различные наборы промоутеров для генов, продукты которых по-разному необходимы на стадиях развития. Мы использовали BLI для подтверждения и дальнейшей характеристики взаимодействий. BLI демонстрирует несколько преимуществ по сравнению с выдвижной: 1) Он показывает в режиме реального времени ассоциации и диссоциации между обязательными партнерами, 2) Он генерирует количественные кинетические параметры, и 3) Он может обнаружить привязки, что выдвижной анализы часто не обнаруживаются. Эти характеристики позволили нам вывести физиологические роли GrgA в регуляции экспрессии генов в хламидиозе,и возможные подробные механизмы взаимодействия. Мы представляем, что эта относительно доступная технология может быть чрезвычайно полезна для изучения транскрипции и других биологических процессов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Транскрипция, которая производит молекулы РНК с использованием ДНК в качестве шаблона, является самым первым шагом экспрессии генов. Бактериальный синтез РНК начинается после связывания РНК-полимераза(RNAP) голефермента к целевому промоутеру 1,2. Голензим RNAP (RNAPholo) состоит из многосубунитая каталитического ядра (РНАПкор) и коэффициента, который необходим для распознавания последовательности промотора. Активаторы и репрессоры транскрипции, которые в совокупности называются TFs, регулируют экспрессию генов через связывающие компоненты РНАПКОР, факторы и/или ДНК. В зависимости от организма, значительная часть его генома может быть посвящена TFs, которые регулируют транскрипцию в ответ на физиологические потребности и экологические сигналы3.

Хламидиоз является обликовой внутриклеточной бактерией, ответственной заразличные заболевания у людей и животных 4,5,6,7. Например, Chlamydia trachomatis, возможно, номер один венерических патогенов в организме человека во всем мире, и ведущей причиной слепоты в некоторых слаборазвитых странах4,5. Хламидиоз имеет уникальный цикл развития, характеризующийся двумя чередующимися клеточными формами, терминированными элементарным телом (EB) и ретикулированным телом (RB)9. В то время как ЭБ способны выжить во внеклеточной среде, они неспособны к распространению. EBs ввести клетки хозяина через эндоцитоз и дифференцировать в более большие RBs в vacuole в цитоплазме хозяина в течение нескольких часов после прививки. Больше не заразны, RBs размножаться через двоичные деления. Около 20 ч, они начинают дифференцировать обратно к EBs, которые выходят из клеток-хозяев около 30-70 ч.

Прогрессирование цикла развития хламидийного регулируется транскрипцией. В то время как супербольшинство из почти 1000 генов хламидийных выражены во время среднего цикла, во время которого РБ активно реплицируются, только небольшое количество генов транскрибируются сразу после вступления EBs в клетки-хозяина, чтобы инициировать преобразование EBs в RBs, и другой небольшой набор генов транскрибируются или все чаще транскрибируются, чтобы дифференциация РБ в EBs10,11.

Геном хламидийного кода кодирует три фактора, а именно:66,28 и54. 66 , что эквивалентно ведению домашнего хозяйстваNo 70 кишечной палочки и других бактерий, отвечает за распознавание промоторов генов раннего и среднего цикла, а также некоторых поздних генов, в то время как для распознавания генов раннего и среднего цикла требуется28 и54 евро транскрипция некоторых поздних генов. Несколько генов, какизвестно, несут как No 66-зависимых промоутер и No 28-зависимых промоутер12.

Несмотря на сложный цикл развития, лишь небольшое количество TFs были найдены в хламидиоза13. GrgA (ранее аннотированный как гипотетический белок CT504 в C. trachomatis serovar D и CTL0766 в C. trachomatis L2) является Chlamydia-специфическимTF, первоначально признанным активатором генов No 66-зависимых14. Аффинити вытягивания анализы показали, что GrgA активирует их транскрипции, связывая какNo 66 и ДНК. Интересно, что позже было найдено с тем, что GrgA также совместно осаждает с28, и активирует транскрипцию от 28-зависимых промоутеров in vitro15. Чтобы исследовать, имеет ли GrgA сходные или различные сходства дляNo 66 иNo 28,мы прибегли к использованию BLI. BLI анализы показали, что GrgA взаимодействует сNo 66 в 30-кратном более высоком сродстве, чем с28,предполагая, что GrgA может играть дифференцированные роли в 66-зависимой транскрипции и28-зависимойтранскрипции 15.

BLI обнаруживает интерференционную модель белого света, которая отражается от слоя обездвиженого белка на кончике биосенсора, и сравнивает его с внутренним эталонным слоем16. Благодаря анализу этих двух интерференционных моделей, BLI может предоставить ценную и в режиме реального времени информацию о количестве белка, привязанного к кончику биосенсора. Белок, который обездвижен к кончику биосенсора, называется лигандом и, как правило, обездвижен с помощью общего антитела или эпитопа (например, поли-Его- или биотин-тег), который имеет сродство к ассоциированной частицы (например, NTA или Стрептавидин) на кончике биосенсора. Связывание вторичного белка, называемого анализным, с лигандой на кончике биосенсора создает изменения в непрозрачности биосенсора и, следовательно, приводит к изменениям в интерференционных моделях. При повторении в течение различных концентраций аналита, BLI может предоставить не только качественную, но и количественную информацию о сродстве между лигандом и аналитом16.

Насколько нам известно, мы были первыми, кто использовал BLI для характеристики белково-белковых взаимодействий в транскрипции15. В этой публикации мы демонстрируем, что фрагмент GrgA,который ранее был показан как необходимый для 28-связной, действительно опосредует привязку. Данная рукопись посвящена шагам анализов BLI, а также генерации графиков BLI и параметров связывающей кинетики. Методы производства (и очистки) лигандов и аналитов здесь не охватываются.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка белков

  1. Используйте диализный мешок (с соответствующим размером отсечения) для диализа каждого белка, который будет использоваться для анализов BLI (включая лиганд с его тегами и анализ) против 1000 томов буфера BLI (25 мм Tris-HCl, 150 мм NaCl, 0,1 мМ EDTA, 10 мм 2Cl , 0,1 мм DTT, pH 8.0, предварительно охлажденный до 4 градусов по Цельсию) при 4 C для 4 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: BLI анализы требуют лиганд присутствовать в концентрациях, которые насыщает связывающих сайтов на биосенсорине и анализ, чтобы быть высоко очищены так, что моляры концентрации анализ, которые реагируют с лигандом известно. Методологии выражения и очищения белков, отмеченных его и стрептными, здесь не освещаются, но можно найти в предыдущих публикациях14,15. Хотя эта система не требует, чтобы лиганд был в высокоочищенной форме, важно диализировать даже неочищенные лиганды в буфер BLI, чтобы свести к минимуму сдвиги в бело-световых помех, вызванных любыми изменениями буфера во время асссе.
  2. Переключитесь на свежий буфер BLI и продолжайте диализ еще 4 ч.

2. Установка биосенсора и асссеивания

  1. Приблизительно за 10 минут до начала ассоциации пипетка 200 л буфера BLI в трубку ПЦР.
  2. Удалите Ni-NTA-биосенсор из оригинальной упаковки, удерживая широкую часть биосенсора с помощью руки в перчатках.
  3. Поместите биосенсор над ПЦР-трубкой так, чтобы только стеклянная кончик биосенсора погружалась в буфер BLI.
  4. Держите наконечник биосенсора погруженным в воду, по крайней мере 10 минут, чтобы обеспечить полную гидратацию.
    1. Убедитесь, что стеклянный кончик Ni-NTA-биосенсора не касается ничего, кроме буфера BLI во время вышеуказанного шага.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует Ni-NTA-биосенсор в сочетании с его тегами лиганд. При необходимости, SA-Streptavidin-биосенсор может быть использован в сочетании с биотинилатамиличенной лиганд вместо этого, если: (i) как лиганд и analyte нести Его теги или (ii) ни один из них не делает.
  5. Включите машину BLItz.
  6. Убедитесь, что машина подключена к компьютеру через порт вывода данных USB в задней части машины.
  7. На компьютере откройте связанное с этим программное обеспечение (например, BLItz Pro) и нажмите на Advanced Kinetics на левой стороне экрана.
  8. На программном обеспечении введите всю соответствующую информацию об эксперименте (включая название эксперимента, описание, идентификатор образца и концентрацию белка) под каждым соответствующим заголовком.
  9. Нажмите на тип Biosensor и выберите Ni-NTA из выпадающего меню.
    1. Под заголовком «Параметры запуска» убедитесь, что шейкер настроен на включение.
    2. Под заголовком «Список типов шагов» убедитесь, что в списке 5 элементов: начальный базовый упор, загрузка, базовый универсал, ассоциация и диссоциация.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность каждого шага может быть изменена по умолчанию по мере необходимости. Для достижения оптимальных результатов используйте минимум 30 с для начального базового и базового уровня; и 120 с для ассоциации и диссоциации. Продолжительность шага загрузки (от 120 до 240 с) будет зависеть от концентрации лиганда и сродства тега Его эпитопа на лиганде к Ni-NTA-биосенсору.
  10. Удалите гидратированный Ni-NTA-биосенсор из трубки ПЦР и прикрепите его к биосенсорному креплению на машине, сдвинув широкую часть биосенсора на крепление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте биосенсор высохнуть во время эксперимента.
  11. Поместите в него черную микроцентрифуговую трубку 0,5 мл в держатель трубки машины и пипетку 400 л буфера BLI.
  12. Убедитесь, что ползунок машины расположен таким образом, что держатель трубки расположен перед черной стрелкой на машине.
  13. Закройте крышку машины так, чтобы наконечник биосенсора погружался в буфер в микроцентрифуговой трубке.
  14. Нажмите далее на программное обеспечение, чтобы начать запись исходного базового.

3. Загрузка лиганда на биосенсор

  1. После того, как начальный базовый шаг закончил запись, откройте обложку машины.
  2. Переместите ползунок вправо так, чтобы держатель капли (вместо держателя трубки) располагался перед черной стрелкой.
  3. Пипетка 4 л диализированного лиганда (от шага 1.1) на держатель падения и закройте крышку машины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация лиганда, который будет использоваться может варьироваться для каждого белка. Концентрация от 1,0 до 2,0 мг/мл обычно достаточна для насыщения NTA на кончике биосенсора в 240 с.
  4. На программное обеспечение, нажмите Далее, чтобы начать загрузку.

4. Стирка дополнительного лиганда

  1. После того, как шаг загрузки закончил запись, откройте обложку машины.
  2. Переместите ползунок влево так, чтобы держатель трубки вновь находился перед черной стрелкой.
  3. Закройте крышку машины и убедитесь, что кончик биосенсора погружается в буфер BLI трубки в держателе трубки.
  4. Нажмите Далее еще раз на программное обеспечение, чтобы начать запись базового.

5. Ассоциация аналита к лиганду

  1. После того, как базовый шаг закончил запись, откройте обложку машины.
  2. Удалите держатель капли и очистите его, промывив любой белок и промыв его двойной деионизированной водой (ddH2O) в общей сложности 5 раз.
    1. Используйте салфетку, чтобы очистить поверхность держателя капли после мытья.
  3. Замените держатель капли обратно на машину.
  4. Переместите ползунок на машине вправо так, чтобы держатель капли снова находился перед черной стрелкой.
  5. Пипетка 4 Зл диализированного аналита (от шага 1.1) на держатель падения и закройте крышку машины.
  6. На программное обеспечение, нажмите Далее, чтобы начать ассоциации.

6. Диссоциация аналита от лиганд

  1. После того, как шаг Ассоциации закончил запись, откройте обложку машины.
  2. Переместите ползунок на машине вправо так, чтобы держатель трубки вновь располагался перед черной стрелкой.
  3. На программном обеспечении, нажмите Далее, чтобы начать диссоциацию.
  4. После того, как шаг диссоциации закончил запись, откройте обложку машины.
  5. Удалите держатель капли и трубку держатель.
  6. Промыть как с ddH2O тщательно смыть любой белок.
  7. Удалите биосенсор и отбросьте его безопасно.

7. Повторяющиеся взаимодействия с различными концентрациями

  1. Повторите шаги 2-7 для одной и той же пары лиганд-аналитов, используя различные концентрации аналита.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация аналита, возможно, потребуется скорректировать на нескольких трассах, прежде чем получить оптимальные результаты. По нашему опыту, соотношение 1:5:10 концентраций анализов, начиная с 75 нм, обычно является адекватным.

8. Анализ данных с помощью программного обеспечения

  1. После того, как все запуски закончились, сохранить данные о программном обеспечении, нажав файл, а затем сохранить эксперимент, как на левой стороне экрана.
  2. Под заголовком Run Data выберите «Коррекция шагов» и «Фиттинг» (1:1) и нажмите «Анализ» для генерации кинетической передачи данных.
  3. Чтобы извлечь количественные данные в лист и создать графики, нажмите на Экспорт в CSV и сохраните записанные данные в виде файла .csv. Откройте файл .csv с помощью программного обеспечения электронной таблицы.
    1. Чтобы наиболее эффективно показать кинетику Ассоциации и Диссоциации, удалите все точки участка до базового шага и нормализуй все последующие точки участка из конечного базового значения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Через BLI анализы, мы ранее установили, что связывание GrgA доNo 28 зависит от 28 аминокислот среднего региона (остатки 138-165) GrgA15. Соответственно, по сравнению с N-терминально Его помечены полной длины GrgA (NH-GrgA), GrgA удаления конструкции не хватает этого региона (NH-GrgA-138-165) было снижение ассоциации ставка и увеличение диссоциации, что приводит к 3 миллионов раз потери общего сродство (Таблица 1). Здесь мы демонстрируем, что эта средняя область непосред...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белково-белковые взаимодействия имеют решающее значение для регуляции транскрипции и других биологических процессов. Они наиболее часто изучаются с помощью анализов свайпов. Хотя анализы вытягивания относительно легки для выполнения, они плохо количественные и могут не обнаружить слабые, но биологически значимые взаимодействия. Для сравнения, путем обнаружения в режиме реального времени ассоциации и диссоциации между лигандой и аналит, BLI обеспечивает ассоциации и диссоциации скорость константы, а также, общее сродство....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (Гранты AI122034 и AI140167) и Фондом здравоохранения Нью-Джерси (Грант 20-18).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аппарат BLItzForteBio45-5000
Диализная трубка целлюлозная мембранаMilliporeSigmaD9652
Лоток для биосенсора Ni-NTAForteBio18-5101Готовые к использованию биосенсоры Ni-NTA для белков с поли-His-меткой
Держатель каплиForteBio45-5004
ПЦР пробирки (0,2 мл)Thomas Scientific
Микроцентрифужные пробирки (черные)Thermo Fisher Scientific03-391-166
KimwipesThermo Fisher Scientific06-666A
DTTThermo Fisher ScientificR0861
EDTAMilliporeSigmaE6758
MgCl2MilliporeSigmaM8266
NaClMilliporeSigmaS9888
Tris-HClGoldBioT095100
CLS6571

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
  2. Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
  3. Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
  4. Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H. Trachoma. Lancet. 384 (9960), 2142-2152 (2014).
  5. WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
  6. Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
  7. De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
  8. Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
  9. Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I. Chlamydia. Nature Review of Microbiol. 2 (7), 530-531 (2004).
  10. Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
  11. Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
  12. Tan, M. Intracellular pathogens I: Chlamydiales. Tan, M., Bavoil , P. M. , ASM Press. 149-169 (2012).
  13. Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
  14. Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
  15. Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
  16. Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
  17. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
  18. Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
  19. Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
  20. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
  21. Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
  22. Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
  23. Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
  24. Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175(2016).
  25. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383(2014).
  26. Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ChlamydiaGrgANTA

Похожие статьи