Методическая статья

Поколение опухолевых органоидов из генетически модифицированных моделей мыши рака простаты

DOI:

10.3791/59710

⸱

13 июня 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology & Therapeutics, Roswell Park Comprehensive Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы показываем метод для некропсии и вскрытия моделей рака простаты мыши, фокусируя на рассечении опухоли простаты. Также представлен пошаговой протокол для генерации органов опухоли предстательной железы мыши.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы, основанные на гомологионной рекомбинации для изменения генов, значительно способствовали биологическим исследованиям. Генетически модифицированные модели мыши (GEMMs) являются строгим методом для изучения развития млекопитающих и болезней. Наша лаборатория разработала несколько GEMMs рака предстательной железы (PCa), которые не имеют выражения одного или нескольких генов супрессора опухоли с помощью сайта конкретных Cre-loxP рекомбиназы системы и простаты конкретных промоутер. В этой статье мы описываем наш метод некропсии этих PCa GEMMs, в первую очередь упором на вскрытие опухолей простаты мыши. Новые методы, разработанные за последнее десятилетие, облегчили культуру клеток, полученных из эпителии, для моделирования систем органов в пробирке в трех измерениях. Мы также подробно 3D-метод культуры клеток для генерации опухолевых органоидов из мыши PCa GEMMs. Доклинические исследования рака были доминируют 2D-клеточной культуры и клеточной линии полученных или пациента полученных ксенотрансплантата моделей. Эти методы не хватает микроокружения опухоли, ограничение использования этих методов в доклинических исследованиях. ГЕМмы более физиологически значимы для понимания опухолевого и рака прогрессии. Опухолевая органоидная культура представляет собой систему модели in vitro, которая резюмирует архитектуру опухоли и характеристики клеточной линии. Кроме того, методы 3D-культуры клеток позволяют расти нормальных клеток для сравнения с культурами опухолевых клеток, редко возможно, используя методы 2D-клеточной культуры. В сочетании, использование GEMMs и 3D-клеточной культуры в доклинических исследованиях имеет потенциал для улучшения нашего понимания биологии рака.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С конца 1980-х годов способность изменять гены с помощью гомологичных рекомбинаций значительно продвинула изучение биологических систем1. Индуцированные, ткани- или клеточные промоторные системы и конкретные рекомбиназы, такие как Cre-loxP, продвинули генетические исследования, облегчая контроль над генетическими модификациями как в и временно, так и пространственно2,3, 4. Сочетание этих генетических стратегий создало широкийспектр экспериментальных модельных систем 5,6,7.

Генетически модифицированные модели мыши (GEMMs) являются неотъемлемым инструментом для оценки того, как отдельные гены или группы генов влияют на развитие млекопитающих и болезни. В доклинических исследований рака, GEMMs являются наиболее физиологически релевантных и строгий метод для изучения развития рака, прогрессирование, и лечение8. Наша лаборатория специализируется на генерации и характеристике гЕММ рака.

Наиболее диагностируется некочее рак среди мужчин в Соединенных Штатах является рак простаты (PCa). Большинство пациентов с PCa имеют низкий риск заболевания и высокую вероятность выживания, но выживаемость резко снижается, когда болезнь диагностируется на поздних стадиях или если целевая гормональная терапия вызывает прогрессирование к агрессивной, неизлечимой PCa подтипы9,10. Наша лаборатория разработала GEMMs, которые используют флоксированные аллели одного или нескольких генов супрессоров опухолей. Рекомбинация и потеря экспрессии гена супрессора опухоли происходит именно в предстательной железе, потому что мы ввели трансген с рекомбиназой Cre вниз по течению пробосин промотор активирован только в эпителиальных клетках простаты11, 12. Мы также разводили наши GEMMs содержать Cre репортер трансген называется mT/mG, который вызывает томатфлуалистое выражение белка в клетках, не хватает Cre и зеленый флуоресцентный белок (GFP) выражение в клетках с Cre13. В то время как презентация этого метода и наши репрезентативные результаты показывают, что GEMMs, которые мы изучаем в нашей лаборатории, этот протокол может быть использован для генерации органов рака простаты из любой модели мыши. Однако, как подробно обсуждается в нашем разделе репрезентативных результатов, мы заметили, что определенные характеристики опухоли являются оптимальными для генерации органов орака простаты.

В последнее десятилетие, новые методы культивирования клеток из тканей эпителиального происхождения привело к значительным достижениям в нашей способности моделировать системы органов в пробирке14,15. Термин "культура 3D клеток" был отнесен к методам, участвующим в создании и поддержании органоидов, которые могут быть определены как структуры, состоящие из клеток, которые собирают вторичную архитектуру, движимую органно-специфической линией клеток характеристики16. Эти новые методы отличаются от классической 2D-клеточной культуры в том, что клетки не требуют трансформации или увековечения для долгосрочного роста; таким образом, 3D культуры нормальных клеток можно сравнить с больными клетками. Это особенно ценно в исследованиях рака, где нормальные культуры контроля клеток, как правило, не были доступны. Кроме того, органоиды спонтанно образуют вторичные архитектуры тканей с соответствующим дифференцированным типом клеток, что делает их лучшей модельной системой для понимания рака в пробирке, чем 2D-клеточные линии17. Наша лаборатория создала 3D органоидные линии из опухолевого вопроса, изолированных от наших PCa GEMM, чтобы дополнить наши данные in vivo и проводить эксперименты, которые не были бы осуществимы в GEMMs.

В этой статье мы представляем письменные и визуальные протоколы для полной некропсии PCa GEMMs, включая вскрытие различных долей простаты мыши и метастатических поражений. Мы описываем и показываем пошаговой метод генерации органоидов из опухолей простаты мыши на основе протокола, ранее опубликованного Drost et al. для получения органоидов из нормальной эпителиальной ткани простаты мыши18.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедуры для животных, описанные здесь, были выполнены с одобрения Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) в Департаменте лабораторных ресурсов животных, Розуэлл Парк Всеобъемлющий онкологический центр, Буффало, Нью-йорк.

ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей,которые должны быть вскрыты, чтобы изолировать простаты или опухоли простаты для поколения органоидов должны иметь по крайней мере достигли возраста половой зрелости - около 8-10 недель возраста. Конкретные возрасты мышей могут варьироваться среди исследований. Некоторые факторы, чтобы рассмотреть при выборе возраста включают возрастные изменения в популяциях клеток простаты, возрастно-зависимых выражение конкретных промоутер-управляемых Cre трансгенов, и скорость прогрессирования опухоли простаты в частности GEMM.

1. Рассечение и визуализация мыши простатыОпухоль и метастатические опухоли

  1. Препараты
    1. Получить необходимые стерильные инструменты вскрытия. Область рассечения сцены на чистой стерильной поверхности с 15-сантиметровой линейкой, точным балансом, аналитическим балансом, баллончиком с 70% этанолом, фосфо-буферным сольней (PBS) и бумажными полотенцами.
    2. Подготовка фиксаторных растворов для висцеральных органов и костей, которые не будут использоваться для генерации органоидов
      1. Для висцеральных органов: Подготовка 4% параформальдегида (PFA) в PBS. Для одной мыши, сделать 20 мл 4% PFA, aliquot в двух 15 мл конических труб и держать при комнатной температуре до использования.
      2. Для длинных костей: Aliquot 10 мл предварительно сделанного 10% нейтрального буферизированного формалина (NBF) в одной конической трубке 15 мл и держать при комнатной температуре до использования.
    3. Получить необработанные 10 см посуды и заполнить с нестерильной PBS - они будут служить в качестве временных контейнеров для органов во время тонкого вскрытия с помощью рассечения микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные инструменты используются для вскрытия тканей для генерации органоидов. Нестерильные инструменты используются для первоначального разреза и вскрытия задних конечностей.
  2. Эвтаназия и первоначальный разрез
    1. Эвтанизировать мышь co2 удушья с помощью 2,0 л / мин скорость потока в течение 5 мин. Удалить мышь из клетки и выполнить вывих шейки матки. Используйте точный баланс для измерения массы тела мыши и записи.
    2. Поместите мышь на верхней части бумажного полотенца и сориентироваться на вскрытии поверхности брюшной стороны вверх с головой мыши лицом от следователя. Прикрепите мышь к доске, протянув ее конечности и пронзив каждую из передних лап и задних лап одной одноразовой иглой.
    3. Используя баллончик, облить мех мыши 70% этанола. Использование нестерильных вскрытия ножницы и прямые щипцы, щепотку чуть выше пениса мыши и сделать небольшой разрез только через мех.
    4. Продолжить разрез средней линии до шеи мыши через мех только. Делайте двусторонние разрезы с точки первоначального разреза через вентральную плоскость мыши только через мех.
    5. Возьмите мех и осторожно вытащите его от кожи мыши. Прикрепите мех к доске, чтобы обеспечить доступ как к брюшной, так и к грудной полости.
  3. Извлечение мужской урогенитальной системы в блоке
    1. Используя стерильные ножницы для вскрытия и прямые щипцы, аккуратно прорежьте кожу на 0,75 см над прямой кишкой. Продолжить разрез средней линии до грудной клетки, не нарушая каких-либо органов в брюшной полости. Аккуратно вытяните кожу и прикрепите к доске, чтобы разоблачить всю брюшную полость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте этим инструментам прикасаться к внешней стороне мыши или любой поверхности в промежуточной области, так как эти ткани будут использоваться для генерации органоидов.
    2. Вскрыть урогенитальной системы и других органов в соответствии с диаграммой на рисунке 1А, с цифрами, указывающими порядок органов будут удалены из мыши.
    3. Найти мочевой пузырь, а затем схватить жира площадку либо влево или вправо и потяните вверх, чтобы разоблачить яичко. Тщательно вскрыть яичко от остальной части урогенитальной области и отложить в сторону. Сделайте ту же процедуру на другой стороне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Достижение оптимального качества тканей и детальная характеристика опухоли опухолей простаты требует, чтобы вся урогенитальная область была удалена из мыши en bloc19. Рекомендуется сначала удалить урогенитальную область(рисунок 1А).
    4. Возьмитемо мочевой пузырь и осторожно подтяните так, чтобы урогенитальный регион поднимался вместе, обнажая уретру под ним. Во время проведения мочевого пузыря, ориентировать ножницы, чтобы они против нижней части нижней части нижней простаты и сократить уретры. Затем вся урогенитальная область высвобождена из брюшной полости.
    5. Положите урогенитальной области в 10 см блюдо заполнено PBS. Если все еще заполнены с мочой, слейте мочевой пузырь, сделав небольшой разрез. Используя аналитический баланс, взвесьте урогенитальную систему и записи.
  4. Удаление тазовых лимфатических узлов, селезенки, печени, почек, легких, голени и бедренной кости
    1. Удаление урогенитальной системы подвергает тазовых лимфатических узлов, расположенных прямо за урогенитальной системы(Рисунок 1А) и по обе стороны позвоночника. Лимфатические узлы будут видны только в том случае, если они содержат метастатические поражения или если есть местное воспаление. Ориентируйте прямые щипцпод лимфатические узлы и подтяните, чтобы удалить лимфатический узла. Сделайте ту же процедуру на другой стороне.
    2. Возьмитесь за прямую кишку прямыми щипками и вырежьте. Потяните на прямую кишку, чтобы разгадать всю толстую кишку и тонкий кишечник, ища метастатические поражения в мезентеричных лимфатических узлах. Когда весь илеум удаляется, продолжайте тянуть на двенадцатиперстной кишки, чтобы разоблачить желудок. Вырезать пищевод, чтобы полностью удалить желудок и отказаться. При обнаружении каких-либо метастатических поражений в лимфатических узлах тщательно вскрывайте его в кишечнике и храните в 10-сантиметровой тарелке PBS.
    3. Разоблачение и удаление желудка будет тянуть селезенку из стороны плечевого(Рисунок 1А). Удалить селезенку и поместить в 4% PFA. Селезенка служит в качестве контроля окрашивания для гемотоксилин, как это очень клеточной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Висцеральные ткани, которые не будут использоваться для генерации органоидов, будут фиксироваться на ночь в 4% ПФА, промывают pbS, а затем помещаются в 70% этанола.
    4. Удалите печень в верхней части живота(рисунок 1А). На основе метастатической нагрузки в печени, отдельные доли могут быть вскрыты, или вся печень может быть удалена путем тщательного разрезания вдоль диафрагмы. (Не прорезать диафрагму в это время). Поместите печень в 10 см блюдо PBS.
    5. Удаление печени будет полностью подвергать почки по обе стороны от позвоночника(Рисунок 1А). Удалите почки - вместе с почечными лимфатическими узлами, если узлы имеют метастатические поражения - путем размещения прямых щипцов под почку и потянув вверх. Сделайте ту же процедуру для другой стороны.
    6. Чтобы разоблачить грудную полость, осторожно вырежьте диафрагму вдоль грудной клетки. Пирсинг диафрагмы выпустит отрицательное давление в грудной полости и подвергать сердца и легких(рисунок 1A).
    7. Возьмитесь за грудину и подтяните, чтобы открыть грудную полость дальше. Наблюдайте вентральное лицо грудной полости вдоль грудной клетки для метастатических поражений в грудных лимфатических узлах и вскрыть, если присутствует.
    8. В то время как все еще держа грудину, отрезать вентральную грудную клетку, чтобы получить доступ к сердцу и легким. Возьмитесь за сердце, подтяните и порежете под легки. Чтобы полностью удалить сердце и легкие ан блок, вырезать все передние кровеносные сосуды и трахеи. Поместите ткани в PBS и тщательно удалить сердце, не повреждая легочной ткани или метастатических поражений легких.
    9. Возьмите нестерильные прямые щипцы и рассекая ножницы и отрежьте заднюю ногу на голове бедренной кости. Аккуратно схватить бедренную кетю и удалить заднюю ногу из меха.
    10. Поместите заднюю ногу на бумажное полотенце и схватите заднюю лапу. Используйте одногранное лезвие бритвы, чтобы снести/ отрезать все мышцы и соединительную ткань из голени и бедренной кости. Удалите бедренную кишка из голени, разрезая заднюю к коленной чашечки и удалить голени, удалив заднюю лапу. Поместите голени и бедренной кости в 10% NBF. Сделайте ту же процедуру на другой стороне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения длинных костей мыши на метастатические поражения, малоберцовой кости не нужно нетронутыми. Длинные кости будут зафиксированы в 10% NBF в течение одной недели, а затем декалькированные с помощью нейтрального решения EDTA20. Через три недели кости будут переведены на 70% этанола.
    11. После удаления задних конечностей, принять ухо или хвост резки для будущего генотипирования. Откажитесь от туши мыши и всей ткани, чтобы не быть фиксированной или использовать для генерации органоидов.
  5. Рассечение опухоли предстательной железы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассечение долей простаты мыши может быть достигнуто только с помощью рассекающего микроскопа19. Тем не менее, нагрузка опухоли простаты может быть настолько высока, что отдельные доли не могут быть различимы, и вскрытие может быть проведено без микроскопа. Тем не менее, полный протокол для вскрытия отдельных долей простаты описан ниже.
    1. Поместите урогенитальную область в 10-сантиметровую тарелку PBS под рассекающим микроскопом и ориентируйте вентральную сторону вверх с мочевым пузырем и семенными пузырьками, обращенными в сторону от следователя. Все манипуляции урогенитальной области должны быть сделаны с использованием стерильных инструментов.
    2. Оцените общий фенотип опухоли предстательной железы- скорее всего, либо заполненные жидкостью или твердые опухоли будут наблюдаться в PCa GEMMs(Рисунок 2A, B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заполненные жидкостью опухоли часто расположены в передней области простаты(рисунок 2A). Заполненные жидкостью опухоли состоят в основном из соединительной ткани с скудными эпителиальными компонентами - таким образом, эти опухоли не являются оптимальными для генерации органоидов из-за низкого количества опухолевых эпителиальных клеток, как будет обсуждаться в репрезентативных результатах Разделе.
    3. Если заполненные жидкостью опухоли присутствуют, тыкать небольшое отверстие в опухоли. Поместите урогенитальную область в новую 10-сантиметровую тарелку PBS.
    4. Возьмите пару прямых щипц в недоминирующей руки и изогнутые щипцвы в доминирующейрукой. Переверните урогенитальную область на его вдовое лицо. Ищите проксимальной области простаты(Рисунок 1B), которые могут быть определены розовый / красный цвет уретры. Возьмитесь за мочеиспускательный уретру и крепко удерживайте, чтобы манипулировать урогенитальной тканью с помощью изогнутых щипц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время вскрытия простаты, всегда принимать к сведению расположение мочевого пузыря, так как это самый простой способ найти отдельные доли простаты(Рисунок 1B).
  6. Удаление тканей непроста из урогенитальной области
    1. Пока еще на подошве урогенитальной области, найдите основание семенной везики. Тщательно удалите семенной везикулы и отбросьте. Выполните ту же процедуру на противоположной стороне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прокола семенной везикулы, так как это выпустит липкую и непрозрачую секреторную жидкость, которая мешает вскрытию простаты. Если семенной везикул проколот, перенесите оставшуюся урогенитальную область в новую 10-сантиметровую тарелку со свежим PBS.
    2. Удалите и отбросьте ваз deferens и столько жирной и соединительной ткани, как это возможно, используя изогнутую сторону щипцы.
    3. Хотя по-прежнему твердо проведения уретры / проксимальной области простаты, использовать пару штрафа, отметил ножницы, чтобы удалить мочевой пузырь из уретры.
  7. Изоляция отдельных долей простаты
    1. Найдите переднюю проста(рисунок 1B). Убедитесь в твердом удержании проксимальной области простаты / уретры с прямыми щипками. Удалите передней области простаты, непосредственно захватывая ткани с изогнутой стороны щипки и твердо потянув его от мочевого пузыря и остальной части простаты. Поместите ткани в PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех регионов простаты, рассекающие ножницы могут потребоваться для удаления ткани, в зависимости от размера опухоли.
    2. Найдите область брюшной простаты(рисунок 1B). Удалите область брюшной простаты так же, как и в шаге 1.5.7.
    3. На данный момент в вскрытии, только боковые и дорсальные области простаты должны присутствовать, в то время как проксимальная область простаты все еще захватывается прямыми щипцы. Оцените боковые и дорсальные области простаты(рисунок 1B). Если боковой регион можно отличить от области вдовне, удалите боковой область простаты, как описано в шаге 1.5.7. Сделайте ту же процедуру на противоположной стороне.
    4. Удалите область предстательной железы, как описано в шаге 1.5.7. Поместите проксимальную область простаты в 4% ПФА, так как его структура в мышечной ткани уретры делает его непригодным для генерации органоидов.

2. Поколение 3D органоидов из опухолевых тканей простаты

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3 показано живописное описание процедуры генерации опухолевых органоидов.

  1. Подготовка
    1. Подготовка мыши простаты органоидов средств в соответствии с Drost и др.18 со следующими изменениями. Используйте кондиционированную среду вместо рекомбинантных белков для Ноггина и R-Спондина и используйте окончательную концентрацию 1% (v/v), вместо 10%, как для Noggin- и R-Spondin-кондиционированной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: HeK293 клетки заступничество трансфицируется HA-мышь Noggin-Fc или HA-мышь Rspo1-Fc используются для производства Noggin- или R-Spondin-кондиционированных среды, соответственно. Эти клеточные линии были подарком от лаборатории Кальвина Куо в Стэнфордском университете.
    2. Приготовьте раствор пищеварения в трубке 15 мл, разбавив 20 мг/мл коллагеназы II с помощью расширенных средств DMEM/F12 (я) до конечной концентрации 5 мг/мл. Добавьте Ингибитор породы Y-27632 в раствор коллагеназы II при конечной концентрации в 10 км.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение буфера пищеварения к ткани составляет 1 мл до 50 мг, которые мы используем в соответствии с Drost et al.18.
  2. Обрезка и переваривание опухолевых тканей
    1. В капюшоне клеточной культуры поместите ткани опухоли простаты в стерильное блюдо культуры 10 см, рассекайте и отбрасывайте некротические ткани.
    2. Фарш оставшуюся ткань опухоли простаты в 1 мм3 куба, удерживая куски ткани стерильной изогнутой щипцы и резки с вскрытием ножницами.
    3. Поместите кусочки рубленой опухоли в трубку 15 мл с буфером пищеварения, зачерпывая их с изогнутой стороны щипцов. Переварить опухолевую ткань при 37 градусах Цельсия при встряхивании в течение 1,5-2 ч. Проверьте прогресс пищеварения каждые 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В это время выняйте не менее 2 мл матрицы из -20 градусов по Цельсию и оттаивайте на льду. 1 мл aliquots матрицы займет около 3 ч для оттаивания.
    4. После переваривания ткани, центрифуга трубки на 175 х г в течение 5 мин при 4 градусах по Цельсию, чтобы сформировать клетку гранулы.
    5. Удалите супернатант, Щелкните трубку, чтобы ослабить клеточные гранулы, и повторно приостановить клеточные гранулы в 1 мл предварительно разогретого трипсина, дополненного 10 мкм Y-27632 Рок ингибитор. Положите трубку в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
    6. После инкубации, пипетка вверх и вниз 5 раз со стандартным p1000 отзыв. Верните трубку к водяной бане 37 градусов еще 5 минут и повторите шаг 2.2.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В это время в процедуре, тепло стерильной 6-хорошо клеточной культуры блюдо, поставив его в инкубатор 55 градусов по Цельсию.
  3. Подсчет ячеек и повторная подвеска в матрице
    1. Вымойте клетки, добавив 9 мл холодного AdDMEM/F12 и центрифуги трубки на 175 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
    2. После центрифугации, удалить супернатант, Флик трубки, чтобы ослабить гранулы, и мыть клетки снова, добавив 10 мл холодного AdDMEM / F12 ( ) . Центрифуга трубки при 175 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
    3. После центрифугации, удалить супернатант, Флик трубки, чтобы ослабить гранулы, resuspend клетки в 1 мл AdDMEM / F12 (я), и подсчитать количество клеток с помощью гемоцитометра в соответствии со стандартной процедурой.
    4. Семь-восемь куполов вписываются в один колодец из 6 хорошо блюдо, когда органоиды покрываются в матрице через падение мудрым моды. Приблизительно 200 зл и матрицы будут производить 7-8 куполов. Решите, сколько скважин органоидов необходимо для будущих экспериментальных целей, и вычислите объем требуемой матрицы. Затем вычислите объем клеточного раствора, необходимого для конечной концентрации 1,0 х 106 клеток/мл матрицы.
    5. После подсчета клеток, центрифуга на 175 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Удалите супернатант, щелкните трубку, чтобы ослабить гранулы, и повторное увеличение количества матрицы, рассчитанной в шаге 2.3.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Матрица остается в жидкой форме только при 4 градусах Цельсия; держать матричных фондовых труб и матричных клеток решения на льду во все времена.
  4. Покрытие матричных куполов и применение средств массовой информации
    1. Смешайте матричные ячейки раствор с P200 пипетка равномерно распределить клетки без введения пузырьков. Удалите 6-хорошо блюдо культуры из инкубатора 55 градусов по Цельсию.
    2. Тщательно пипетка 200 л матричного клеточного раствора и быстро уроните раствор в колодец для создания куполов.
    3. Повторите шаг 2.4.2. до тех пор, пока объем раствора матричных ячеек не будет израсходован. Разрешить купола затвердеть при комнатной температуре в течение 2 мин.
    4. Переверните 6-хорошо блюдо вверх дном и положить блюдо в инкубатор 37 градусов по Цельсию, чтобы продолжить затвердевание в течение 20 минут.
    5. После инкубации, добавить 2 мл мыши простаты органоидов средств к каждому колодцу. Добавьте синтетический андроген R1881 к каждой скважине для конечной концентрации 1 нМ и Ингибитор породы Y-27632 до конечной концентрации 10 мкм. Тщательно перемешайте и поместите тарелку в инкубатор 37 градусов по Цельсию для культивирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Органоидная культура средств массовой информации должна быть дополнена 10 ММ Y-27632 Рок ингибитор только в течение 1 недели после генерации органоидов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представитель некропсии изображения мыши с большой заполненной жидкостью первичной опухоли простаты в передней области простаты показаны на рисунке 2A. В отличие от этого, Рисунок 2B, показывает репрезентативные изображения некропсии мыши с большой твердой первичной опухоли простаты, для которых отдельные области простаты неотличимы. Флуоресцентные изображения вскрытия показывают ту же твердую опухоль простаты из

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги в рамках протокола для вскрытия опухоли предстательной железы и органоидного поколения
Удаление непростастовой ткани и тонкое вскрытие опухоли простаты мыши имеет решающее значение для оптимального поколения раковых органоидов, так как как непростаэпиляционные клетки и нормальные эпителиальные клетки простаты будут генерировать органоиды. Для твердых опухолей предстательной железы в частности, имеет решающее значение для изоляции областей жизнеспособной опухоли, чтобы удалить загрязне...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют финансовых отношений раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить лабораторию Calvin Kuo в Стэнфордском университете за предоставление клеток HEK293, стабонетых либо HA-мышьNoggin-Fc или HA-mouse Rspo1-Fc. Мы также хотели бы поблагодарить доктора Дина Тан за предоставленную нам доступ к флуоресцентным рассеиванием микроскопа в его лаборатории. Эта работа была поддержана CA179907 d.W.G. от Национального института рака. Общие ресурсы в Розуэлл Парк Всеобъемлющий онкологический центр были поддержаны Национальными институтами здравоохранения онкологический центр поддержки Грант CA016056.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% Трипсин+2,21 мМ ЭДТАСигма25-053
1 1/4 дюйма, 23 г, одноразовые иглы для шприцевБектон ДикинсонZ192430
10% нейтральный буферизованный формалинСигмаHT501128
32% параформальдегидУслуги электронной микроскопии15714
A83-01MedChemExpressHY-10432
Advanced DMEM/F12+++Gibco12634
Аналитические весыMettler Toledo30216623
B27 (50x)Gibco17504044
Collagenase IIGibco17101015
Испарительная доскаThermo-Fisher36-1
EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10Производитель TrevigenЗаявитель от Национального института рака в Национальной лаборатории ФредерикаОбладатель грантов от Национального института рака может запросить матрицу
HEPES (1 M)Sigma25-060
человеческий рекомбинантный эпидермальный фактор роста (EGF)PeproTechAF-100-15
L-глютамин (200 мМ)Sigma25-005
N-ацетил-L-цистеинSigmaA9165
Пенициллин-стрептомицинSigmaP4333
Прецизионные весыMettler Toledo30216561
Скальпель # 23World Precision Instruments504176
Ручка скальпеля # 7, 16 смWorld Precision Instruments500238
Однолезвие угольной бритвыFisherbrand12-640
Ножницы для препарирования из нержавеющей стали, 10 см, прямыеWorld Precision Instruments14393
Щипцы для диафрагмы из нержавеющей стали, 10 см, изогнутый кончик, зубчатыйWorld Precision Instruments15915
Щипцы Nugent из нержавеющей стали, прямой наконечник, зубчатыеPrecision Instruments504489
Y-276632 (ингибитор горных пород)APExBIOА3008
World

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).
  2. Furth, P. A., et al. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).
  3. Aranda, M., et al. Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway. Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).
  4. Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).
  5. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
  6. Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice. Genesis. 56 (8), 23242(2018).
  7. Brocard, J., et al. Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).
  8. Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
  9. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).
  10. Bluemn, E. G., et al. Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling. Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).
  11. Zhou, Z., et al. Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer. Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).
  12. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  13. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  14. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  15. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  16. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  17. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  18. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  19. Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
  20. Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology. The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).
  21. Dardenne, E., et al. N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).
  22. Blattner, M., et al. SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling. Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).
  23. Agarwal, S., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Prostate Cancer OrganoidsTumor Organoid Culture3D Cell CultureMouse Prostate DissectionTumor Organoid GenerationProstate Tumor OrganoidsOrganoid Drug ScreeningFluorescent Tumor ImagingOrganoid Medium Supplementation

Похожие статьи