Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка жизнеспособности и смерти клеток в 3D сфероидных культурах раковых клеток

28.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59714

⸱

16 июня 2019 г.

 ,  , 
1Section for Cell Biology and Physiology, Department of Biology, Faculty of Science, University of Copenhagen

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем несколько простых методов оценки жизнеспособности и смерти в 3D раковых клеточных сфероидах, которые имитируют физико-химические градиенты опухолей in vivo гораздо лучше, чем 2D-культура. Таким образом, сфероидная модель позволяет оценить эффективность препарата от рака с улучшенным переводом в условия in vivo.

Аннотация

Трехмерные сфероиды раковых клеток являются важными инструментами как для рака наркотиков экраны и для получения механистического понимания биологии раковых клеток. Сила этого препарата заключается в его способности имитировать многие аспекты in vivo условия опухолей, будучи быстрым, дешевым и универсальным достаточно, чтобы позволить относительно высокой пропускной способности скрининга. Условия сфероидной культуры могут резюмировать физико-химические градиенты в опухоли, включая повышение внеклеточной кислотности, увеличение лактата и снижение доступности глюкозы и кислорода, от сфероидной периферии до ее ядра. Кроме того, механические свойства и клеточные взаимодействия опухолей in vivo частично передразнятся этой моделью. Специфические свойства и, следовательно, оптимальные условия роста 3D-сфероидов сильно различаются между различными типами раковых клеток. Кроме того, оценка жизнеспособности клеток и смерти в 3D сфероидах требует методов, которые частично отличаются от тех, которые используются для 2D культур. Здесь мы описываем несколько протоколов для подготовки 3D сфероидов раковых клеток, а также для использования таких культур для оценки жизнеспособности клеток и смерти в контексте оценки эффективности противораковых препаратов.

Введение

Использование многоклеточных моделей сфероидов в биологии рака несколько десятилетий старых1,2, но получил значительный импульс в последние годы. В значительной степени это отражает повышение осведомленности о том, насколько сильно фенотип раковых клеток зависит от их микросреды и специфических условий роста. Микросреда при твердых опухолях принципиально отличается от той, что в соответствующих нормальных тканях. Это включает в себя физико-химические условия, такие как рН, кислородное напряжение, а также интерстициальное давление, градиенты концентрации растворимых факторов, таких как питательные вещества, отходы и секретированные сигнальные соединения (факторы роста, цитокины). Кроме того, она включает в себя организацию внеклеточной матрицы (ECM), клеточных взаимодействий и межклеточной сигнализации, а также другие аспекты конкретной трехмерной (3D) архитектуры опухоли3,4, 5,6. Специфические микроэкологические условия, в которых существуют раковые клетки, глубоко влияют на их профиль экспрессии генов и функциональные свойства, и ясно, что, по сравнению с клетками, выращенными в 2D, фенотип 3D сфероидов гораздо более точно имитирует что из in vivo опухолей7,8,9,10,11. 2D модели, даже если они используют гипоксию, кислый рН и высокие концентрации лактата, чтобы имитировать известные аспекты микроокружения опухоли, по-прежнему не в состоянии захватить градиенты физико-химических параметров, возникающих в опухолях, а также их 3D опухоли Архитектура. С другой стороны, модели животных являются дорогостоящими, медленными и этически проблематичными, и, как правило, также имеют недостатки в их способности переизгладить условия опухоли человека. Следовательно, 3D сфероиды были применены в качестве промежуточной модели сложности висследованиях широкого спектра свойств большинства твердых раковых заболеваний 9,11,12,13, 14,15,16,17.

Широко используется 3D сфероиды в скрининговых анализов противораковой терапии эффективность9,18,19,20. Реакции на лечение особенно чувствительны к микроокружению опухоли, отражая как влияние мучительности, ограниченное диффузии, высокое интерстициальное давление, и кислый рН окружающей среды на доставку лекарств, так и влияние гипоксии и других аспекты микроокружения на реакции смерти клетки9,17. Потому что окружающая среда в 3D сфероиды по своей сути развивает все эти свойства7,8,9,10,11, используя 3D-клеточные культуры могут существенно улучшить перевод результатов в условия in vivo, но позволит ьсядую эффективную и доступную высокую пропускную работу скрининга чистого роста. Тем не менее, подавляющее большинство исследований по лекарственной реакции раковых клеток по-прежнему проводятся в 2D условиях. Это, вероятно, отражает, что, в то время как некоторые анализы могут относительно легко быть реализованы для 3D-клеточных культур, многие, такие как анализы жизнеспособности, западные промотирование, и иммунофлуоресценции анализа, гораздо удобнее сделать в 2D, чем в 3D.

Цель юрисовской работы заключается в предоставлении легко поддающихся капсулам анализов и точных протоколов анализа влияния лечения противораковыми препаратами на жизнеспособность раковых клеток и выживание в 3D-опухоли, имитирующей обстановку. В частности, мы предоставляем и сравниваем три различных метода формирования сфероидов, за которыми следуют методы качественного и количественного анализа роста, жизнеспособности и реакции на лекарства.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Поколение сфероидов

  1. Подготовка клеточных суспензий для образования сфероидов
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Различные клеточные линии имеют очень разные свойства адгезии и наиболее подходящий протокол формирования сфероидов должен быть установлен в каждом конкретном случае. Мы обнаружили, что клетки MCF-7 и BxPC-3 пригодны для спонтанного образования сфероидов, в то время как MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 и MiaPaCa требуют добавления восстановленной мембраны для успешного формирования сфероидов. Только MDA-MB-231 и BxPC-3 клетки были использованы для висячего протокола падения, однако другие линии клетки, безусловно, применимы.
    1. Выращивайте клетки в качестве монослойной до 70-80% спущенности.
    2. Вымойте клетки с фосфатным буферным сольнием (1x PBS, 5 мл для 25 см2 или 10 мл для колбы 75 см2), добавьте фермент диссоциации клеток (0,5 мл для 25 см2 или 1 мл для колбы 75 см2) и инкубировать клетки на 2-5 мин при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 и 95% влажности.
    3. Проверьте отслоение клеток под микроскопом и нейтрализуйте фермент диссоциации клеток, добавив среду роста (6-10% сыворотки в зависимости от клеточной линии) в общий объем 5 мл в 25 см2 или 10 мл для колбы 75 см2.
    4. Используйте камеру Бюркера для подсчета ячеек и подсчета 8 квадратов в камере на подготовку клеток для получения высокой воспроизводимости размера сфероидов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже представлены три протокола, каждый из которых описывает другой метод формирования сфероидов. Протокол 1.2 и 1.3 может быть использован для всех последующих представленных аналитических протоколов, в то время как протокол 1.4 лучше всего подходит для встраивания и подготовки к лизатированию. В зависимости от клеточной линии, образование сфероидов занимает 2-4 дня, независимо от используемого метода.
  2. Спонтанное образование сфероидов
    1. Выполните шаги 1.1.1.1.1.4.
    2. Разбавить клеточной подвеской в трубке 15 мл, чтобы получить 0,5-2 х 104 ячейки/мл (оптимальная плотность клеток должна быть определена для каждой клеточной линии) (Рисунок 1А (ii)).
    3. Заполните внешнее кольцо скважин 1x PBS или средой роста, чтобы уменьшить испарение из оставшихся скважин. Перенос яточной подвески в стерильный резервуар и, используя многоканальный пипетки, распределять 200 л/хорошо в ультра-низкие крепления 96-хорошо круглые нижние пластины(Рисунок 1A (iii)).
    4. Инкубировать тарелку в инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5% CO2,95% влажности.
    5. Каждые 2-3 дня приобретают легкие микроскопические изображения сфероидов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения в этой работе принимаются при увеличении в 11,5 x, что подходит для большинства сфероидов, подготовленных с помощью этих протоколов.
    6. Каждые 2-3 дня (после получения изображений) заменяйте 100 кЛ средней (удалите 100 л отработанного среднего и замените 100 зл и свежей среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать удаления сфероидов при замене среды, желательно, чтобы наклонить пластину немного в то время как медленно удаления среды и проверить аспирированные среды в советы для видимых сфероидов, прежде чем отбросить его.
  3. Восстановлено подвальной мембранно-опосредованного образования сфероидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Лактоза дегидрогеназы подъемного вируса (LDEV) свободного фактора роста восстановлены подвале мембраны (rBM) был использован. rBM является чувствительным к температуре и всегда должен быть на льду, так как он будет сгусток, если он достигает 15 градусов по Цельсию. Оттепель rBM на льду либо на ночь при температуре 4 градусов или 2-4 ч при комнатной температуре (RT) перед покрытием.
    1. Оттепель rBM на льду (см. Таблицаматериалов).
    2. Держите пластины и резервуары (если индивидуально обернуты) на льду перед использованием.
    3. Выполните шаги 1.1.1.1.1.4.
    4. Заполните внешнее кольцо скважин 1x PBS или средой роста, чтобы уменьшить испарение из оставшихся скважин. Разбавить клеточной подвеской в трубке 15 мл, чтобы получить 0,5-2 х 104 ячейки/мл (оптимальная плотность клеток должна быть определена для каждой клеточной линии) (Рисунок 1А (ii)).
    5. Поместите трубку 15 мл, содержащую разбавленную клеточную подвеску, на льду (например, в стеклянный стакан)(рисунок 1А (iia)).
    6. Перенесите охлажденные пластины и резервуары на капот. Промыть пластиковые контейнеры, заполнить их льдом и передать их в капот, чтобы пластины и резервуары, которые будут размещены на льду в течение всей процедуры.
    7. Отрежь rBM осторожно, чтобы обеспечить однородный гель.
    8. Добавьте 1-2% rBM (оптимальная концентрация должна быть определена для каждой линии клеток) к охлажденным клеточным суспензиям(рисунок 1А (iib).
    9. Перевернуть трубку 15 мл, чтобы обеспечить правильное смешивание rBM и клеточной подвески перед дозированием подвески в пластину.
    10. Перенесите суспензию rBM-содержащей клетки в стерильный резервуар и разделите 200 л/хорошо в охлажденные ультра-низкие пластины 96-колодства с помощью многоканальной пипетки(рисунок 1А (iii)).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с несколькими суспензиями клеток (например, более одной клеточной линии), необходимо раздавать каждую суспензию клеток сразу после добавления rBM, чтобы предотвратить преждевременное gelling.
    11. Центрифуга пластины в течение 15 минут при 750 х г с использованием "мягкой достойной" / не торможение (если это возможно, центрифуга при 4 КК, чтобы сохранить жидкость rBM дольше, но не требование для успешного образования сфероидов), чтобы убедиться, что клетки сгруппированы вместе, когда rBM затвердевает, облегчая образование одного сфероида.
    12. Инкубировать тарелку в инкубаторе (37 градусовпо Цельсию, 5% CO 2, 95% влажности).
    13. Каждые 2-3 дня приобретают легкие микроскопические изображения для оценки роста сфероидов.
    14. Каждые 2-3 дня заменяйте 100 л среднего (удалите 100 л и замените 100 л свежей среды).
  4. Висячие капли сфероидов.
    1. Выполните шаг 1.1.1.1.1.4.
    2. Разбавить клетки для получения подходящего разбавления. Практическое разбавление составляет 50 000 клеток/мл.
    3. Снимите крышку 10 см2 ячейки культуры блюдо и поместите его так, что лица вверх. Добавьте 6 мл 1x PBS к блюду(рисунок 1B (i)).
    4. Налейте суспензию клетки в стерильный резервуар и аккуратно поместите до 30 капель 40 qL клеточной подвески на крышку тарелки клеточной культуры с помощью многоканального пипетки(рисунок 1B (ii)), в результате чего концентрация 2000 клеток / падение. Избегайте размещения капель слишком близко к краю крышки, как эти капли, скорее всего, потеряет поверхностное натяжение при инвертации крышки в следующем шаге.
    5. Перевернуть крышку в быстром, но контролируемом движении и поместите его на вершине 1x PBS-содержащих клеточной культуры блюдо(Рисунок 1B (iii)).
    6. Поместите блюдо в инкубатор при температуре 37 градусов с 5% CO2 и 95% влажности, не нарушая капли и оставить их расти в течение 4-6 дней.
    7. Если использовать для белковых лисатов или встраивания, бассейн сфероидов, снимая крышку и наклонить его, для того, чтобы запивать капли с 1 мл нагретой среде. Перенесите полученную среду, содержащую сфероиды, в трубку 1,5 мл и дайте им осесть на дно трубки. Продолжить, как описано в 4,4 и 6,2,2 для белка lysates и встраивания, соответственно.

2. Лекарственное лечение сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Долгосрочное лечение наркотиков может быть применено к сфероидам для того, чтобы проверить на воздействие препарата, представляющих интерес. Перед началом медикаментозного лечения рекомендуется провести доза ответного эксперимента препарата (ы), чтобы найти подходящую дозу для экспериментального лечения. Дозы должны быть основаны на определенных IC50/Ki препарата и варьируются от около 0,2x-10x этого значения.

  1. Установите 6-12 сфероидов в желаемом состоянии, как описано в 1,2 или 1,3,и поместите в инкубатор (37 градусов по Цельсию, 5% CO 2, 95% влажности) в течение 2 дней.
  2. На второй день, принять легкие микроскопические изображения сфероидов.
  3. Подготовьте первые дозы лечения (после получения изображений).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация первой обработки должна быть в два раза выше желаемой конечной концентрации, так как раствор будет разбавлен 1:2 при добавлении к хорошо содержащей 100 мл среды. Предлагаемые интервалы медикаментозного лечения (будет зависеть от полураспада препарата): День 2, 4 и 7.
  4. Используя многоканальный пипетки, аккуратно удалите 100 л среднего и замените его 100 злителем препарата, содержащего средний.
  5. Поместите 96-хорошо пластины обратно в инкубатор на 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 и 95% влажности и повторить 2,3 и 2,4 в выбранные дни лечения, но теперь без удвоения дозы для получения правильной окончательной дозы.
  6. В заключительный день протокола/графика лечения можно провести один или несколько следующих анализов.

3. Переживание жизнеспособности клеток для сфероидов

  1. Установите 4-6 сфероидов в желаемом состоянии, как описано в 1,2 или 1,3, и поместите в инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 и 95% влажности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае анализ жизнеспособности клеток проводился на 7 или 9-й день, после мониторинга роста сфероидов каждые 2-3 дня с помощью световой микроскопии, как описано выше (точка 1.2.5 и 1.3.13).
  2. Оттепель жизнеспособности ассси реагент (см. Таблица материалов) и пусть он уравновесить rt до использования.
  3. Смешайте осторожно, инвертируя для получения однородного решения.
  4. Перед выполнением асссе, удалить 50% культуры среды из сфероидов (100 л).
  5. Добавить реагент жизнеспособности клеток к каждой скважине в соотношении 1:3 к количеству среды, присутствуютй в колодце(Рисунок 2А (i)) Для 96-колодца пластины, добавьте 50 л реагента до 100 л среднего.
  6. Смешайте содержимое энергично в течение 5 мин, чтобы вызвать лиза клетки(Рисунок 2A (ii)).
  7. Инкубировать в течение 25 минут на RT, чтобы стабилизировать люминесцентный сигнал(Рисунок 2А (iii)).
  8. Запись люминесцентного сигнала(рисунок 2А (iv)).

4. Подготовка белковых лисатов для западного блоттинга из 3D сфероидных культур

ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе сфероидов, желательно использовать пипетку P200 и сократить конец кончика, чтобы больше открытия и, следовательно, легче захвата сфероидов, не нарушая их структуры.

  1. Для каждого состояния, бассейн минимум 12, в идеале 18-24 сфероидов (в зависимости от размера сфероидов) в 1,5 мл трубки (избежать 2 мл труб, так как следующие шаги станут более трудными из-за их менее заостренный дно).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество среды превышает 1,5 мл, прежде чем собрать все сфероиды, позвольте собранным сфероидам осесть на дне (происходит очень быстро, центрифугация не нужна) и отбросить половину объема трубки, прежде чем продолжить сбор оставшиеся сфероиды.
  2. Поместите трубки на лед и дайте сфероидам осесть на дне трубки 1,5 мл.
  3. Перейдите из лаборатории стерильных клеток в обычную лабораторию.
  4. Вымойте сфероиды дважды в 1 мл ледяной 1x PBS. Пусть сфероиды оседают перед удалением 1x PBS между каждым шагом стирки.
  5. Аспирируй как можно больше 1x PBS, как это возможно, не нарушая или удаления сфероидов.
  6. Добавьте 5 qL нагретого буфера лиза (LB) с ингибиторами фосфатазы и протеазы, на сфероид (например, 10 сфероидов и 50 ЛЛ ЛБ).
  7. Повторите интервалы вихря с последующим спином вниз, пока сфероиды не растворяются. Выполните цикл вихря в течение 30 с с последующим центрифугированием (достаточно быстрого вращения с помощью центрифуги столешницы) по 10 с для приблизительно 5-10 мин в зависимости от размера и компактности сфероидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Держите лизаты при -20 градусов по Цельсию до тех пор, пока не продолжите с соникированием, гомогенизацию и определение белка, как в стандартном протоколе 2D белка лизата, а затем западные blotting с использованием стандартных протоколов.

5. Пропидий Иодид (PI) Окрашивание сфероидов

  1. Установите 3-6 сфероидов при желаемом состоянии, как описано в 1,2 или 1,3, и поместите в инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 и 95% влажности.
  2. В лаборатории стерильной культуры клеток, тепло 1x PBS до 37 градусов по Цельсию.
  3. Сделать PI решение 4 мкм путем разбавления бульона раствора в 1x PBS: Разбавить 1 мг / мл aqueous запас PI 1:350 в 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта концентрация будет еще вдвое снижена после добавления раствора к скважинам, дающим окончательную концентрацию в размере 2 мкм. 100 л этого раствора необходимо для каждого скважины, содержащей сфероид.
    ПРЕДЕКТО: Propidium iodide (PI) должны быть обработаны в дым капюшон и носить перчатки. PI светочувствительный. Защитите от света при обращении.
  4. Удалите 100 л среды из каждой скважины в 96-хорошо пластины, не удаляя сфероидов.
  5. Вымойте оставшуюся среду, добавив 100 л от нагреваемых 1x PBS ко всем скважинам с последующим удалением 100 л жидкости в скважинах. Повторите этот шаг стирки 3 раза.
  6. Добавьте 100 qL раствора PI к каждому хорошему, накройте плиту в алюминиевой фольге и поместите ее в инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 и 95% влажности в течение 10-15 мин.
  7. Повторите 3 стирки, описанные в 4.5, чтобы вымыть решение PI, чтобы уменьшить фоновый сигнал при визуализации.
  8. Используйте микроскоп эпифлюоресценции для изображения сфероидов. Для оценки жизнеспособности клеток в сфероидном ядре возьмите z-стеки, чтобы получить изображения с различной глубиной сфероида.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер шага вокруг 18-35 мкм между каждым ломтиком в зависимости от размера сфероида является целесообразным, давая примерно 11-18 стеков на сфероида. Стеки могут быть обработаны в ImageJ с помощью функции z-проекции, которая может объединить все z-стеки в одну окончательную картину, давая обзор окрашивания всей сфероид (для дальнейших руководящих принципов по использованию ImageJ для этой цели, см. (https://imagej.net/Z-functions).

6. Встраивание 3D сфероидов

  1. Подготовьте гель агарозы, в который встроены сфероиды (только необходимо впервые выполнить протокол).
    1. Смешайте 1 г бактоагара в 50 мл ddH2O.
    2. Медленно нагревайте в микроволновой печи до тех пор, пока бактоагар не растворится и не образуется однородный гель. Не допускайте кипения геля.
    3. Держите бактоагар теплым на водяной бане при 60 градусах Цельсия.
    4. Держите на 4 градусах между экспериментами.
  2. Встраивание сфероидов.
    1. На 1-й день, для каждого условия, бассейн как минимум 12 сфероидов в 1,5 мл трубки.
    2. Вымойте один раз с 1 мл ледяной 1x PBS.
    3. Чтобы исправить сфероиды, добавьте 1 мл 4% параформальдегида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка параформальдегида должна осуществляться в дымовом капюшоне.
    4. Пусть они инкубируют в течение 24 ч на RT.
    5. На второй день, тепло геля агарозы тщательно, поместив его в заполненный водой стакан в микроволновой печи. Убедитесь, что гель не кипит! Держите в тепле на скамейке нагревательной пластины, при 60 градусах По Цельсия до использования.
    6. Вымойте сфероиды дважды с 1 мл ледяной 1x PBS.
    7. Аспирируй большинство из 1x PBS (оставляя около 100 Л л на данный момент является практичным для обработки сфероидов).
    8. Подготовьте пипетку размером 20 л, разрезав наконечник пипетки на наклоне, чтобы получить указательный кончик с большим отверстием (см. иллюстрацию).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая часть должна быть сделана быстро, чтобы обеспечить оптимальную передачу сфероидов и избежать затвердевания капли геля. Если нет нагревательного блока, рекомендуется сначала поймать сфероиды, а затем сделать агарозу падение (т.е. переключение порядка точек 6.2.9 и 6.2.10).
    9. Сделайте агарозный гель капли на микроскоп слайд. Поместите горку на теплый нагревательный блок, чтобы предотвратить затвердевание агарозы.
    10. Используя модифицированный наконечник пипетки (см. 6.2.8), поймать как можно больше сфероидов, как это возможно в объеме 15-20 Л.
    11. Тщательно введите 15-20 л сфероидов, содержащих 1x PBS в центр капли геля агарозы, не касаясь слайда микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это немного трудный момент. Сфероиды будут потеряны, если кончик пипетки касается слайда микроскопа при впрыскивание сфероидов в падение геля. Целесообразно практиковать весь процесс делать падение агарозы и впрыскивать сфероиды путем впрыскивать покрашенную жидкость в падение. Это позволит визуализировать потенциальное проникновение через падение, так как цветная жидкость будет вытекать на слайд.
    12. Пусть агарозный гель капля затвердеть путем инкубации в течение 5-10 мин на RT или при 4 градусах Цельсия. После того, как гель капли затвердевает несколько (но все еще довольно мягкий), тщательно нажмите гель капли из микроскопа слайд в пластиковой ткани кассеты с кальпелью.
    13. Обложка пластиковых тканей кассеты в 70% этанола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент сфероиды могут быть использованы непосредственно или храниться в течение нескольких месяцев.
    14. Встраивайте агарозе в парфиин, разделите на 2-3 мкм толщиной слоя слайдов и пятно с гематоксилин и эозин или при условии иммуногистологического окрашивания.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сфероид роста анализы на основе сфероидного протокола формирования схематично иллюстрируется на рисунке 1А и Рисунок 1В, были использованы в качестве отправной точки для анализа последствий лечения противораковых препаратов в 3D опухоли имитируя настройки. Легкость, с которой образуются сфероиды, является клеточной линией, а некоторые клеточные линии требуют добавок с rBM для того, чтобы сформировать когероиды2...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Использование 3D раковых клеток сфероидов оказался ценным и универсальным инструментом не только для скрининга противораковых препаратов, но и для получения механистического понимания регуляции смерти раковых клеток и жизнеспособности в условиях, имитирующих тех, кто в опухоли Микроокружения. Это особенно важно, поскольку доступность, клеточное поглощение и внутриклеточное воздействие химиотерапевтических препаратов глубоко влияют на физико-химические условия в опухоли, включая рН, кислородное напряжение, тортуозность, а...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Мы благодарны Катрин Франклин Марк и Аннет Бартельс за отличную техническую помощь и Асбьёрн Нёр-Нильсен за проведение экспериментов на рисунке 1D. Эта работа была профинансирована Фондом Эйнара Виллумсена, Фондом Ново Нордиска и Фондом Juchum (все в SFP).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-(4-амидинофенил)-1H-индол-6-карбоксамидин (DAPI)Invitrogen# C10595 Для окрашивания ядер
5-фторурацил (5-FU)Sigma-Aldrich#F6627Компонент в химиотерапевтическом лечении
5-(N-этил-изопропил) амилорид (EIPA)Life Technologies#E3111Ингибитор антитела NHE1
против PARP и cPARPКлеточная сигнализация#9542Используется в вестерн-блоттинге
Антитело против Ki-67Клеточная сигнализация#9449Используется для ИГХ
Антитела против p53Cell Signaling #2524&nбсп;Используется для ИГХ
Антитела против β-актинаSigma A5441Используется в вестерн-блоттинге
BactoagarBD Bioscience#214010Используется для приготовления агарозного
геля Эталонный белковый лестницаInvitrogen#10747-012Используется для SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Analysis kitBio-Rad Laboratories#500-0113, #500-0114, #500-0115   Используется для определения белка из лизатов
Bü Камера rkerMarienfeld610311Для подсчета клеток 
Эпифлуоресцентный микроскоп BX63OlympusИспользуется для флуоресцентной визуализации
CellTiter-Glo 3D Анализ жизнеспособности клетокPromega#G9681Используется для анализа жизнеспособности клеток
ЦисплатинSigma-Aldrich#P4394 Компонент в химиотерапевтическом лечении
Микропластина Corning Spheroid, 96 лунка, черная с прозрачным круглым дном,  Сверхнизкое крепление, с крышкой, стерильныйCorning# 4520Используется для выращивания сфероидов с измерениями люминесценции в качестве конечной точки
Corning 96 лунка, чистое круглое дно,   Микропланшет со сверхнизким уровнем крепления, с крышкой, стерильныйCorning#7007Достаточен для роста сфероидов без измерений люминесценции в качестве конечной точки
Criterion TGX Precast GelsBio-Rad5671025Используется для SDS-PAGE
DoxorubicinAbcam#120629Компонент в химиотерапевтическом лечении
FLUOStar Optima Считыватель микропланшетовBMG LabtechИспользуется для регистрации люминесценции 
Формальдегид VWR Chemicals #9713.1000 Используется для фиксации клеток
Geltrex LDEV-Free Сниженный фактор роста Матрица базальной мембраныGibco#A1413202Держать на уровне 4 °°; C для предотвращения затвердевания. В протоколе обозначается как rBM.
Термоинактивированная FBSSigma#F9665Сыворотка для питательных сред
ImageJNIHScientific Image analysis
Medim Uni-safe casetteMedim Histotechnologie10-0114Используется для хранения встроенных сфероидов
Мини коктейль ингибиторов протеазыRoche Diagnostics GmBH # 11836153001Используется для получения буфера для лизиса
MZ16 микроскопLeicaИспользуется для легких микроскопических изображений
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer Invitrogen#NP0007Используется для вестерн-блоттинга
Pierce ECL Western blotting substrateThermo scientific#32106Используется для вестерн-блоттинга
Ponceau SSigma-Aldrich#P7170-1LИспользуется для окрашивания белковых полос
Prism 6.0GraphpadНаучное графическое и статистическое программное обеспечение
Пропидиум йодид (1 мг/мл раствор в воде)Инвитроген P3566Светочувствительный 
Стерильные резервуары, многоканальныеSPL lifesciences21002Используются для посева ячеек для формирования сфероидов
Superfrost Ultra-Plus Адгезионное скольжение Menzel-Glä сер#J3800AMNZПредметное стекло микроскопа, используемое для встраивания
тамоксифенаSigma-Aldrich#T5648Используемое в качестве химиотерапевтического лечения
Trans-blot Turbo 0.2 &; m нитроцеллюлозные мембраныBio-Rad#170-4159Используется для западного блоттинга
Трис/Глицин/SDS бегущий буфер Био-Рад #161 0732Используется для SDS-PAGE
Trypsin-EDTA растворSigma#T4174 Фермент диссоциации клеток

Ссылки

  1. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  2. Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
  3. Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
  4. Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293(2008).
  5. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  6. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
  7. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  8. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  9. Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
  10. Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
  11. Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
  12. Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45(2016).
  13. Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
  14. Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
  15. Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
  16. Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
  17. Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
  18. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29(2012).
  19. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  20. Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218(2012).
  21. Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
  22. Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
  23. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
  24. Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
  25. Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
  26. Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
  27. Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
  28. Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
  29. Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
  30. Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
  31. Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J. Cancer Drug Resistance. Teicher, B. A. , Humana Press. 21-42 (2006).
  32. Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
  33. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  34. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  35. Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039(2017).
  36. Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
  37. Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour - endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963(2017).
  38. LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
  39. Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
  40. Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51(2013).
  41. Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
  42. Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3D-культивирование сфероидовжизнеспособность раковых клетокоценка гибели клетокскрининг противоопухолевых препаратовмикроокружение опухолиметод «капли на руке»иммуногистохимическая заливкаокрашивание пропидиумйодидомZ-стекированиевлияние концентрации rBM
Оценка жизнеспособности и смерти клеток в 3D сфероидных культурах раковых клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.