Method Article

Использование larvae зебрафиш для изучения патологических последствий геморрагического инсульта

DOI:

10.3791/59716

⸱

June 5th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Division of Neuroscience and Experimental Psychology, School of Biological Sciences, Manchester Academic Health Science Centre, University of Manchester, 2Division of Cardiovascular Sciences, School of Medical Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, Manchester Academic Health Science Centre, University of Manchester, 3Lydia Becker Institute of Immunology and Inflammation, University of Manchester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для количественной оценки черепно-мозговой травмы, локомотивных дефицитов и нейровоспаления после кровотечения в мозге в личинки зебры, в контексте внутримозгового кровоизлияния человека (ICH).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на то, что это самый тяжелый подтип инсульта с высокой глобальной смертностью, специфического лечения для пациентов с внутримозговым кровоизлиянием (Ich). Моделирование ICH до клинически оказалось трудным, и нынешние модели грызунов плохо резюмировать спонтанную природу человека ICH. Поэтому существует настоятельная необходимость в альтернативных доклинических методологиях для изучения механизмов заболевания в МКЗ и для потенциального открытия препарата.

Использование зебры представляет собой все более популярный подход к трансляционным исследованиям, в первую очередь из-за ряда преимуществ, которыми они обладают над моделями болезней млекопитающих, включая плодовитые показатели воспроизводства и прозрачность личинок, позволяющие жить изображения. Другие группы установили, что личинки зебры могут проявлять спонтанный ICH после генетического или химического нарушения цереброваскулярного развития. Цель этой методологии заключается в использовании таких моделей для изучения патологических последствий кровоизлияния в мозг, в контексте доклинических исследований ICH. С помощью живой визуализации и подвижности анализы, повреждение мозга, нейровоспаление и локомотивная функция после ICH могут быть оценены и количественно.

Это исследование показывает, что ключевые патологические последствия кровоизлияния в мозг у человека сохраняются в личинках зебры, подчеркивая модель организма как ценную систему in vivo для доклинического исследования ICH. Цель этой методологии заключается в том, чтобы дать возможность сообществу, доклиническим инсультам, использовать модель личинок зебры в качестве альтернативной дополнительной модели системы для грызунов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внутримозговое кровоизлияние (ICH) является наиболее тяжелым подтипом инсульта, связанного с спонтанным разрывом сосуда головного мозга и кровотечением в паренхиму, приводящим к повреждению мозга, физической инвалидности и часто йен1. Несмотря на высокую смертность и заболеваемость, связанную с ICH2,понимание лежащей в основе этиологии и патологии после кровоизлияния по-прежнему отсутствует. Как таковой, Есть никаких конкретных методов лечения для предотвращения ICH или улучшить исходы пациента. Большая часть нашего понимания биологии болезни пришла из доклинических моделей грызунов ICH3, однако исследования на сегодняшний день в этих моделях не удалось перевести какой-либо успешной терапии в клинику4,5. Эта неудача может быть отчасти связано с некоторыми ограничениями этих доклинических моделей, в том числе неспособность легко резюмировать спонтанный характер болезни человека и требование для инвазивной хирургии для создания моделей у млекопитающих6. Кроме того, грызуны создают практические проблемы в отношении наблюдения быстрого начала клеточных реакций на ICH в нетронутой ткани. Учитывая отсутствие перевода с моделей грызунов, разработка альтернативных моделей спонтанного ICH необходимо, если мы хотим преодолеть эти практические проблемы и помочь определить новые цели наркотиков.

Молекулярные механизмы развития сосудов хорошо сохраняются среди позвоночных, включая зебры(Danio rerio)7. Таким образом, принятие этой модели организма становится все более полезной механистической стратегии для изучения цереброваскулярных заболеваний8. Ряд моделей зебры были созданы, которые повторяют фенотипы, связанные с инсультом связанных условий9,10,11,12. Использование личинок зебры для исследования болезни патогенеза предлагает как практические, так и научные преимущества по сравнению с моделями млекопитающих8. Это включает в себя высокие показатели воспроизводства, быстрое развитие и прозрачность личинок, что позволяет для интравитентной визуализации без инвазивных ограничений, связанных с грызунами. Соединение этих преимуществ с широким спектром трансгенных линий репортера, доступных в рамках научно-исследовательского сообщества зебры, составляет мощный подход in vivo для изучения биологии болезней, еще не использованный для изучения патологических последствия ICH.

Ответ травмы на кровь в головном мозге является двухфамным13; первичное оскорбление вызывает гибель нейронов и некроз клеток, который затем инициирует вторичную волну повреждений, которая вызвана врожденной иммунной активацией. Вторая фаза черепно-мозговой травмы, в частности нейровоспалительный компонент, считается реалистичной мишенью для будущего лечения наркотиков13. Спонтанные и церебральных конкретных кровоизлияний были описаны в личинки зебры ранее14,15,16,17,18,19. Две такие модели являются использование аторвастатина (ATV) на 24 ч после оплодотворения (hpf) для ингибирования пути HMGCR и холестерина биосинтеза14, и пузырь (bbh) мутант, которые выражают гипоморфные мутации в гене arhgef7, и впоследствии ингибирует актин ремоделирования для плотных эндоваскулярных узлов18. Эти модели демонстрируют спонтанный разрыв мозгового сосуда в начале кровообращения (33 л.с.). В последнее время мы охарактеризовали эти модели далее, чтобы показать, что ключевые аспекты реакции травмы головного мозга сохраняется между людьми и личинки зебры20. Это исследование демонстрирует методологию, необходимую для получения и визуализации спонтанных кровоизлияний в мозг в личинки зебры и как количественно травмы головного мозга, а также локомотиви и нейровоспалительные фенотипы, которые относятся к человеческому состоянию. Эти данные и методы поддерживают использование этого модельного вида в качестве ценной дополнительной системы для доклинических исследований ICH.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Зебрафиш были подняты и поддерживается в Университете Манчестера биологических услуг группы в стандартных условиях, как ранее описано21. Взрослый зебры животноводства была одобрена Университетом Манчестера животных благосостояния и этического обзора совета. Все эксперименты проводились в соответствии с правилами Министерства внутренних дел (PPL/PPL/P132EB6D7).

ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, используемые в этом исследовании включают макрофаг-специфической линии mpeg1,mCherry (построен в доме, как ранее описано22), нейтрофил-специфический mpo,GFP23,эритроид-специфический gata1 dsRed24 и ubiq. На рисунке 1 показана экспериментальная шкала времени.

figure-protocol-1
Рисунок 1 : Графика экспериментальной временной шкалы для характеристики черепно-мозговой травмы, локомоторных и нейровоспалительных исходов. ICH, внутримозговое кровоизлияние; bbh, пузырьковая головка. Рисунок был воспроизведен с Crilly et al.20 с разрешения под лицензией Creative Commons. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

1. День 0. Производство и сбор яиц

  1. Собирайте оплодотворенные эмбрионы от естественного нереста в племенных коробках, произведенных у 1 самца и 1-2 самки взрослых зебры.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ однократное ПРИМЕЧАНИЕ однократнодляное между штаммами любой дикий тип/трансгенные животные.
  2. Инкубировать 100 эмбрионов при 28 градусах Цельсия в стандартной среде эмбриона E3 на чашку Петри и стадии в соответствии со стандартными руководящими принципами26.
  3. В 6 часов после оплодотворения (hpf) удалить мертвых и неоплодотворенных эмбрионов из тарелки с помощью пастера пипетка.

2. День 1. Аторвастатин лечение на 24 л.с.

  1. Дехорионат эмбрионов для лечения аторвастатина с использованием острых ультра тонких рассечения щипцы27. Цифры, необходимые для экспериментов, могут быть соответствующим образом скорректированы.
  2. Добавьте 30 мл эмбриона E3 среднего до двух чистых блюд Петри. Используйте одно блюдо для 100 эмбрионов.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, если плиты конструированы для культуры клетки, то dechorionated зебра на этой предыдущей стадии часто прилипает к дну. Чтобы избежать этого, тщательно промыть пластины в чистой воде перед использованием.
  3. Удалить 60 л эмбриональной воды из лечебной пластины и добавить 60 юл 0,5 мМ аторвастатин (ATV). При концентрации запасов 0,5 мм, вышеуказанное разбавление приведет к окончательной концентрации 1 МКм, что приведет к 20% личинок, не кровоизлияний (ICH-) и 80% личинок кровоизлияния (ICH). Используйте другую пластину для необработанных элементов управления
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ОДНОЗАМЕЧАНИЕ, аторвастатин растворяется в дистиллированной воде (3 мг в 10 мл), чтобы сделать раствор запаса 0,5 мм. Инкубировать на ночь при комнатной температуре в темноте с возбуждением, так как растворимизация занимает некоторое время. Полная растворимизация может занять до 1 недели. Не используйте DMSO. Раствор aliquoted и хранится при -20 градусах Цельсия. Не замораживайте оттепель.
  4. Используя пипетку Pasteur, перенесите 100 эмбрионов в как можно меньше воды на лечебные пластины.
  5. Инкубировать пластины при 28 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ, ICH будет происходить между 33 и 48 л.с. Аторвастатин не нужно удалять, так как инкубация длиннее 24 ч не вызывает никаких дальнейших проблем с развитием.

3. День 2. Разделение популяций ICH- и ICH на 50 л.с.

  1. Отделить рыбу Ich- от ICH-популяций и перевести на новые блюда для удобства.
    1. При использовании модели ATV в концентрации 1 ММ, 75-100% личинок будут проявлять кровоизлияние (Ich) в этот момент времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ МЕСТО ПРИМЕЧАния к ответу личинок отличается между штаммами, если личинки не кровоизлияния на желаемых частотах, используйте свежую партию аторвастатина или более высокую концентрацию. Если личинки не выставили кровоизлияния на 48 л.с., то считайте их ICH-.
    2. При использовании модели bbh, все гомозиготные мутанты будут проявлять кровоизлияние на 48 л.с. При использовании гетерозиготного инкросса, ICH-гетерозиготные и дикие братья и сестры могут быть использованы в качестве контрольных животных для экспериментов.
  2. При необходимости обезображив личинок, добавив 0,02% MS222 в e3-носители. Используя пипетку Pasteur, сортируйте личинки для присутствия крови в голове в свежие средства массовой информации E3. Посмотреть рисунок 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, Кровь в голове может появиться в передний, средний или задний мозг или в комбинации, и кровоточить объем может варьироваться между животными. В bbh мутантов, ICH часто связано с тяжелым отек узнаваемым более крупными головами, более широкое пространство между глазами и более рассеянное кровотечение. Однако не все личинки ICH' bbh обладают отеками.

figure-protocol-2
Рисунок 2 : Фенотипы кровоизлияния в мозг. Примеры личий ICH фенотипов поддерживается на трансгенных gata1'DsRed репортер перламутровый фон наблюдается с яркой стереомикроскоп (верхние панели) и флуоресценции (нижняя панель) на 48 ч после оплодотворения. В ЛИЧ-личинках (левых панелях) кровоизлияний не наблюдалось. В личинках ICH ' (правые панели) наблюдалось заметное накопление эритроцитов в предтече и заднем мозге (стрелках). Шкала баров представляют 250 мкм. Рисунок был воспроизведен из Crilly et al.20 с разрешения под лицензией Creative Commons. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

4. День 3. Клеточная смерть и лейкоцитов анализ на 72 л.с.

  1. Экран личинок с помощью флуоресцентного микроскопа для обеспечения экспрессии флуоресцентного белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, В этом исследовании, трансгенные ubiq'secAnnexinV-mVenus личинки были использованы для сообщения о гибели клеток мозга и двойной трансгенной mpo(GFP); mpeg1(мПГЕ1)или убик(secAnnexinV-mVenus); mpeg1 (мпег1))используется для анализа лейкоцитов.
  2. Заполните световую монтажную камеру с помощью e3-носителя, содержащего 0,02% MS222.
  3. Анестезия личинок с помощью 0,02% MS222. Перенесите личинки для монтажа (n no 1-6) на сухую поверхность блюда Петри в одну каплю. Удалите как можно больше жидкости.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, 1.5% низкий расплавленный агароза подготовлена используя 0.15 g агарозы низкого расплава растворяемого в 10 ml среды E3 без метиленового синего цвета в микроволновой печи и держится на 45 c до использования.
  4. Добавьте каплю 1,5% низкорасплавленной агарозы (поддерживаемой в качестве жидкости в тепловом блоке 45 градусов Цельсия) к личинкам и с помощью капилляра 800 мкм, и сначала нарисуйте личинки головой. Если позиционирование не является точным, личинки могут быть исключены из агарозы и установлены снова. Оставьте капилляр остыть перед вставкой в камеру световой листа.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, Альтернативно, конфокальный микроскоп смог быть использован для этой процедуры. Для этого личинки должны быть установлены боково в агарозе на стеклянной нижней тарелке.
  5. Приобретите изображения головы между линзами глаза z-stack (300 мкм) и переполните максимальное изображение проекции интенсивности.
    1. Анализ области мозга из изображений, собранных для общего числа флуоресцентных клеток и общей интенсивности флуоресценции20.
  6. Создайте промежуток времени видео нескольких проекционных композитов в течение 18-24 ч для отслеживания подвижности лейкоцитов и взаимодействия с умирающими клетками.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, Если долгосрочная живая визуализация выполняется, только одна личинка установлена в капилляре.
  7. Когда изображение завершено изгнать личинок из монтажа капилляров в смертельной передозировки 4% MS222 усыпления.

5. День 3. Выбор личинок для асссирования подвижности на 72 л.с.

  1. Анестезия личинок в чашках Петри с 0,02% MS222.
  2. Случайно выберите n 24 личинки для ассеии подвижности и передачи в свежие E3 носителей и позволяют животным оправиться от анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ примечание мейнснетвейка на данный момент удаляет смещения выбора для медленных пловцов, которые легко поймать.

6. День 3-5. Assaying передвижения на 72, 96 и 120 л.с.

  1. Передача личинок, выбранных на 72 л.с. в E3 среде без метилена синий.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ, для assaying на 3 dpf позволяют личинки достаточно времени, чтобы оправиться от анестезии (No gt;1 ч).
  2. Плита одна личинка в 1 мл на колодец из 24-хорошо пластины с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ. Вырезать конец кончика пипетки, чтобы избежать повреждения личинок. Размер плиты может быть изменен в соответствии с экспериментальным дизайном.
  3. Загрузите пластины в камеру камеры и ассеировать движение в течение 10 минут с помощью белого света испуга рутины для увеличения спонтанного плавания.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ одноразового поведения было отслежено с помощью камеры камеры и программного обеспечения для отслеживания (см. таблицуматериалов).
  4. Повторите эксперимент с теми же личинками на 96 и 120 л.с. Перемещение личинок из индивидуального жилья в анализ пластины в чашку Петри и инкубировать при 28 градусов по Цельсию между анализами.
  5. По завершении ассоговые работы, эвтаназии личинок в смертельной передозировки 4% MS222.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка гибели клеток мозга с помощью трансгенного убика. Кластеры отступают до 96 л.с. Благодаря анализу изображений кровотечение связано со значительным двукратным увеличением общей интенсивности флуоресцентного сигнала в головном мозге, что указывает на заметную гибель клеток.

Нейровоспалительный ответ идентифицируется в личинках Ich' значительно увеличенным числом mpeg1 положительных клеток макрофага в головном мозге. Число общего MPO положительных нейтрофильных клеток также увеличилось, однако это не достигло статистической значимости(Рисунок 4). Морфология mpeg1 положительных макрофагов также можно увидеть, чтобы изменить в личинки ICH, как клетки принимают активную, округлую, амебоидную форму. Эти активированные округлые клетки также могут контролироваться с течением времени, чтобы показать повышенную фагоцитарную реакцию убика,secAnnexinV-mVenus, выражающую умирающие клетки в личинках ICH (Рисунок 5). mpeg1 положительные макрофаги, демонстрирующие неразрежированные процессы, были классифицированы как неактивные.

Кровоизлияние в мозг связано со значительным снижением подвижности на 72 и 96 л.с. по сравнению с ICH-sibling управления в обоих bbh и ATV моделей(рисунок 6). Подвижность при 120 л.с. восстанавливается до почти базовых уровней. Есть часто различия в базовой подвижности между яйцеклетки и штаммов и поэтому сравнение должно быть сделано ich-контроля каждый раз.

figure-results-1
Рисунок 3 - Внутримозговое кровоизлияние (Ich) в личинки зебры приводит к количественной травмы головного мозга. (A) Представитель изображения фенотипа черепно-мозговой травмы в личинки ICH (правые панели), по сравнению с ICH-братьев (левые панели), на 72 л.с. Яркие изображения (нижние панели, шкала бар 250 мкм) демонстрируют наличие мозговых кровотечений (стрелки) в личинки ICH. Флуоресцентная микроскопия была выполнена для визуализации клеточной смерти в ubiqлинии репортера secAnnexinV-mVenus (верхние панели, шкала бар 100 мкм). Кластеры умирающих клеток наблюдались в перигематомных регионах. Изображения были обрезаны в области мозга только и проанализированы для общей интенсивности зеленой флуоресценции в круглых частиц больше, чем 30 пикселей в диаметре (белая линия) с помощью макроса в дополнительномфайле 1 . (B) Количественная оценка сигнала флуоресценции в мозге необработанных, ich- и ICH, личинок, полученных через модель ATV (n 12 в группу; 3 независимых репликаций) при 72 л.с. Значительные различия наблюдались при сравнении С МХЗ с необработанными (зря 0,004) и с братьями и сестрами ICH- (ПЗ 0,03). (C) Количественная оценка сигнала флуоресценции как зачитывания для присоединения к приложению в мозге личинки и личинки ICH, полученные через модель bubblehead (bbh) (n - 12 в группу; 2 независимых репликации) при 72 л.с. Графики показывают SD из среднего. Значительная разница в флуоресценции мвенеры наблюдалась между МЗЗ и ICH-возрастных братьев и сестер (п. 0,002). Рисунок был воспроизведен с Crilly et al.20 с разрешения под лицензией Creative Commons. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 4 : Внутримозговое кровоизлияние (ICH) инициирует врожденный клеточный иммунный ответ в личиночном мозге зебры. Числа лейкоцитов, количественные в областях мозга, ранее описанных для mpo;GFP;mpeg1.dsRed двойные трансгенные личинки (n - 8 на группу; 2 независимых репликатора) при 72 л.с. показывает значительное увеличение макрофагов (п. 0,01), но не нейтрофилов (р) 0,5), в ответ на ICH. Рисунок был воспроизведен с Crilly et al.20 с разрешения под лицензией Creative Commons. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

figure-results-3
Рисунок 5 : Активированные макрофагные клетки показывают фагоцитическую реакцию на повреждение мозга. (A) Представитель замедленного неподвижности20 показаны ramified патрулирования макрофаг мигрирует к annexinV положительной ячейки (i - vi). Кадры получены из серии изображений, сделанных всего мозга с помощью 20x цели. Шкала бар представляет 50 мкм. Макрофаг приобрел амебоидную морфологию (v) до фагоцитоза аннексииВ-позитивной клетки (vi, vii). После фагоцитоза макрофаг возобновляет разбушеванную морфологию и мигрирует, а аскинв-положительную клетку больше не видно (viii). Рамированный макрофаг (яп. ) — положительная клетка (стрелка), амебидный макрофаг( амебидный макрофаг. (B) Репрезентативные изображения mpeg1-положительныхклеток в личиночном мозге ICH- и ICH', демонстрирующих амебоид ные и перемешанные морфологии. Шкала баров представляют 50 мкм. (C) Повышенная доля амебоида (фагоцита) и снижение доли бродячих (неактивных) макрофагов наблюдалось в мозге ICH' по сравнению с ICH- братьев и сестер. Рисунок был воспроизведен с Crilly et al.20 с разрешения под лицензией Creative Commons. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

figure-results-4
Рисунок 6 : ICH-индуцированной черепно-мозговой травмы приводит к количественной дефицит локомотива в личинки зебры. (A) Представитель примеры плавательных треков в ICH- и ICH' bbh личинки на 72, 96 и 120 л.с. (B) личинки Ich' продемонстрировали значительное снижение совокупного времени, проведенного мобильным в течение 10 минут периода записи на 72 и 96 л.с. Значение было потеряно на 120 л.с. точки времени потенциально намекая на восстановление после черепно-мозговой травмы (n No 24 личинки на группу; 3 независимых репликации; »p - 0.00006; ю 0.003; ns. (C) Количественная оценка кумулятивного времени, затраченного на перемещение в необработанных и aTV-обработанных личинки ICH- и ICH' на 120 л.с. Личинки Ich' продемонстрировали значительное снижение совокупного времени, затраченного на мобильный телефон в течение 10 минут периода записи. Для расчета SD-из среднего значения были использованы три технических репликации (n no 24 личинки на группу) (no 24 личинки на группу). Рисунок был воспроизведен с Crilly et al.20 с разрешения под лицензией Creative Commons. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование показывает, что ICH в личинки зебры вызывает ответ травмы головного мозга, что резюмирует ключевые аспекты человеческого состояния, которые могут быть систематически анализируется и количественно. Зебрафиш предлагают последовательную и воспроизводимую модель спонтанного ICH, который поможет с будущими исследованиями вмешательства наркотиков сосредоточены на ориентации кровотока индуцированной черепно-мозговой травмы, а не предотвращение разрыва сосуда17,28. Действительно, учитывая быстрый характер заболевания, сродни клинической ситуации, такой подход открывает захватывающие перспективы для успешного перевода в будущем.

Некоторые ограничения связаны с использованием личинок зебры, таких как использование развивающейся системы и таксономического ранга, однако практические и научные преимущества этой модели должны быть рассмотрены, чтобы предложить новые идеи в ICH. Никакая операция не требуется, чтобы инициировать кровотечение или контролировать клеточные процессы в течение длительных периодов времени после травмы. Высокая плодовитость спаривания зебры генерирует легкодоступные и большие размеры образцов, а благодаря быстрому развитию личинок экспериментальная хронология значительно снижается по сравнению с исследованиями грызунов29,30.

В настоящее время эти модели пригодны для использования для выяснения непосредственной патологической и иммунологической реакции на спонтанный ICH в мозге живых нетронутых животных. Потенциально, эта модель может быть адаптирована для средне-высокой пропускной связи наркотиков экраны для ICH терапии, будь то профилактические или восстановления содействия. Таким образом, патологии пост-ICH, представленные в данном исследовании, представляют собой альтернативную, дополняемую платформу для доклинических исследований ICH.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дэвида Спиллера и Основной фонд микроскопии Манчестерского университета за использование оборудования, профессора Ричарда Бейнса за использование DanioVision и д-ра Джека Риверса-Аути для статистической консультации. Линия bbh была любезно разделена Николь Мунси из лаборатории доктора Сары Чайлд в Университете Калгари. Мы также благодарим профессора Стивена Реншоу, д-ра Адама Херлстоуна, д-ра Эндрю Бадрока и д-ра Хелен Янг за рыбные линии и оборудование.

Это исследование было поддержано NC3Rs (NC/N002598/1), Stroke Association (TSA LECT 2017/02), ERA-NET NEURON (MR/M501803/1) и Британским фондом сердца (FS/15/67/32038). Мы также особенно благодарны Фонду Натали Кейт Мосс и факультету биологии, медицины и здравоохранения Манчестерского университета за их постоянную финансовую поддержку.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
24-луночные планшетыSigma-AldrichCLS3527
28° C инкубаторLMS210
АторвастатинСигма-ОлдричPZ0001-5мг
Селекционные боксыThoren Aquatics systems10011
Наблюдательная камера DaniovisionNoldusn/a
E3 medium 1x4% Instant Ocean, 500 &; L метиленовый синий в 1 л dH2O
программное обеспечение EthoVision XTNoldusversion 11
Тепловой блокGrant-BioPHMT-PSC18
Instant oceanSS15-10
Световой микроскопZeissZ.1
Световой микроскоп монтажный капиллярZeiss402100-9320-000
Низкорасплавленный агарозныйPromegaV2111
Метиленовый синийSigma-Aldrich319112-100ML
Микроскоп LeicaMZ95диссекционный микроскоп
Микроскоп LeicaM165FCфлуоресцентный микроскоп
MS2224г порошка трикаина, 500 мл dH2O, 10 мл 1 M Tris (pH 9). Отрегулируйте pH до ~7
P1000 пипеткиGilsonF144059M
P1000 наконечники для пипетокStarlabS1122-1830
Пастеровские пипеткиStarlabE1414-0300
Чашки Петри Corning101VR20
PipetboyIntegra BiosciencesPIPETBOY
Stripette 25млCorningCLS3527
порошок трикаинаSigma-AldrichA5040-25G
Tris BaseFisher BioReagentsBP152-1
Ультратонкие щипцы для рассеченияAgar scientificAGT502
Программное обеспечение ZenZeissверсия 2.3

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. An, S. J., Kim, T. J., Epidemiology Yoon, B. W. Epidemiology, risk factors, and clinical features of intracerebral hemorrhage: an update. Journal of stroke. 19 (1), 3(2017).
  2. WHO. The top 10 causes of death. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2017).
  3. Casals, J. B. The use of animal models for stroke research: a review. Comparative medicine. 61 (4), 305-313 (2011).
  4. Kellner, C. P., Connolly, E. S. Neuroprotective Strategies for Intracerebral Hemorrhage Trials and Translation. Stroke. 41 (10 Suppl 1), S99-S102 (2010).
  5. Kirkman, M. A., Allan, S. M., Parry-Jones, A. R. Experimental intracerebral hemorrhage: avoiding pitfalls in translational research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (11), 2135-2151 (2011).
  6. ASPA. 1986 amendments. , (2012).
  7. Butler, M. G., Gore, A. V., Weinstein, B. M. Methods in cell biology. 105, Elsevier. 137-161 (2011).
  8. Walcott, B. P., Peterson, R. T. Zebrafish models of cerebrovascular disease. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (4), 571-577 (2014).
  9. Liu, C. Macrophages mediate the repair of brain vascular rupture through direct physical adhesion and mechanical traction. Immunity. 44 (5), 1162-1176 (2016).
  10. Kasher, P. R. Characterization of samhd1 morphant zebrafish recapitulates features of the human type I interferonopathy Aicardi-Goutieres syndrome. The Journal of Immunology. 194 (6), 2819-2825 (2015).
  11. Wen, J. Mutation of rnf213a by TALEN causes abnormal angiogenesis and circulation defects in zebrafish. Brain research. 1644, 70-78 (2016).
  12. Eisa-Beygi, S., Rezaei, M. Etiology of intracerebral hemorrhage (ICH): novel insights from Zebrafish embryos. International Journal of Developmental Biology. 60 (4-5-6), 119-126 (2016).
  13. Mracsko, E., Veltkamp, R. Neuroinflammation after intracerebral hemorrhage. Frontiers in cellular neuroscience. 8, 388(2014).
  14. Eisa-Beygi, S., Hatch, G., Noble, S., Ekker, M., Moon, T. W. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) pathway regulates developmental cerebral-vascular stability via prenylation-dependent signalling pathway. Developmental biology. 373 (2), 258-266 (2013).
  15. Shen, M. Discovery of Rho-kinase inhibitors by docking-based virtual screening. Molecular BioSystems. 9 (6), 1511-1521 (2013).
  16. Huang, B. Tanshinone I prevents atorvastatin-induced cerebral hemorrhage in zebrafish and stabilizes endothelial cell-cell adhesion by inhibiting VE-cadherin internalization and actin-myosin contractility. Pharmacological research. , (2017).
  17. Li, S. Discovery of a ROCK inhibitor, FPND, which prevents cerebral hemorrhage through maintaining vascular integrity by interference with VE-cadherin. Cell death discovery. 3, 17051(2017).
  18. Liu, J. A βPix-Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (35), 13990-13995 (2007).
  19. ten Klooster, P. J., Jaffer, Z. M., Chernoff, J., Hordijk, P. L. Targeting and activation of Rac1 are mediated by the exchange factor β-Pix. The Journal of cell biology. 172 (5), 759-769 (2006).
  20. Crilly, S. Using zebrafish larval models to study brain injury, locomotor and neuroinflammatory outcomes following intracerebral haemorrhage. F1000Research. 7, (2018).
  21. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
  22. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  23. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  24. Traver, D. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238(2003).
  25. Morsch, M. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Frontiers in cellular neuroscience. 9, (2015).
  26. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  27. Liang, J. O. Zebrafish in the Classroom. , http://www.zfic.org (2011).
  28. Yang, R. Miconazole protects blood vessels from MMP9-dependent rupture and hemorrhage. Disease Models & Mechanisms. 10 (3), 337-348 (2017).
  29. Andaluz, N., Zuccarello, M., Wagner, K. R. Experimental animal models of intracerebral hemorrhage. Neurosurgery Clinics of North America. 13 (3), 385-393 (2002).
  30. Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats. Stroke. 21 (5), 801-807 (1990).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish LarvaeHemorrhagic StrokeIntracerebral HemorrhageLive ImagingMotility AssayBrain HemorrhageNeuroinflammationFluorescent MicroscopyAtorvastatin TreatmentEthoVision XT

Related Articles