Здесь мы представляем протокол для введения крикет яйца, метод, который служит в качестве основополагающего метода во многих экспериментах в крикет, в том числе, но не ограничиваемся, РНК вмешательства и геномных манипуляций.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Инъекционные яйца Gryllus bimaculatus
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Изменение функции генов в развивающемся организме занимает центральное место в различных видах экспериментов. В то время как чрезвычайно мощные генетические инструменты были разработаны в традиционных модельных системах, трудно манипулировать генами или РНК-мессенджером (мРНК) в большинстве других организмов. В то же время эволюционные и сравнительные подходы опираются на изучение функции генов у многих различных видов, что требует разработки и адаптации методов манипулирования экспрессией за пределами в настоящее время генетически высоченных Видов. Этот протокол описывает метод инъекций реагентов в яйца крикета, чтобы оценить влияние данной манипуляции на эмбриональное или личиночное развитие. Описаны инструкции по сбору и инъекциям яиц с помощью саженотых игл. Этот относительно простой метод является гибким и потенциально адаптируется к другим насекомым. Можно собрать и впрыснуть десятки яиц в одном эксперименте, а показатели выживаемости для инъекций только буфера улучшить с практикой и может быть выше, чем 80%. Этот метод будет поддерживать несколько типов экспериментальных подходов, включая инъекции фармакологических агентов, in vitro capped mRNA для выражения генов, представляющих интерес, двухцепочечной РНК (dsRNA) для достижения РНК-интерференции, использование кластерных регулярно межпространственные короткие палиндромные повторы (CRISPR) в сотрудничестве с реагентами, связанными с CRISPR, белка 9 (Cas9) для геномной модификации, и транспозируемыми элементами для генерации переходных или стабильных трансгенных линий.
Введение
Способность изменять геном или влиять на экспрессию генов в организмах является основой для разработки многих типов экспериментов, тестируя функциональную причинность. Также крайне важно для сравнительной и эволюционно-соответствующей работы, чтобы методы геномной и негеномической модификации были доступны в организмах за пределами традиционных генетических лабораторных систем моделей животных (например, Mus musculus, Danio Рерио, Drosophila melanogaster, и Caenorhabditis elegans). Будь то желание понять разнообразие организма1 или свое соответствие принципу Крога, что для каждого биологического вопроса есть ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Установка оборудования и подготовка материалов
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, ознакомьтесь с таблицей 1 и таблицей материалов для подготовки решений, реагентов и деталей оборудования.
- Навязайте расчленяющий микроскоп, чтобы увидеть яйца и направить иглу для инъекций. (На рисунке 1А показан расчленяющий микроскоп, оснащенный флуоресценцией.) Способность флуоресценции является выгодным, но не необходимым.
- Позиция 3-осевой микроманипулятор для маневра инъекционной иглы на место(рисунок 1A).
- Настройка микроинж....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Сверчки легко откладывают яйца во влажный материал, и предоставление адекватного материала, такого как влажный песок или грязь, побуждает их отложить большое количество яиц. Это особенно эффективно, если сверчки сначала лишены яйцекладучий материал для 8-10 ч. Яйца, заложенные в чистый песок, могут быть легко разделены, собраны(рисунок 1B) и помещены в специально разработанные яичные колодцы для инъекций (рисунок1C). Рассекающий .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Двумя основными проблемами с этой техникой являются связанные с этим вопросы оптимального размера иглы и живучести. Хотя меньшие иглы улучшить живучесть, иглы с более узкими люминесцентными имеют большую степень капиллярных сил на работе, что делает его более вероятным, что желток будет двигаться в иглу заставляя его засорить. В лучшем случае, завалы могут быть очищены просто путем введения другого яйца или путем очистки иглы, как описано выше. Можно также попытаться увеличить давление баланса на микроинжектор, пока желт.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Исследования, о которых сообщалось в рамках этого проекта, были поддержаны премией институционального развития (IDeA) от Национального института общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под грантом P20GM10342 до HH3, а также номером премии NSF IOS-1257217 Цгэ.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Флуоресцентный препарирующий микроскоп | Leica | M165 FC | Стереомикроскоп с флуоресценцией |
| Внешний источник света для флуоресценции | Leica | EL 6000 | |
| Микроинъектор | Narishige | IM-300-Аксессуары | могут включать в себя держатель инъекционных игл, входной шланг (с разъемом для шланга), шнур питания переменного тока, ножной переключатель, силиконовую резиновую прокладку-фильтр |
| mCherryLeica | M205FA/M165FC | Фильтрующий куб для mCherry или аналогичного красного красителя подойдет | |
| для работы микроманипулятора | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Используется с магнитной подставкой (Narishige, тип GJ-8) |
| Магнитная подставка | Narishige | MMO-202ND | |
| Держатель пипетки (иглодержатель) | Narishige | HD-21 | |
| Трубка для подключения источника воздуха к микроинжектору | |||
| Штамп яйцевой скважины | 3D-печать | на заказ | 3D-печать на Lulzbot Taz 5 с использованием термопластика |
| Микроволновая печь | различных | ||
| инкубаторов или комнат с регулируемой температурой | различных | температур 23,5-26°С; С нужны. | |
| Корм для сверчков | различные | кошачьи корма или рыбные хлопья являются подходящими кормами. | |
| Вода для сверчков | vairous | Воду можно держать во флаконах и подавать сверчкам через ватные шарики Материалы | |
| укрытия для сверчков | могут | включать смятые бумажные полотенца или коробки из-под яиц | |
| Стеклянные капиллярные трубки | World Precision Instruments, Inc. | Артикул 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Капилляры из боросиликатного стекла, длина 100 мм, внутренний диаметр 0,58 мм, внешний диаметр 1,0 мм, с пуллером |
| микропипеток | Flaming/Brown | Model P-97 | Дистрибьютор Sutter Instrument Co. |
| Бевеллер/Микрошлифовальный станок | Narishige | Модель EG-45/EG-400 | EG-400 включает в себя микроскоп |
| Головка Петри | чашки CellTreat | Код товара 229693 | 90 мм в диаметре |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | Белый игровой песок |
| Агароза | Американский биоаналитический | AB000972 | Агароза GPG/LE сверхчистое |
| ситечко для яиц: сверхтонкая саржевая сетка из нержавеющей стали Конические ситечки | US Kitchen Supply | Модель SS-C123 | Размер пор должен быть от 0,5 до 1,0 мм |
| Пенициллин стрептомицин | Gibco от Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep |
| Пластиковый пинцет | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Черный статический рассеиватель, 118 мм |
| Шприцевые фильтры, диаметр 25 мм, 0.45 &; m | Nalgene | 725-2545 | Использование со шприцем объемом 1 мл |
| Шприц объемом 1 мл, с наконечником Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Использование со шприцем для фильтрации Буфер для инъекций, шприцы с наконечником Luer-Lok также подойдут |
| Воздушный резервуар (опционально) | Midwest Products | Air Works® | Переносной воздушный бак |
| Краситель на основе родамина | Thermofisher | D-1817 | декстран, тетраметилродамин 10 000 МВт, |
| 20 мл наконечники для загрузки | Eppendorf | No заказа 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μ L Микрозагрузчик |
| Составной микроскоп | Zeiss | Axioskope 2 плюс | |
| объектив 20x | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
| Камера | Leica | DMC 5400 | |
| Leica Application Suite программное обеспечение | Leica | LAS | версии 4.6.2 используется здесь |
Ссылки
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The Aug....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
