Торакальный спинной мозг гемисекции хирургии и открытого поля локомоторной оценки в Крыса

Повреждение спинного мозга (SCI) связано с серьезными нарушениями в двигательной, сенсорной и вегетативной функции. Экспериментальные животные модели SCI являются ценными инструментами для понимания анатомических и физиологических событий, связанных с патологией SCI, для исследования нервных механизмов в ремонте и восстановлении, а также для проверки эффективности и безопасности потенциальных терапевтических Мероприятий. Крыса является наиболее часто используемых видов в исследовании SCI¹. Крысиные модели являются низкими затратами, легко размножаются, и большая батарея поведенческих тестов доступны для оценки функциональных результатов². Несмотря на некоторые различия в расположении тракта, крыса спинного мозга акций в целом аналогичные функции сенсорной с более крупными млекопитающими, в том числе приматов^3,4. Крысы также разделяют аналогичные физиологические и поведенческие последствия ДЛЯ SCI, которые относятся к людям⁵. Нечеловеческие приматы и крупные модели животных могут обеспечить более близкое приближение человека SCI⁶ и имеют важное значение для доказательства безопасности лечения и эффективности до экспериментов человека, но менее часто используются из-за этических и благополучия животных соображения, расходы и нормативные требования⁷.

Крыса transection SCI модели выполняются целевым прерыванием спинного мозга с селективным повреждением с помощью вскрытия нож или иридэктомии ножницы после ламинэктомии. По сравнению с полной transection, частичный transection в крысы приводит к менее тяжелой травмы, легче послеоперационного ухода за животными, спонтанное восстановление локомотива, и более тесно модели SCI у людей, которые преимущественно неполным с частичной щадящей ткани, соединяющие спинной мозг и надспинальные структуры⁸. Односторонняя гемисекция нарушает все восходящие и нисходящие участки только с одной стороны, и производит количественно и высоко воспроизводимый дефицит локомотиводвигателей, усиливая изучение основных биологических механизмов. Наиболее заметным функциональным следствием гемисекции является первоначальный паралич конечностей на той же стороне и ниже уровня поражения с градуированным спонтанное восстановление локомотивной функции в течение нескольких недель^{9,10, 11 Год , 12}. Модель гемисекции особенно полезна для исследования нервной пластичности поврежденных и остаточных трактов и схем, связанных с функциональным восстановлением^{9,11,12, 13,14,15,16,17,18}. В частности, гемисекция выполняется на грудном уровне, т.е., выше спинного цепи, которые контролируют движение hindlimb, особенно полезно для исследования изменений в локомоторном контроле. Поскольку существует нелинейная связь между тяжестью поражения и восстановлением локомотора после SCI^19,соответствующее поведенческое тестирование для оценки функциональных исходов имеет первостепенное значение в экспериментальных моделях.

Всеобъемлющая батарея поведенческих тестов доступны для оценки конкретных аспектов функционального восстановления локомотива у крысы^2,20. Многие локомоторные тесты не обеспечивают надежные меры на ранней стадии после SCI, как крысы слишком отключены, чтобы поддерживать их вес тела. Мера спонтанной производительности локомотива, который чувствителен к дефициту рано после травмы, и не требует предоперационной подготовки или специализированного оборудования, является полезным для того, чтобы контролировать восстановление локомотива для соответствующих точек времени, в которых дополнять специализированное поведенческое тестирование. Мартинес открытого поля оценки оценка¹⁰, первоначально разработанный для оценки работы локомотива после шейки матки SCI в крысы, является 20-точечный ординатор оценки глобальной работы локомотива во время спонтанного наземного передвижения в открытое поле. Скоринг проводится отдельно для каждой конечности с помощью рубрики, которая оценивает конкретные параметры ряда локомоторных мер, включая движение суставных конечностей, поддержку веса, положение в цифре, способности шага, координацию передних конечностей и хвост Позиции. Оценка оценки происходит от Basso, Битти и Bresnahan (BBB) открытого поля рейтинговая шкала предназначена для оценки локомоторной производительности после грудной контузии²¹. Он адаптирован для точной и надежной оценки как передних конечностей, так и функции локомотива, позволяет независимую оценку различных параметров скоринга, которые не поддаются иерархическому скорингу BBB, и обеспечивает линейное восстановление профиль¹⁰. Кроме того, по сравнению с BBB, оценка оценка чувствительна и надежна в более тяжелых моделей травм^10,11,20,22. Оценка оценка была использована для оценки нарушения локомотива у крысы после шейки матки^10,12 и грудной⁹ SCI в одиночку и в сочетании с черепно-мозговой травмой²³.

Мы представляем здесь подробный пошаговый протокол для выполнения грудной гемисекции SCI на уровне T8 позвонков у самки крысы Лонг-Эванс, а также для оценки восстановления локомоторного локомотора задних конечностей в открытом поле.

Эксперименты, описанные в этой статье, были проведены в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными и были одобрены комитетом по этике Монреальского университета.

1. Торакальная гемисекционная хирургия

1. Носите соответствующее защитное оборудование (перчатки, маска и платье) для поддержания асептической среды для операции. Очистите хирургическую область с помощью спиртовых салфеток и поместите стерильные хирургические шторы над хирургическим полем. Стерилизовать хирургические инструменты и поместить на хирургическое поле.
2. Анестезируйка крысы под смесью изофлуранского газа (3% индукции, 0,5-3% обслуживания) и кислорода (1 л/мин). Подтвердите надлежащую хирургическую глубину анестезии, проверяя отсутствие щепотки и рефлекторных реакций роговицы. Непрерывно контролировать крысу в течение всей процедуры, и настроить количество анестезируетических родов, необходимых для поддержания хирургической глубины анестезии.
3. Бритье ствола между бедром и шеей, место крысы на хирургическом поле, дезинфицировать разрез сайт с алкоголем салфетки и провиодин раствор, и поддерживать температуру тела на 37 градусов по Цельсию с помощью обратной связи контролируемых нагревательной колодки контролируется ректальной Термометр.
4. Поместите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы держать их гидратированных и повторно на протяжении всей операции по мере необходимости.
5. Сделайте 2,5 см разрез ампелы на коже, накладывающий позвонки Т6-Т10 скальпелем. Удалите кожу и поверхностный жир с помощью тупых ножниц вскрытия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: T6'T10 позвонков сегментов могут быть определены либо ростралли по нежным пальпации спинного спинного сегмента позвоночника от основания черепа, начиная с заметным выступом^2-й грудной позвонок²⁴, или caudally пальпация самых задних плавающих ребер, которые будут вызывать движение в 13-й грудной позвонки.
6. Отделите парапозвонковые мышцы, вставляемые на тонкую сторону позвонков T7-T9, используя тупые ножницы для вскрытия и самосохраняющийся втягивающий сятрактор. Debride и очистить любые оставшиеся ткани с помощью тонких щипцы и хлопок наконечником аппликаторов подвергать спиннородных процессов и позвоночных ламина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этому и следующим шагам в значительной степени способствует микроскопическая визуализация (5–15 x).
7. Тщательно вырежьте грани (зигапофизиальные суставы) на двусторонней основе на позвонках T7 и T8 с нежными костными триммерами. Вырезать спинной соединительной ткани между T8 и T9 позвонков ламины поверхностно с скальпелем (1 мм глубины), стараясь не травмировать подкладка шнура.
8. Удалите спинной процесс позвонка T8 с костными триммерами. С изогнутыми гемостатическими щипцы тщательно зажаты на T7 спинной процесс, поверните каудальный конец T8 ламина слегка ростглина ( й 20 " вставьте кости триммеры под T8 ламина, и сделать средней линии разреза расширения вдоль ламина. Продолжить ламинэктомии, повторяя порезы на левой и правой стороне позвоночной ламины медиаль для поперечных процессов подвергать спинного мозга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы удалить все фрагменты костей, созданных из ламинэктомии.
9. Капаните лидокаин (2%, 0,1 мл) в открытый позвоночный канал и удалить dura наложения T8 спинного сегмента с помощью тонких щипц и ножницы иридэктомии. Повторите введение лидокаина в открытый шнур и определите средней линии шнура путем визуализации центральной линии, созданной между спиннозными процессами, простирающимися между открытым позвонком T7-T9.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наряду с спинновидной процессов на T7 и T9, подвергаются спинной корень ганглиев на T8 также может быть использован для оказания помощи идентификации средней линии и 30 G игла может быть помещена в средней линии шнура, чтобы помочь с последующим гемисекцией.
10. Гемисектировать спинной мозг от средней линии к одной стороне с рассекающим ножом. Будьте осторожны, чтобы не прорезать переднюю спинномозговую артерию на брюшной стороне (не применять твердое давление на тело позвонка). Используя ножницы иридэктомии, тщательно прорезать все оставшиеся ткани на пораженной стороне спинного мозга, чтобы обеспечить вентролатеральный квадрант надлежащим образом трансected.
11. Поместите стерильную соленую гемостатическую губку (6 х 2 мм) в облучение полости над спинным мозгом и шов мышечных слоев (4-0 полилактина 910). Далее шов кожи вокруг разреза сайта.
12. Обеспечить адекватный анальгетик (бупренорфин 0,05 мг/кг подкожного , антибиотик (энрофлоксацин, 10 мг/кг с.к.), и пополнить потерянные жидкости с помощью 5 куб.с. раствора лактированного звонаря (интраперитонеальный цир.) сразу после операции.
13. Удалите крысу из анестезии. Поместите крысу в теплую среду под грелкой или лампой (33 градусов по Цельсию) до полного пробуждения животного.
14. Обеспечить дополнительную обезболивающую ежедневно в течение первых 3 послеоперационных дней и постоянно контролировать признаки боли, потеря веса, неправильное micturition, инфекции, проблемы с заживлением ран, или аутофагии.

2. Процедура тестирования на открытом поле и оценка производительности локомотива

1. Обработка крыс ежедневно в течение 1 недели и привыкать их на арену в течение двух 5-минутных сессий до тестирования, чтобы акклиматизироваться к подобрали, мягко из середины ствола, в то время как в открытом поле и для обеспечения надежности измерения во время тестирования.
2. Поместите камеру на уровне земли перед круговой ареной с открытым полем для записи сеансов тестирования для автономного анализа (минимум 30–60 кадров/с).
3. Начните видеозапись и поместите крысу в центре арены в условиях тусклого света, чтобы стимулировать активность локомотивов.
4. Продолжить сеанс тестирования в течение 4 минут, чтобы обеспечить достаточное количество локомотивных приступов для анализа. Возьмите и замените крыс в центре арены, когда они остаются неподвижными дольше, чем 20 с для содействия передвижения.
5. Оценка локомотивной производительности записанного тестирования сессии, завершив рубрику, представленную вТаблица 1в соответствии с параметрами в следующих подразделах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно одержать оценку каждого параметра отдельно путем повторного просмотра записанного сеанса тестирования с помощью программного обеспечения, которое позволяет использовать переменную скорость воспроизведения и анализ кадра по кадру (например, медиаплеер VLC).
   1. Для суставных движений конечностей, оценка задних движений суставов во время спонтанного передвижения отдельно для лодыжки, колена и бедра, как нормальный (более половины диапазона движения, награжден оценка No 2), незначительные (менее половины диапазона движения, награжден оценка 1) или отсутствует (присужденная оценка No 0).
   2. Для поддержки веса, оценить способность мышц заднего конечностей разгибателя для сокращения и поддержки загружены веса тела, когда конечность находится на земле отдельно, когда крыса неподвижна, а также во время активного передвижения. Награда оценка 1, когда вес поддержки присутствует и оценка 0, когда вес поддержки отсутствует.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стационарная поддержка веса считается местом для активной поддержки веса.
   3. Для получения цифры оцените положение цифр задних конечностей, в то время как крыса неподвижна и во время передвижения. Награда оценка 2, когда задние цифры расширены, расположенные отдельно друг от друга, и тоник во время передвижения в более чем 50% от периода тестирования (считается нормальным). Награда оценка 1, когда цифры остаются преимущественно согнуты и оценка 0, когда цифры остаются преимущественно атонической.
   4. Для шага, завершить этот параметр только в том случае, если крыса может поддерживать свой вес тела во время шага. Оцените шагая по рейтингу ориентации размещения лап задних конечностей во время первоначального контакта и при подъеме с земли в дополнение к текучести фазы качели во время шага.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть 3 балла за этот параметр, описанный в следующих подразделах отдельно оценки: 1) осевой ориентации размещения лапы при контакте конечностей (дорсаль / подошвенный размещения), 2) продольная ориентация размещения лапы при первоначальном контакте и во время подъема (параллельно оси тела или вращается внутри/внешне), и 3) качество движения конечностей во время качели (регулярные или нерегулярные).
      1. Для размещения лапы при контакте конечностей, оценка осевой ориентации размещения лапы при контакте конечности, как 0, когда склады дорс на самом этом месте происходят в более чем 50% шагов.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Место размещения подошвенного считается perquisite для оценки ориентации лапы при контакте и подъеме (шаг 2.5.4.2), качели движения (шаг 2.5.4.3) и предыконечной-hindlimb координации (шаг 2.5.5).
      2. Для ориентации лапы при контакте конечности и подъеме, награда оценка 2, когда продольные лапы и осей тела параллельны и оценка 1, когда конечность вращается внешне или внутренне, отдельно для контакта конечностей и лифта.
      3. Для движения свинга, награда оценка 2, когда задние суставы двигаться в гармонично и регулярно во время качели и оценка 1, когда отрывистые или спазмочные движения суставов происходят во время качели.
   5. Для координации передних конечностей и хиндслимбов, завершить этот параметр только в том случае, если 4 последовательных шагов происходят во время тестирования, и если конечности могут активно поддерживать вес тела. Награда оценка 3, когда координация является последовательной (йgt;90% шагов), 2, когда частые (50-90% шагов), 1, когда случайные (злите; 50% шагов), или 0 при отсутствии (0% шагов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Координация forelimb-hindlimb определена как регулярное изменение в шагая между hindlimb будучи забиваемым и передним на такой же стороне тела.
   6. Для хвоста позиции, оценить хвост положение во время передвижения, как либо вверх (от земли, награжден оценка No 1) или вниз (прикосновение к земле, награжден оценка No 0).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повышенное положение хвоста во время передвижения является показателем стабильности ствола у крысы. После гемисекции, хвост, как правило, удерживается близко к земле или касаясь земли, как стабильность ствола нарушается.
   7. Добавьте индивидуальные баллы от каждого параметра, чтобы обеспечить в общей сложности для каждой задней конечности максимум 20 очков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка 20 указывает на нормальную производительность локомотива. Оценки злт;20 представляют собой увеличение количества локомотивных нарушений и оценка 0 указывает на паралич конечностей.

Воспроизводимые поражения с высокой степенью консистенции могут быть сгенерированы с помощью метода гемисекции. Для оценки и сравнения размеров поражений между экспериментальными группами, максимальная площадь поражения в процентах от общего поперечного сечения спинного мозга может быть легко рассчитана с гистологическим окрашиванием секций спинного мозга. На рисунке 1 показано репрезентативное поражения левого гемикорда и наложение доли максимальной площади поражения, разделяемых между крысами со средним размером поражения 47,3% и 4,0% поперечного сеченного шнура (n No 6).

Рисунок 1: Представитель поражений позвоночника. (A) Микрофотография корональной спинномозговой секции в эпицентре поражения от гемисектированной крысы, окрашенной кресиловым (клеточные тела, фиолетовый) и luxol быстро синий (миелин, синий) с указанием повреждения серого и белого вещества, сосредоточенного в левой hemicord. D, дорсал; V, вентрал; L, слева; R, право. Шкала бар: 1 мм. (B) Схематическая накладка общей доли максимальной области поражения в группе крыс (n No 6). Расположение скрещенного кортикоспинального тракта в спинном фуникусе с правой стороны затенено черным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Основным последствием гемисекции является первоначальный паралич задней конечности на стороне поражения в течение первых двух-трех послеоперационных дней. Локомоторная производительность более пострадавших задних конечностей быстро улучшается в крысы после гемисекции в течение первых нескольких недель после травмы. Небольшие дефициты в противоположной hindlimb обычно наблюдаются первоначально после hemisection, которые могут отражать компенсацию для более пострадавших конечностей, или дефицит в результате отсутствия постуральной стабильности, вес поддержки, и последовательной активизации. Большой и сохраняющийся дефицит в противоположном задней конечности будет означать двустороннее урезание, распространяющееся на противоположный гемикорд.

Образец локомоторной зачетной рубрики приводится в таблице 1.

Таблица 1: Образец скоринга листа. Пример локомотивной производительности забил рубрику. Для каждого параметра возможные оценки указаны в скобках. Я, внутренний; E, внешний; P, параллель; FL-HL, передний конечности-химлим. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Временной ход репрезентативных изменений в производительности локомотива в нетронутом состоянии и в течение первых пяти недель после левой стороны гемисекции в отдельных группах крыс (n No 6 в группе) изображен на рисунке 2.

Рисунок 2: Представитель времени курс изменений в hindlimb локомоторной производительности в открытом поле в нетронутом состоянии и в течение пяти недель после левой стороны грудной гемисекции. Производительность левой заднейконечности (A ) значительно нарушается от нетронутых значений в течение первых трех недель после гемисекции, и правой задней конечности (B) в течение первой недели после гемисекции. Данные отображаются как среднее групповое отклонение (SD; n no 6 на группу). Статистические анализы были проведены с Kruskal-Wallis непараметрических тестов дополнили Многочисленные сравнительные тесты Данн для оценки групповых различий между точками времени. р-р злт; 0,05,п. р.; 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Авторам нечего раскрывать.