Мы подробно описываем клинически рестазовы колоректального рака печени (CRLM) и влияние реперфузии ишемии печени (I/R) на рост опухоли и метастазы. Эта модель может помочь лучше понять механизмы, лежащие в основе хирургии индуцированной поощрения метастатического роста печени.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Murine Модель метастатических опухолей печени в настройке Ишемия Реперфузия Травмы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ишемия печени и реперфузии (I / R) травмы, общая клиническая проблема, остается неизбежным патофизиологический процесс, который, как было показано, вызывают множественные ткани и повреждения органов. Несмотря на последние достижения и терапевтические подходы, общая заболеваемость остается неудовлетворительной, особенно у пациентов с основными паранхимальными аномалиями. В контексте агрессивного роста рака и метастазирования, хирургический I / R подозревается в промоутер регулирует рецидив опухоли. Эта статья направлена на описание клинически реинную модель печени I / R и колоректального метастаза печени. При этом, мы стремимся помочь другим следователям в создании и совершенствовании этой модели для их обычной исследовательской практики, чтобы лучше понять влияние печени I / R на содействие метастазам печени.
Введение
Печень является одним из наиболее распространенных мест для развития метастатического заболевания1. Смертность почти всегда объясняется осложнениями, связанными с ростом опухоли в печени. У пациентов с метастатическими твердыми опухолями в печени, хирургия остается одним из важнейших вмешательства для борьбы с болезнью и возможного лечебного подхода. Тем не менее, подавляющее большинство пациентов в конечном итоге присутствует с рецидивирующимзаболевание заболеванием, преимущественно в печени2,3. Во время печеночной хирургии распространено внутриоперационное кровотечение, что часто требует переливания крови и различных технических подходов к борьбе с кровотечениями, включая сосудистые методы зажима. Однако такие меры вызывают печеночную ишемию/реперфузию (I/R) в ткани печени. Неблагоприятное воздействие I/R на гепатоцеллюлярную функцию хорошо задокументировано. Печень I / R оскорбление зажигает воспалительные каскады во время восстановления кровотока через воспалительные пути4. Мало того, что повреждение печени I/R способствует печеночной недостаточности, но текущие данные также показывают, что Травма I/R стимулирует адгезиюопухолевых клеток, а также способствует заболеваемости образованием метастазаций и росту существующих микрометастатических заболеваний 5. Ранее мы сообщали, что хирургический стресс вызывает активацию иммунных клеток, которая не только помогает в росте первичной опухоли, но и облегчает метастазирование путем захвата раковых клеток в циркуляции6.
Здесь мы подробно описываем технику для создания модели опухоли опухоли метации печени. В этой модели, мы также представляем метод, чтобы вызвать печеночной ишемии реперфузии травмы, которая действует как суррогатной хирургического стресса присутствует клинически во время гепатэктомии. Комбинированные методы инъекции рака и печеночной I/R могут успешно интерпретировать развитие CRLM у пациентов, перенесших первичную резекцию опухоли.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все протоколы о животных утверждаются Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию и соблюдаются в соответствии с Руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения (NIH). Инструменты, используемые для любой хирургической процедуры, были тщательно стерилизованы.
1. Первоначальная подготовка
- Перед введением раковых клеток в селезенку мыши, автоклав и стерилизовать все инструменты, которые будут использоваться во время процедуры.
- Стерилизовать и/или автоклав грелку, хирургические перчатки, марлю, ножницы, небольшие зажимы, сосуд, хирургические щипцы и держатель иглы.
- Подготовка послеоперационного анальгетика (0,1 мг/кг бупренорфина) для введения после спленэктомии и каждые 12 ч в течение 2 дней.
2. Клеточная культура
- Убедитесь, что раковые клетки свободны от заражения микоплазмой с помощью набора mycoplasma ELISA.
- Подготовьте раствор 500 мл модифицированной среды Dulbecco (DMEM) на 4 градуса Цельсия для культуры моринколокальных раковых клеток (MC38). Культивирование носителей должно быть дополнено 10% теплоинактивированной сывороткой крупного рогатого скота (FBS), 100 U/mL пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 15 мМ HEPES и 200 мМ L-глютамина.
- Культура раковых клеток в DNAse- и РНК-бесплатно колбу (75 см2). Инкубировать клеточную культуру в клетке/ткани увлажненныйинкубатор, содержащий 5% CO 2. Поддерживайте температуру на уровне 37 градусов по Цельсию.
- После того, как размножающиеся клетки достигают 90-100% сближи, аспирировать старые носители, мыть клетки с 1x фосфат-буферизированных соливовых (PBS), а затем лечить их с 1x трипсин (0,25%) чтобы отделить клетки от колбы.
- Соберите клетки в конической трубке 15 мл и центрифуге в течение 5 мин при 700 х г.
- Аспирировать средства массовой информации и мыть с 1x PBS в два раза повторение центрифугации.
- Продолжить для подтверждения жизнеспособности клеток путем окрашивания клеток с trypan синий пятно (0,4%).
- Пристойная концентрация клеток до концентрации 1 х 106 ячеек/ 100 Л в 1x PBS. Pipet клетки тщательно, чтобы избежать каких-либо сгустков. Держите раковые клетки на льду до инъекции.
3. Инъекционные опухолевые клетки
- Анестезия 8-12-недельный самец (C57BL6) мышей путем введения кетамина (150 мг/кг) и ксилазин (12 мг/кг) интраперитонена с помощью 1 мл 25 G (0,5 мм х 16 мм) иглы.
- Бритье брюшной кожи мышей с помощью клиперов, чтобы избежать каких-либо послеоперационных инфекций.
- Поместите мышей на систему втягивания магнитного фикатора. Подтвердите, что мыши полностью под действием анестезии, щипать нос или хвост.
- Добавьте сосуды в глаза, чтобы избежать сухости во время процедуры.
- Скруб повидон-йодный раствор (7.5%) к бритой брюшной стенке для дезинфекции кожи перед хирургическим разрезом.
- Сначала поднимите кожу зубчатыми щипками и сделайте разрез средней линии с помощью хирургических ножниц. Затем поднимите мышцы живота и брюшной полости, чтобы создать разрез средней линии длиной около 3 см (средний процесс с xiphoid, чтобы разоблачить содержимое брюшной полости. Будьте осторожны, чтобы не продлить разрез за процесс xiphoid, чтобы избежать обширных кровотечений.
- Поместите гемостат по обе стороны разреза и под процесс сифоида. Расширьте живот, потянув хвост вниз и лентой его. Используйте 6-дюймовый стерильный хлопчатобумажный наконечник аппликатора, чтобы отделить и выставить селезенку из жировой ткани поджелудочной железы.
- Перед инъекцией в селезенку, вихрь раковых клеток, чтобы избежать каких-либо клеточных сгустков.
- Используйте 0,5 мл 28 G (0,36 мм х 13 мм) инсулиншш для инъекций. Избегайте пузырьков воздуха.
- Медленно и осторожно впрысните 100 л клеток в кончик селезенки. Поместите кончик хлопка и добавить мягкое давление, чтобы избежать обратного потока в область живота. Успешная инъекция может наблюдаться путем выявления изменения цвета печени во время инъекции.
- Смочите стерильную марлю 1x PBS и поместите ее на расчлененный участок.
- Перенесите мышей на грелку на 15 минут, чтобы раковые клетки циркулировали в системе.
- Чтобы продолжить хирургическую ишемию и реперфузионную травму, выполните шаги 5.3-5.10.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура заключается в изучении эффекта I / R индуцированного создания метастатических очагов.
4. Спленэктомия
- Для выполнения спленэктомии используйте ручное устройство каутери. Аккуратно поднимите селезенку с гладкими щипками и прижигайте селезенки кровеносных сосудов, чтобы избежать чрезмерного кровотечения. Удалите селезенку путем перетаскивания сосудов на прикожной части.
- Сразу же после процедуры, закрыть разрез в двойном слое картины, сначала зашивание мышечного слоя, а затем кожи. Используйте 4-0 полипропиленовых швов как для брюшной стенки, так и для кожи.
- Перед повторением процедуры на другом животном, дезинфицировать все инструменты либо опрыскивание их 70% изопропанола или вставить их в ванну из биса.
- Поместите мышей обратно в оригинальные клетки и искать признаки бедствия и послеоперационной боли.
- Вводят послеоперационный анальгетик (бупренорфин 0,1 мг/кг) каждые 12 ч в течение 2 дней, чтобы избежать послеоперационной боли.
5. Ишемия реперфузии Травмы
- Через 5 дней после первой лапаротомии обезболивать мышей, вводя кетамин (150 мг/кг) и ксилазин (12 мг/кг) интраперитоне, используя 1 мл 25 G (0,5 мм х 16 мм) иглы. Выполните шаги 3.3-3.4.
- Скруб повидон-йодный раствор (7.5%) на бритой живот мыши для дезинфекции кожи и выполнения лапаротомии средней линии, как описано выше в шаге 3.6.
- Используя два увлажненных кончиков хлопка, аккуратно переместите кишечник из полости, чтобы выставить связанные структуры, в том числе портальные вены. Вскрыть печени hilum свободной от окружающих тканей.
- Поднимите медиану и оставить боковые доли против диафрагмы. Отделите четырехкратную долбу от левой боковой доли, вскрывая гилум печени с помощью первесных ножниц с помощью операционного микроскопа, чтобы обеспечить четкую видимость к структуре триады портала.
- Поместите небольшой влажный ватный тампон между средней долей и правой боковой долей, чтобы создать достаточно места для зажима. Используя щипши с конвейера сосуда, тщательно пройдите 10-сантиметровую нить (4,0 полипропиленового шва), чтобы поднять порталную триаду. Окклюзия всех структур в портал триады (печеночная артерия, портальная вена, и желчные протоки) в левую и средний доли печени, поставив микрососудистый зажим с помощью микро-серретонкий зажим аппликатор с замком.
- Если доли не показывают значительного бланширования, отрежь зажим, удалив и повторно нанесите.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если немедленное бланширование печени не происходит даже после сравливания зажима, тщательно продумайте, следует ли продолжать i/R. - Удалите небольшой ватный тампон, расположенный между медианой и правой боковыми долей. Аккуратно замените кишечник в брюшную полость. Накройте брюшную стенку влажной марлей (пропитанной 1x PBS) и накройте полиэтиленовой пленкой, чтобы свести к минимуму испаряющие потери.
- Поместите мышь на грелку и нанесите зажим на 60 мин.
- На протяжении ишемического интервала, искать доказательства травмы ишемии, визуализируя бледно бланширование правой медиальной и левой медиальной и боковой долей.
- Инициировать реперфузию, удалив зажимы после 60 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Доказательства реперфузии можно наблюдать при немедленном изменении цвета медианы и оставленных боковых долей. - Сразу же после реперфузии, закрыть разрез с двойным слоем шов шаблон, сначала зашивание мышечного слоя, а затем кожи. Используйте 4-0 полипропиленовый шов с помощью держателя иглы, чтобы закрыть брюшную стенку и кожу.
- Перед повторением процедуры на другом животном, дезинфицировать все инструменты либо опрыскивание их 70% изопропанола или вставить их в ванну с подогревом биса.
- Поместите мышей обратно в оригинальные клетки и искать признаки бедствия и послеоперационной боли.
- Вводят послеоперационный анальгетик (0,1 мг/кг бупренорфина) каждые 12 ч в течение 2 дней, чтобы избежать послеоперационной боли.
- Для печени I / R фиктивных мышей, выполнять лапаротомии, hilum вскрытия и брюшной швы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Роль хирургического стресса, влияющих на создание метастазов печени могут быть исследованы с помощью двух различных экспериментальных конструкций. Вышеупомянутый протокол(Модель-1) используется для установления микрометастатических заболеваний печени и изучения влияния печени I / R на их рост(рисунок 1A) . Кроме того, инъекция печени I/R и опухоли может быть выполнена одновременно(Модель-2)для изучения влияния травмы I/R при создании новых метастатических очагов (рисунок1B). Для этого впрысните раковые клетки в селезенку, как описано выше, и дайте им циркулировать в течение 15 мин. Выполните печеночную I/R или фиктивную операцию после циркулирующего периода в течение 60 мин. Выполните боковую спленэктомию 60 мин позже, а затем закройте разрез лапаротомии.
6. Оценка прооперированных мышей
- Во время хирургической процедуры убедитесь, что мыши находятся под влиянием третьей стадии анестезии, выполняя пальпебральный и роговицы рефлекс тест. Дополнительная анестезиологическая доза должна быть предоставлена при признаках рефлексов.
- Обеспечить послеоперационный анальгетик (Бупренорфин 0.1мг/кг) сразу после операции и каждые 12h в течение 2 дней, чтобы избежать послеоперационной боли.
- Разрешить мышам 30-60 мин времени восстановления от анестезии. Постоянно следите за мышами и не оставляйте их без присмотра до полного выздоровления.
- Ищите сигналы бедствия, такие как сгорбившись назад, закрытые глаза, медленное движение, и неспособность жениха. Лечить соответственно, пока мыши вернуться к своей нормальной деятельности.
- Супплиментальный уход, включая жидкости, тепло, йохимбин реверсивного агента для ксилазина, мягкие бумажные полотенца постельных принадлежностей (чтобы избежать аспирации) должны быть предоставлены после операции, чтобы улучшить период восстановления.
7. Оценка травмы реперфузии печени
- Сразу же после нанесения зажима, убедитесь, что бледное бланширование средних и левых боковых долей происходит по сравнению с caudate и четырехъядерных долей.
- Оцените травмы ишемии печени путем измерения уровня сыворотки аланина трансаминазы (sALT), аспартатной трансаминазы (sAST) и сывороточной лактата дегидрогеназы (sLDH). Кровь может быть взята из лицевой вены для извлечения сыворотки 3-6 ч после начала реперфузии. Выполните гистологию печени, чтобы проанализировать процент области опухоли в ишемической доле.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Все мыши дикого типа (C57BL6) (n No 20) подвергались модели метастазов печени с использованием описанного выше протокола. Все инъекционные мыши с или без ишемии реперфузии травмы выжили до даты жертвоприношения. Схематическая диаграмма Рисунок 1A рака инъекционной печени иллюстрирует зажим портала триады (печеночная артерия, портальная вена, и желчный проток), который вызывает частичный ишемический печени (70%) оскорбление по отношению к медиане и левые боковые доли. Увеличение числа метаста...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Модель животных, описанная в этой рукописи, основана на двух основных подходах. Во-первых, признать способность раковых клеток к локализации и размножаться в доле печени. Во-вторых, для изучения влияния печеночной ишемии реперфузии травмы, влияющие на рост опухоли и метастазов. Данная модель позволяет проводить соответствующее исследование метастазах печени при отсутствии вторичных метастазах у иммунокомпетентной мыши. Эта модель полезна для решения вопросов метастатического повышения эффективности, таких как экстравазир...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не раскрывают никаких конфликтов интересов, относящихся к этой работе.
Благодарности
Авторы благодарят Сару Минемайер и Александра Комерчи за лингвистическую ревизию.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Lonza | 12-614F | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | Lonza | 900-108 | |
| L-глутамин | Gibco | 25030-081 | |
| Пеницилин | Фишер научный | 15-140-122 | |
| Стретомизин | Фишер научный | 15-140-122 | |
| HEPES | Фишер научный | ||
| Трипсин | Гиклон | sh30042.02 | |
| Колба для клеточных культур 75см | 5 клеток Звезда | 658170 | |
| 15мл ПП Конические пробирки | BioExcell | 41021037 | |
| Трипан синий морилка | Giibco | 15250-061 | |
| Марля | Fisherbrand | 1376152 | |
| Cautry | Bovie | AA01 | |
| Микрососудистый зажим | Finescience tools | 18055-03 | |
| Micro-Serrefine Аппликатор зажима с замком | Fine science toosl | FST-18056-14 | |
| Пружинные ножницы | Fine science toosl | FST-15021-15 | |
| Сосудистый расширитель | Fine science toosl | FST-00276-13 | |
| Магнитный фиксатор Система втягивания | Fine наука тоосл | FST-18200020 | |
| Микро-адсонский щипцы | Fine science toosl | FST-11019-12 | |
| Микро-адсонский щипцы | Fine science toosl | FST-11018-12 | |
| 4-0 полипропиленовый шов | Ethicon | K881H | |
| Иглодержатель | Harvard Apparatus | 72-8826 | |
| Грелка | Fisher scientific | ||
| Машинка для стрижки | Oster | 559A | |
| Раствор повидона-йода | Medline | MDS093945 | |
| Шприц 1мл 25г | BD безопасность Glide | 305903 | |
| Инсулиновый шприц 0,5 мл | BD инсулин Шприцы | 32946 | |
| Аппликатор с ватным наконечником | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Хирургический Микроскоп | Leica | LR92240 | |
| Mycoplasma Elisa Kit | Roche | 11663925910 | |
| кетамином | Putney | #056344 | |
| Xylazine | NADA | #139-236 | |
| ALT strip | Heska | 15809554 | |
| AST strip | Heska | 15809542 | |
| LDH strip | Heska | 15809607 |
Ссылки
- Riihimäki, M., Hemminki, A., Sundquist, J., Hemminki, K. Patterns of metastasis in colon and rectal cancer. Scientific Reports. 6 (1), 29765(2016).
- Oki, E., et al. Recent advances in treatment for colorectal liver metastasis. Annals of gastroenterological surgery. 2 (3), 167-175 (2018).
- Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
- van Golen, R. F., Reiniers, M. J., Olthof, P. B., van Gulik, T. M., Heger, M. Sterile inflammation in hepatic ischemia/reperfusion injury: present concepts and potential therapeutics. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28 (3), 394-400 (2013).
- Demicheli, R., Retsky, M. W., Hrushesky, W. J. M., Baum, M., Gukas, I. D. The effects of surgery on tumor growth: a century of investigations. Annals of Oncology. 19 (11), 1821-1828 (2008).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. Journal of Visualized Experiments. (10), 484(2007).
- Elkin, M., Vlodavsky, I. Tail vein assay of cancer metastasis. Current Protocols in Cell Biology. 19 (19.2), (2001).
- Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: A practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9 (1), 29(2009).
- Frampas, E., Maurel, C., Thedrez, P., Le Saëc, P. R. emaud-, Faivre-Chauvet, A., Barbet, J. The intraportal injection model for liver metastasis: Advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), G682-G688 (2016).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
