Method Article

Измерение BK-полиомавируса Некодирования Контроль региона Driven транскрипционной активности через поток цитометрии

DOI:

10.3791/59755

⸱

July 13th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen, 2Institute for Virology, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen, 3Center for Translational Medicine, Medical Department I, Marien Hospital Herne, University Hospital of the Ruhr-University of Bochum, 4Department of Infectious Diseases, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen Hufelandstr

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи представлен протокол для выполнения FACS-измерения транскрипционной активности BK-полиомавируса с помощью клеток HEK293T, трансфицированных двунаправленным репортером плазмидом, выражающим tdTomato и eGFP. Этот метод позволяет дополнительно количественно определить влияние новых соединений на вирусную транскрипцию.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полиомавирусы, такие как BK-полиомавирус (BKPyV), могут вызывать тяжелые патологии у пациентов с ослабленным иммунитетом. Однако, поскольку высокоэффективные противовирусные препараты в настоящее время отсутствуют, необходимы методы измерения воздействия потенциальных противовирусных препаратов. Здесь, двойной флуоресценции репортер, который позволяет анализ BKPyV не-кодирования контроля региона (NCCR) инициативе ранней и поздней активности промоутера был построен для количественной оценки воздействия потенциальных противовирусных препаратов на экспрессию вирусных генов через tdTomato и eGFP Выражение. Кроме того, путем клонирования BKPyV-NCCR ампликонов, которые в этом протоколе были образцово получены из крови полученных ДНК иммунокомпромиссных пациентов пересадки почек, влияние NCCR-перестановки на экспрессию вирусного гена может быть определено. После клонирования пациента, полученных ампликонов, HEK293T клетки были трансфицированы с репортером плазмиды, и лечение с потенциальными противовирусными агентами. Впоследствии клетки были подвергнуты FACS-анализ для измерения средней интенсивности флуоресценции 72 ч после трансфекции. Для проверки анализа препаратов, которые имеют потенциальный клеточный цикл ингибирующего эффекта, используются только трансфицирующие и, таким образом, флуоресцентные клетки. Так как этот анализ проводится в больших T Антигена выражая клетки, влияние раннего и позднего выражения могут быть проанализированы в взаимно независимым образом.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полиомавирусы представляют собой независимое семейство небольших двухцепочечных вирусов ДНК (DsDNA) с вирусом Simian 40 (SV40) в качестве прототипа вида. Первичная инфекция в основном происходит в детстве, которые обычно проходят без симптомов заболевания и обычно вызывают скрытые инфекции у иммунных компетентных хозяев. BK-полиомавирус (BKPyV) в основном сохраняется в клетках почек труб, не вызывая нефропатологии, однако, в случае нарушения иммунокомпетентности после пересадки почек вирус может реактивироваться и вызвать серьезные повреждения и нарушения трансплантата функции при достижении высокой виремии (1 х 104 BKPyV копии ДНК / мл)1,2. Примерно в 10% реципиентов пересадки почки реактивация BK-полиомавируса (BKPyV) приводит к полиомавирусу, связанному с нефропатией (PyVAN), которая была до 80% связана с высоким риском отказов почечного аллотрансплантата3,4 . Поскольку утвержденных противовирусных препаратов нет, текущая терапия основана на снижении иммуносупрессии. Интересно, что ингибиторы mTOR, кажется, имеют противовирусный эффект; Таким образом, переключение иммуносупрессивной терапии на основе mTOR иммуносупрессии может представлять собой альтернативный подход для предотвращения прогрессирования виремии BKPyV5,6,7. Тем не менее, на основе mTOR противовирусный механизм в настоящее время все еще не полностью поняты. Таким образом, требуются методы измерения воздействия потенциальных противовирусных препаратов в клинически значимых концентрациях.

Круговой геном BKPyV состоит примерно из 5 кб укрывательство некодирования области управления (NCCR), который служит источником репликации и одновременно двунаправленный промоутер вождения выражение ранней и поздней фазы мРНК стенограммы. Так как спонтанно происходящие NCCR-перестановки, удаления и дублирования находятся в патогенных BKPyV8 и значительно накопленные у пациентов, страдающих от PVAN5,9, сравнение архетипических (WT) и переорганизованы (rr) NCCR-деятельности полезны для характеристики вирусных репликационных фитнес.

Как резюмируется на рисунке 1, этот протокол описывает широко используемый метод для измерения BKPyV NCCR транскрипционной активности путем количественной оценки флуоресценции двух фторофоров tdTomato и eGFP, выраженный от репортера плазмид5, 9,10,11. Процедура проводится в присутствии большого T-антигена SV40 (lTAg), который позволяет анализировать влияние потенциальных противовирусных препаратов на ранние и поздние NCCR-активности отдельно5. Этот анализ далее анализирует влияние перестановок на деятельность НККР и сравнение с wt-NCCRs5,9. Репортер плазмид гавани SV40 конце полиаденилации сигнала вниз по течению каждого флюорофора открытой рамки чтения для обеспечения сопоставимой и эффективной обработки как стенограммы для tdTomato и eGFP, соответственно. По сравнению с qRT-PCR на основе методов5,12, этот подход на основе FACS представляет собой низкую стоимость и высокую пропускную плату совместимой альтернативой, поскольку нет сложных протоколов экстракции для инфицированной культуры клеток и не дорого антитела для иммунной флуоресценции окрашивания необходимы. Кроме того, поскольку определенное количество флуоресцентных клеток анализируются с помощью цитометрии потока, анализ ингибирующих клеточного цикла также возможен в количественном выражении.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол следует руководящим принципам человеческих исследований, утвержденным комитетом по этике медицинского факультета Университета Дуйсбурга-Эссена (14-6028-BO).

1. Сбор образцов крови или мочи и изоляция ПОЛиомавируса ДНК

  1. Соберите не менее 3 мл крови в трубках ЭДТА или моче в трубках приобретения.
  2. Центрифуги образца на 2500 х г в течение 15 мин. При необходимости, pipette плазмы в новую трубку и хранить образцы плазмы при 4 градусах по Цельсию в течение нескольких дней или заморозить при -20 градусов по Цельсию для более длительного хранения.
  3. Приготовьте 40 л протеиназы K в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл и добавьте 400 л плазмы путем пайпетирования.
  4. Выщелачить образец, добавив 400 qL буфера лисиса, вихрь на 15 с, и инкубировать в течение 10 минут при 56 градусах Цельсия.
  5. Изолировать ДНК с помощью комплекта для извлечения крови ДНК, как описано в инструкциях производителя. Кратко добавьте спирт и нагрузите lysates на колонку закрутки содержа мембрану на основе силиков на основе силиверницы ДНА. Вымойте столбцы несколько раз, чтобы дать чистую ДНК.
  6. Выясните полученную ДНК в 30-50 л буфера TE.

2. Усиление региона контроля за некодированием (НККР)

  1. Выполните следующую процедуру в физически разделенных комнатах. Используйте изолированную комнату для подготовки реагентов и распространения смеси на пЦР труб.
  2. Подготовьте Master Mix для предварительного PCR с помощью грунтовой пары A (Таблица 1) в общем объеме 50 Зл и используйте ранее изолированную ДНК со ступени 1.6. Схема трубации для подготовки мастер-микс для доистого и вложенного ПЦР напечатана в таблице 2.
  3. Распределите 45 qL мастерской смеси в трубки ПЦР.
  4. Добавьте 5 зЛ изолированной ДНК в пЦР-трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте другую комнату, чем для подготовки мастер смеси, чтобы избежать загрязнения.
  5. Выполнить ПЦР с условиями реакции, как показано в таблице 3. Повторите денатурацию, аннулирование и расширение в 35 циклах.
  6. Для вложенного усиления использовать грунтовую пару B укрывательство места ограничения для AgeI и SpeI (Таблица 1).
  7. Запустите вложенный ПЦР с условиями реакции, описанными в шагах от 2,2 до 2,5 с использованием 5 ЗЛ предварительного ПЦР.
  8. Смешайте 10 зл пЦР продукта с 2 Л 6x гель загрузки красителя. Загрузите 10 л смеси на 1,5% агарозного геля и запустите гель в течение 30 мин при 60 мА.
  9. Визуализируйте гель с помощью соответствующей системы УФ-документации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер ампликона, как ожидается, будет между 300-500 bp в зависимости от того, перестановки (удаления, вставки, или дублирования) произошло (Рисунок 2C).
  10. Очистите ампликоны ПЦР с помощью комплекта для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя. Выщелачить ампликоны ПЦР в 30 зликатных буферах.
  11. Отправить амблоны для секвенирования Сэнгера с помощью грунтовой пары B.

3. Клонирование NCCR в двойной флуоресценции репортер

  1. Дайджест очищенных ампелонов (шаг 2.10) с AgeI и SpeI для 2 ч при 37 градусах По Цельсию, как описано в таблице 4.
  2. Повторите шаг 2.10 и очистите переваренные ампелоны.
  3. Параллельно, также переварить плазмидной позвоночник (1,5 мкг) с AgeI и SpeI для 2 ч при 37 градусов по Цельсию, как описано в таблице 5. Этот шаг должен быть выполнен только один раз. Для последующих реакций заморозьте пищеварение при -20 градусов по Цельсию.
  4. Проанализируйте переваренный плазмид позвоночника на 0,8% низким расплава агарозный гель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не запускайте гель с током выше 40 мА. Ожидаемая вставка области spacer первоначально получена из плазмидного pEX-K4 2-LTR CD313 составляет 128 б.п.(рисунок 2C).
  5. Визуализируйте фрагменты ДНК с помощью длинноволнового ультрафиолетового света (320 нм) и вырежьте магистральной полосы с помощью чистого скальпеля. Перенесите фрагмент низкого цемного геля в новую микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. Избегайте длительного времени воздействия УФ-излучения, чтобы предотвратить повреждение ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Так как низкий расплавленный агарозиспользуется используется, нет необходимости очищать ДНК перед перевязкой.
  6. Нагрейте позвоночник, содержащий низкий расплава агароуз кусок в течение 10 мин при 65 градусов по Цельсию для того, чтобы расплавить кусок геля и смешать каждые 2 мин нежным вихрем. Расплавленный гель может быть непосредственно использован для перевязки.
  7. Свагните позвоночник и переваренный ампликон с использованием T4 ДНК лигаза в течение ночи в 16 градусов по Цельсию, используя схему, показанную в таблице 6.
  8. Выполните преобразование в кишечной палочке с использованием метода теплового шока, пластины бактерий на пластинах LB-усилителя, и культуры при температуре 37 градусов цельсия в течение ночи.
  9. На следующий день выберите три положительных клона и подготовьте ночные культуры кишечной палочки (5 мл LB-Amp) и культуру при 37 градусах Цельсия.
  10. Изолировать плазмид-ДНК с помощью стандартных протоколов, как описано в другом месте14, выполнить AgeI и SpeI пищеварения, чтобы проверить на наличие положительных клонов и визуализировать вырезать фрагменты на 1% агарозный гель. Полоса spacer (128 bp) будет заменена более крупной NCCR-последовательностью (300-500 bp, см. выше).
  11. Отправить плазмида для секвенирования Сэнгера с помощью грунтовки EGFP-N или грунтовой пары B(Таблица1).
  12. Поскольку мутации могут происходить спонтанно, сравните результаты секвенирования с результатами секвенирования, полученными с ампрономном. Используйте только клоны, содержащие идентичные последовательности по сравнению с ампрононом.
  13. Используйте молекулярное программное обеспечение workbench (например, бесплатное ПРОГРАММНОе обеспечение GENtle 1.9.4 или другие программы редактирования последовательности) для выравнивания и редактирования полученных последовательностей(рисунок 3).
  14. Начните GENtle 1.9.4 и импортируйте последовательности ДНК, нажав на кнопку Импорта (зеленая стрелка вниз).
  15. Затем нажмите на инструмент и выберите выравнивание из меню (используйте Ctrl'G в качестве ярлыка) и выберите последовательности ДНК для выравнивания.
  16. Добавьте последовательность к выравниванию, нажав на Добавить или удалить последовательность, нажав на Удалить. Включите архетипическую последовательность консенсуса NCCR как JN19243815, не используйте NCCR-последовательность от обыкновенно используемого Dunlop-strain16, в виду того что он гавани перестановки и дублирования другие чем archetypical BKPyV Штаммов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: NCCR уже содержит переводный кодон начала(рисунок 3).
  17. Выберите метод выравнивания, нажав на Алгоритм в панели инструментов и выберите clustal W. Установите параметры выравнивания, чтобы соответствовать 2; штраф расширения разрыва -1; штраф зазора -2 и нажмите на OK, чтобы запустить выравнивание.

4. Переходная трансфекция клеток HEK293T с плазмидом репортера и лечение с потенциальными противовирусными агентами

  1. Для подготовки достаточного количества плазмидной ДНК для последующих экспериментов трансфекции подготовьте 150 мл ночной культуры. Изолировать плазмидную ДНК с помощью плазмидного изоляционного комплекта. Кроме того, могут быть использованы другие наборы плазмидной очистки.
  2. Семена 1 х 105 HEK293T клетки в DMEM, содержащие 10% FCS, пенициллин и стрептомицин (1x) в колодец 12-хорошей пластины 24 ч до трансфекции и инкубировать ночь на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 для поддержания активного распространения во время трансфекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быть примерно 80% конфлюентприратива при трансфекции.
  3. Поместите 250 л уменьшенных носителей сыворотки в стерильную трубку и добавьте 1 мкг каждого репортера плазмид ДНК и аккуратно перемешайте путем пайпетирования.
  4. Добавьте 3 qL трансфекционного реагента в смесь ДНК, аккуратно перемешайте пайпеттингом и инкубируйте в течение 15 мин. Предварительно разогреть трансфекционный реагент до температуры окружающей среды 22 градусов по Цельсию и вихря осторожно перед использованием.
  5. Добавить смесь дроп-мудрый в колодцы и осторожно распределить в колодец.
  6. После 4 ч замените супернатант свежим носителем, содержащим испытательные агенты и контроль растворителя. Инкубировать при 37 градусах Цельсия до анализа. В этом примере использовались ингибиторы mTOR INK128 (100 нг/мл) и рапамицин (100 нг/мл).

5. Флуоресцентная микроскопия и цитометрия потока

  1. Проверьте клетки на наличие красной и зеленой флуоресценции под флуоресцентным микроскопом(рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Красная и зеленая флуоресценция соответствует ранней и поздней экспрессии гена BKPyV, соответственно.
  2. После 72 ч после трансфекции, аспирируйте супернатант и мыть клетки дважды с 1 мл холодного PBS.
  3. Аккуратно добавьте 500 л трипсина и слегка поверните тарелку, чтобы избежать преждевременного отслоения клеток. Этот шаг важен, чтобы избежать сдавливов клеток.
  4. После добавления, удалите трипсин непосредственно с тем же наконечником пипетки.
  5. Инкубировать клетки в течение по крайней мере 5 мин при 37 градусах Цельсия.
  6. Отсрояните пробифицированные клетки с 1 мл PBS, содержащего 3% FCS, и перенесите подвеску в предварительно маркированные трубки FACS.
  7. Добавьте DAPI (1 мкг/мл) до анализа FACS.
  8. Проанализируйте клетки с помощью цитометра потока. Для каждого образца, измерить по крайней мере 10000 живых клеток, которые являются отрицательными для DAPI окрашивания.

6. Анализ данных

  1. Импортируйте данные в программное обеспечение для анализа цитометрии потока и добавляйте образцы нажмите кнопку и перетащите в рабочее пространство.
  2. Дважды нажмите на импортируемый файл и создайте график. Выберите FSC-A против SSC-A, нажав на x- и y-оси. Ворота основной популяции клеток, нажав на полигон на панели инструментов и обрамление ячейки населения (рисунок5). Назовите выбранную популяцию ячеек по мере необходимости (например, «одиночные ячейки»). "Единичные ячейки" появятся как новое рабочее пространство.
  3. Продолжить с gating "одиночные клетки" для DAPI отрицательный (т.е. "живые клетки"). Для идентификации живых клеток сравните популяцию клеток с и без окрашивания DAPI. В обоих участках выбирайте FSC-A против pacific-blue-A.
  4. Нажмите на прямоугольник и выберите DAPI отрицательной популяции клеток, назовите выбранную популяцию клеток "живыми клетками" и создайте новый точечный участок, показывающий FITC (eGFP) по сравнению с PE (tdTomato), как описано ранее.
  5. Добавьте квадранты в «живые клетки», выбрав квадроцикл из панели инструментов. Ворота населения, перетаскивая центр квадранта к краю каждой популяции. Квадранты представляют 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM, 3) eGFP-tdTOM-, 4) eGFP-tdTOM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за спектрального наложения спектра выбросов между FITC и PE, первоначальная компенсация имеет важное значение для разграничения красных и зеленых сигналов и для достижения точных результатов.
  6. Определите средние интенсивности флуоресценции (МФО), нажав на квадрант и выбрав Добавить Статистика. Выберите среднее и нажмите OK. Средний МФО в настоящее время отображается ниже населения в разделе "статистика". Квадранты 2 и 4 соответствуют раннему выражению, в то время как квадранты 3 и 4 представляют позднее выражение.
  7. Добавление дополнительных репликов таким же образом для статистической мощности.
  8. Для интерпретации данных сюжет Значения МФО раннего и позднего в барный сюжет:
  9. Для сравнения деятельности NCCR, полученной от различных доноров или штаммов вирусов, добавьте архетипический контроль или штамм Dunlop16 и установите его относительные МФО до 100%, и вычислите относительные значения МФО. Повторите с каждым репликацией и определите среднее и стандартное отклонение.
  10. Чтобы оценить влияние потенциальных соединений на транскрипционную активность, установите контроль растворителя на 100% и подогнайте МФО обработанных клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом репрезентативном эксперименте, BK-полиомавирус Не-Кодирование Контрольный регион управляемых транскрипционной активности была измерена с помощью цитометрии потока. Кроме того, ингибитор mTOR, который может быть использован для лечения пациентов после реактивации BKPyV, был протестирован на его ингибирование вирусной ранней экспрессии генов. С этой целью, двойной флуоресценции репортер ассс был использован как опубликованные ранее5. Общая схема рабочего проце...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье представлен широко используемый метод, позволяющий проводить анализ некодирующего контроля региона BKPyV (NCCR), ориентированного на раннюю и поздняя активность промоутера. Активность NCCR может быть измерена одновременно и не нуждается в лизисе трансинфицированных клеток. Кроме того, можно проанализировать относительно большое количество клеток и не требуется совместное использование дополнительных маркеров для нормализации значений флуоресценции.

Важной частью этого метода явля...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иоганнес Корт получил гранты на гонорар и командировочные расходы от Astellas и Novartis. Марек Видера получил консультационные сборы от Novartis. Оливер Витцке получил гранты на клинические исследования, гонорар докладчика, гонорар и путевые расходы от Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, Correvio, Chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. F. K'hler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi и TEVA.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Барбару Бликманн за отличную техническую помощь. Эти исследования были поддержаны IFORES-программой Медицинской школы Университета Дуйсбурга-Эссена и riMUR-программой Университетского альянса Рур и Научно-исследовательского центра Меркатора Рура (MERCUREl). Авторы благодарят юрген-Маншот-Стифтунг за докторскую стипендию Хелен Елене Серцниг и постоянную поддержку. Сбор и использование материалов для пациентов утверждены комитетом по этике медицинского факультета Университета Дуйсбург-Эссен (14-6028-BO).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Лестница 100 bpNEBN3231Любая лестница с дальностью до 1 кб может быть заменена
2-х логовая лестницаNEBN0550Любая лестница с дальностью до 10 кб может быть заменена
Агар-Агар, Кобе IКарл Рот5210.3
AgeI-HFNEBR3552
Ампициллин Natriumsalz CellpureCarl RothHP62.1
Aqua ad iniectabiliaBbraun2351744может быть заменен любым производителем
BD FACSCanto™ IIBD Biosciences
BD FACSDivaBD Biosciences
DAPISigma10236276001
DFC450C модуль камерыLeicaЛюбая камера может быть использована
DMEMGibco41966-029может быть заменена любым производителем
DMIL LED микроскопLeicaЛюбой флуоресцентный микроскоп может быть использован
DNA Blood Mini KitQiagen51104может быть заменен любым производителем
E.coli DH5alpha Компетентные клеткиThermo Scientific18258012
FBS SuperiorMerckMillipore50615Любой FBS может быть использован
FlowJo v10.5.3FlowJo, LLCЛюбое программное обеспечение для проточной цитометрии FBS может быть использовано
Gel Loading Dye, Purple (6X) NEBB7024Любой 6-кратный загрузочный краситель может быть заменен
HEK293T клеткахATCC11268Эти клетки конститутивно экспрессируют большой Т-антиген вируса обезьян 40 (SV40), а клон 17 был выбран специально из-за его высокой трансфицируемости.
HERAcell® 240i CO2 IncubatorThermo Scientificможет быть заменен любым производителем
HotStar PCR kitQiagen203203
Intas Gel Система документированияIntasЛюбая система визуализации окрашенной ДНК, содержащей агарозные гели, может быть использована
Low Melt AgaroseBiozym850081может быть заменен любым производителем
Opti-MEMInvitrogen31985070может быть заменен любым производителем
pBKV (34-2)ATCC45025Плазмида, содержащая полноразмерный геном BKPyV штамма Dunlop; был использован в качестве положительного контроля; Счет: KP412983
PBSGibco14190-136
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal CyclerBio-Radснят с производства Любойтермоамплификатор может быть использован
PCR Nucleotide Mix, 10 мМPromega#C1145может быть заменен любым производителем
PCR1 и PCR2 Праймерыметабионне применимОбессоленный. Разбавить до (10 &m; M) с водой для ПЦР класса
PenStrep (100x)Gibco15140-122может быть заменен любым производителем
Roti®-GelStainCarl Roth3865Краситель на основе флуоресценции для измерения концентрации дцДНК
Spei-hfNEBR3133
T4-DNA LigaseNEBM0202
TransIT LT1MirusMIR2300
Трипсин 0,05% - ЭДТАGibco25300-054может быть заменен любым производителем
ZymoPURE II Plasmid KitZymoD4201может быть заменен любым производителем

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
  2. Korth, J., et al. Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function. Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).
  3. Hirsch, H. H., et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation. Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).
  4. Masutani, K., et al. The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome. American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).
  5. Korth, J., et al. Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region. Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).
  6. Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12. Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).
  7. Sanchez Fructuoso, A. I., et al. Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients. Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).
  8. Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis. Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).
  9. Gosert, R., et al. Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology. Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).
  10. Bethge, T., et al. Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).
  11. Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate. Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).
  12. Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression. American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).
  13. Widera, M., et al. HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia. Medical Microbiology Immunology. , (2017).
  14. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiment. (6), 247(2007).
  15. Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland. Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).
  16. Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals. Virology. 198 (1), 59-70 (1994).
  17. Teutsch, K., et al. Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy. Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).
  18. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).
  19. Korth, J., et al. The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation. Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).
  20. Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens. Virology. 152 (2), 459-465 (1986).
  21. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

BK PolyomavirusNon Coding Control RegionTranscriptional ActivityFlow CytometryDual Fluorescence ReporterHEK293T CellsAntiviral AgentsNCCR RearrangementsEarly Late Gene ExpressionFluorescence Microscopy

Related Articles