Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Маркировка кровеносных сосудов в телемост мозга и гипофиза использованием сердечной перфузии с DiI-фиксативный

7.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59768

⸱

13 июня 2019 г.

 , 
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

В этой статье

Краткое содержание

В статье описывается быстрый протокол для маркировки кровеносных сосудов в телеост рыбы сердечной перфузии DiI разбавленной в фиксаторе, используя medaka (Oryzias latipes) в качестве модели и упором на мозг и гипофиз ткани.

Аннотация

Кровеносные сосуды иннервируют все ткани у позвоночных, позволяя их выживание, обеспечивая необходимые питательные вещества, кислород и гормональные сигналы. Это один из первых органов, чтобы начать функционировать во время развития. Механизмы формирования кровеносных сосудов стали предметом высокого научного и клинического интереса. У взрослых, однако, трудно визуализировать сосуды в большинстве живых животных из-за их локализации глубоко в других тканях. Тем не менее, визуализация кровеносных сосудов остается важным для нескольких исследований, таких как эндокринология и нейробиология. В то время как несколько трансгенных линий были разработаны в зебрафиш, с кровеносными сосудами непосредственно визуализированы через экспрессию флуоресцентных белков, нет таких инструментов существуют для других видов телеост. Использование medaka (Oryzias latipes) в качестве модели, текущий протокол представляет собой быструю и прямую технику для обозначения кровеносных сосудов в мозге и гипофиза, наполнив через сердце с фиксатором, содержащим DiI. Этот протокол позволяет улучшить наше понимание того, как мозг и гипофиз клетки взаимодействуют с сосудами крови в цельной ткани или толстые ломтики ткани.

Введение

Кровеносные сосуды играют важную часть тела позвоночных, поскольку они обеспечивают необходимые питательные вещества, кислород и гормональные сигналы для всех органов. Кроме того, с момента открытия их участия в развитии рака1, они получили большое внимание в клинических исследованиях. Хотя ряд публикаций исследовали механизмы, позволяющие рост кровеносных сосудов и морфогенез, и большое количество генов, важных для их формирования были определены2, многое еще предстоит понять в отношении взаимодействия между клетками или тканями и циркулирующей кровью.

Визуализация сосудов крови в головном мозге и гипофиза имеет важное значение. Нейроны в головном мозге требуют высокой поставки кислорода и глюкозы3, и гипофиза содержит до восьми важных гормонов-производящих типов клеток, которые используют кровоток, чтобы получать сигнал от мозга и отправить свои гормоны в различные периферийные органы4,5. В то время как у млекопитающих, порталная система в основании гипоталамуса имени среднего выдающего, связывает мозг и гипофиз6, такой ясный мост крови не был описан в телеост рыбы. Действительно, в teleosts, преоптико-гипоталамические нейроны непосредственно проект их аксоны в парс нервной гипофиза7 и в основном innervate различных типов эндокринных клеток непосредственно8,9. Тем не менее, некоторые из этих нейронов имеют свои нервные окончания, расположенные во внесосудистом пространстве, в непосредственной близости от капилляров крови10. Таким образом, разница между телеост рыбы и млекопитающих не так ясно, и связь между сосудами крови и мозга и гипофиза клетки требует большего изучения в телеост рыбы.

Зебрафиш имеет, во многих аспектах, анатомически и функционально сопоставимы сосудистой системы с другими видами позвоночных11. Он стал мощной моделью позвоночных для сердечно-сосудистых исследований в основном благодаря развитию нескольких трансгенных линий, где компоненты сосудистой системы помечены флуоресцентными белками репортера12. Тем не менее, точная анатомия системы кровообращения может варьироваться между видами, или даже между двумя лицами, принадлежащими к тому же виду. Таким образом, визуализация кровеносных сосудов может представлять большой интерес и в других видах телеост, для которых трансгенез инструменты не существуют.

Несколько методов были описаны для обозначения кровеносных сосудов у млекопитающих и телеост. К ним относятся на месте гибридизации для сосуд-специфических генов, щелочной фосфатазы окрашивания, микроангиографии, и красителя инъекции (для обзора см.13). Флуоресцентные липофильные катионные инокарбоциановые красители (DiI) был впервые использован для изучения боковых подвижности мембранных липидов, поскольку он сохраняется в липидных двуслойных и может мигрировать через него14,15,16. Действительно, молекула DiI состоит из двух углеводородных цепей и хромофоров. В то время как углеводородные цепи интегрируются в липидную двухслойную клеточную мембрану клеток клеток, соприкасающихся с ним, хромофоры остаются на его поверхности17. Оказавшись в мембране, молекулы DiI рассеиваются боково внутри липидного двухслойного, который помогает запятнать мембранные структуры, которые не находятся в непосредственном контакте с раствором DiI. Инъекция раствора DiI через перфузию сердца, поэтому пометить все эндотелиальные клетки в контакте с соединением, позволяющим прямой маркировки кровеносных сосудов. Сегодня DiI также используется для других целей окрашивания, таких как одномолекулярная визуализация, картирование судьбы и отслеживание нейронов. Интересно, что существует несколько флюорофоров (с различными длинами волн эмиссии), что позволяет сочетание с другими флуоресцентными этикетками, и включение, а также боковое распространение DiI может произойти как в живых, так и в фиксированных тканях18, 19.

Формальдегид, обнаруженный Фердинандом Блюмом в 1893 году, широко используется по сей день в качестве предпочтительного химического вещества для фиксации тканей20,21. Он показывает широкую специфику для большинства клеточных целей и сохраняет клеточную структуру22,23. Он также сохраняет флуоресцентные свойства большинства флуорофоров, и, таким образом, может быть использован для фиксации трансгенных животных, для которых целевые клетки выражают флуоресцентные белки репортера.

В этой рукописи предыдущий протокол, разработанный для обозначения кровеносных сосудов в небольших экспериментальных моделях млекопитающих24, был адаптирован к использованию в рыбе. Вся процедура занимает всего пару часов. Он демонстрирует, как пронизать фиксаторный раствор формальдегида, содержащего DiI в сердце рыбы для того, чтобы непосредственно пометить все кровеносные сосуды в головном мозге и гипофиза модели рыбы medaka. Медака - маленькая пресноводная рыба, произрастая в Азии, в основном в Японии. Это исследовательская модель организма с набором молекулярно-генетических инструментов, доступных25. Таким образом, идентификация кровеносных сосудов у этого вида, а также в других позволит улучшить наше понимание того, как мозг и гипофиз клетки взаимодействуют с сосудами крови в цельной ткани или толстые ломтики ткани.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все обращение с животными осуществлялось в соответствии с рекомендациями по уходу и благополучию научных животных в Норвежском университете наук о жизни и под наблюдением уполномоченных следователей.

1. Подготовка инструментов и решений

  1. Приготовьте растворимый растворение 5 мг кристалла DiI в пластиковой трубке объемом 1,5 мл с 1 мл 96% EtOH. Vortex для 30 с и держать покрыты с использованием алюминиевой фольги.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Раствор запасов DiI можно консервировать в темноте при -20 градусов в течение нескольких месяцев.
  2. Приготовьте держатель рыбы(рисунок 1А), разрезав кусок полистирола до 5 см в длину, шириной 3 см и толщиной 2 см, и приклеив его к пластиковой тарелке диаметром 9 см. Сделайте 3 см лодочного отверстия с скальпелем лезвием в полистирола.
  3. Подготовьте проницательное систему(рисунок 2), добавив пластиковую канюлю длиной 30-50 см в конечности иглы.
  4. Приготовьте 40 мл свежего 4% раствора параформальдегида (PFA), разбавив 10 мл 16% ПФА с 30 мл фосфатного буферного солейного раствора (PBS) в пластиковой трубке 50 мл.
  5. Приготовьте 10 мл из фиксаторного/DiI раствора, разбавив 1 мл бульонного раствора DiI в 9 мл свежеприготовленного 4% PFA в пластиковой трубке объемом 10 мл. Держите в темноте до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Кристаллы DiI, которые не растворяются, могут храниться в трубе сстокового раствора, а новый этанол может быть добавлен для подготовки нового решения для акций DiI (см. шаг 1.1).
  6. Приготовьте 50 мл троса трикаина (МС-222).
    1. Растворите 200 мг порошка трикаина в 48 мл H2O. Добавить 2 мл 1 М Трис базы (pH 9). Отрегулируйте к pH 7 с 1 M HCl и храните на -20 C.
  7. Разбавить 5 мл троса трикаина в 50 мл чистой воды в небольшом стакане.
  8. Приготовьте несколько стеклянных пипеток 5 см(рисунок 2), растягивая стеклянный капилляр с помощью выдвижного пипетки, следуя инструкциям производителя.

2. Рассечение и перфузия

ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ ПФА является токсичным летучим соединением, поэтому вскрытие и перфузия должны выполняться в капюшоне или в проветриваемой комнате, и пользователь должен носить противогаз.

  1. Подготовьте инструменты вскрытия, включая небольшие ножницы, и один острый и один сильный щипцы перед вскрытием.
  2. Заполните шприц подготовленным раствором PFA/DiI, поместив его в трубку 50 мл и сформируя. Затем поместите иглу с канюлей в конечности шприца(рисунок 2).
  3. Закрепите шприц на скамейке, используя несколько кусков ленты, размещенной в разных направлениях, отрегулируйте положение микроскопа и сиденья, чтобы получить хорошее положение для вскрытия и для нажатия шприца поршень (Рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ В этом протоколе локоть используется для нажатия на поршень шприца, но могут быть использованы другие варианты возможностей, например, помощь другого человека.
  4. Эвтанизировать рыбу с передозировкой трикаина, поместив рыбу в раствор, приготовленный в шаге 1.7. Подождите 30 с и проверить рефлексы рыбы, захватив его каудальный плавник с щипками. Рыба может быть использована, когда она перестала реагировать на раздражители.
  5. Поместите рыбу в держатель рыбы с животом вверх и приколоть одну иглу в конечности головы и еще один над хвостом, чтобы держать рыбу на месте.
  6. Откройте передний живот ножницами, горизонтально разрезая поверхностный слой кожи.
  7. Используя щипцы, удалите кожу над сердцем, пока не будет обеспечен четкий доступ к желудочку и артериозу bulbus(рисунок 3).
  8. Добавьте стеклянную пипетку в конечности капилляра и разбейте конец кончика стеклянной пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Отверстие сломанной кончик должен быть достаточно большим, чтобы жидкость, но все еще достаточно мал, чтобы легко войти в ткань. Стеклянный пипетка можно использовать повторно, если не сломана или засорена.
  9. Принесите стеклянную пипетку близко к желудочку и добавить давление в поршень шприца с локтем, чтобы заставить жидкость из.
  10. Прикрепите желудочек сердца стеклянной пипеткой, добавляя давление в шприц.
  11. Непосредственно после, перфорировать синус венос с щипками, чтобы кровь покинуть кровообращение.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Желудочек сердца становится более хрупким из-за фиксатора. Он также становится менее красным, как кровь разбавляется с фиксатором / DiI раствор.
  12. Из желудочка, настроить угол стеклянной пипетки, чтобы найти вход в луковицы артериаза. Принесите пипетку открытия внутри люковича артериоз, как показано на рисунке 2, и добавить больше давления на шприц.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Артериоз луковицы прозрачен и ткань эластична. При замене крови DiI/фиксативным, стеклянный пипетка внутри сердца должен стать более заметным и, добавляя давление, размер артерии луковицы должен расширяться. Этот шаг имеет решающее значение, чтобы убедиться, что достаточное давление было использовано, чтобы заменить всю кровь с фиксаторным / DiI решение, и что все кровеносные сосуды были достигнуты. Часто, когда успешно, PFA провоцирует мышечные сокращения и рыба будет двигаться.
  13. Продолжайте добавлять давление на шприц в течение 30-60 с по-прежнему сохраняя стеклянный пипетка внутри люковичного артериоза.
  14. Снимите стеклянную пипетку и иглы с рыбы.
  15. Вскрыть мозг и гипофиз, и инкубировать ткани в свежих 4% PFA в PBS в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Рассечение мозга и гипофиза ранее было подробно описано двумя различными способами Фонтейн и др.26 и Ager-Wick et al.27. Из-за фиксации, ткань становится довольно трудно и хрупкая связь между мозгом и гипофиза может быть нарушена. После вскрытия, после фиксации обработки также может быть выполнена на ночь при 4 градусах Цельсия.
  16. Промыть ткань дважды в PBS в течение 10 минут, прежде чем готовиться к визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Ткань может быть установлена между слайд и крышка скольжения с прокладки между ними и монтаж ампентом среды для конфокальной визуализации (см. Рисунок 4), или разделены с вибратом, как описано подробно в Фонтейн и др.26 до монтажа между слайд и крышка скольжения для изображения со стереомикроскопом (см. Рисунок 4).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол демонстрирует пошаговую процедуру маркировки кровеносных сосудов в медаке мозга и гипофиза, и в то же время исправить ткани. После маркировки путем сердечной инъекции фиксаторного раствора, содержащего DiI в сердце, кровеносные сосуды могут наблюдаться на ломтиках с помощью флуоресцентного стереомикроскопа(Рисунок 4) или на всей ткани с помощью конфокального микроскопа (рисунок5). Либо на толстой части ткани или на всей ткани, архитектура сосуды кр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сердечная перфузия с DiI ранее была использована для обозначения кровеносных сосудов в нескольких модельных видов24,в том числе телеост рыбы13.

Поскольку DiI непосредственно доставляется в эндотелиальную клеточную мембрану путем перфузии в сосудистой, можно увеличить соотношение сигнала к шуму за счет увеличения концентрации DiI в фиксаторном растворе. Кроме того, фторофор обеспечивает интенсивное окрашивание при возбуждении с минималь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать

Благодарности

Мы благодарим д-ра Синдзи Канду за демонстрацию перфузии сердца с фиксаторным решением в Медаке, г-жу Лурдес Карреон Г Тан за помощь в медаке и г-на Энтони Пелтиера за иллюстрации. Эта работа была профинансирована НМБУ и Научно-исследовательским советом Норвегии, грант омовая программа 248828 (программа Digital Life Norway).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16% параформальдегидЭлектронная микроскопия SciencesRT 15711
5 мл Шприц PP/PE без иглыSigmaZ116866-100EAшприцы
BD Precisionglide иглыSigmaZ118044-100EAиглы 18G (1,20*40)
Боросиликатное стекло 10 см OD 1,2 ммsutter инструментBF120-94-10стеклянная пипетка
DiI (1,1′-Диоктадецил-3,3,3′,3′-тетраметилиндокарбоцианина перхлорат)InvitrogenD-282
ПВД трубка O.D 1,7 мм и ВАХ 1,1 ммPortex800/110/340/100канюля
Фосфатный буферный раствор (PBS)SigmaD8537-6X500ML
Пипетка пуллерNarishigePC-10
Пластиковые чашки ПетриVWR391-0442
Супер клей гельлоктитc4356
Трикаин (мс-222)сигмаE10521-50G

Ссылки

  1. Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. Angiogenesis in cancer. Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).
  2. Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
  3. Magistretti, P. J. Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. Zigmond, M., et al. , Academic Press. 389-413 (1999).
  4. Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
  5. Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. Pituitary cell lines and their endocrine applications. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).
  6. Knigge, K. M., Scott, D. E. Structure and function of the median eminence. American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).
  7. Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).
  8. Knowles, F., Vollrath, L. Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel. Nature. 206 (4989), 1168(1965).
  9. Knowles, F., Vollrath, L. Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).
  10. Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish. Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).
  11. Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
  12. Cha, Y. R., Weinstein, B. M. Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).
  13. Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).
  14. Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).
  15. Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane. Science. 195 (4275), 307-309 (1977).
  16. Johnson, M., Edidin, M. Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization. Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).
  17. Axelrod, D. Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization. Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).
  18. Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures. Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).
  19. Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
  20. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde Fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
  21. Puchtler, H., Meloan, S. N. On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions. Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).
  22. Hoetelmans, R. W. M., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
  23. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  24. Li, Y. W., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
  25. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).
  26. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visual Experiments. (138), 57790(2018).
  27. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visual Experiments. (138), 58159(2018).
  28. Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
  29. Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274(2010).
  30. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).
  31. Fontaine, R., et al. Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish. Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

medaka
Маркировка кровеносных сосудов в телемост мозга и гипофиза использованием сердечной перфузии с DiI-фиксативный
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.