Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ферментативный синтез эпоксидированных метаболитов докосахексаеноа, Эйкозапентаэноии и Арахидоновых кислот

8.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59770

⸱

28 июня 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, Michigan State University

В этой статье

Краткое содержание

Представляем полезный для крупномасштабного ферментативного синтеза и очистки специфических энантиомеров и региоисомеров эпоксидов арахидоновой кислоты (АА), докозагексаеновой кислоты (ДГК) и эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) с использованием бактериального цитохрома Фермент P450 (BM3).

Аннотация

Эпоксидированные метаболиты различных полиненасыщенных жирных кислот (ПУФА), именуемые эпоксидными жирными кислотами, играют широкий спектр ролей в физиологии человека. Эти метаболиты производятся эндогенно цитохромом класса P450 ферментов. Из-за их разнообразных и мощных биологических эффектов, существует значительный интерес к изучению этих метаболитов. Определение уникальной роли этих метаболитов в организме является трудной задачей, так как эпоксидные жирные кислоты сначала должны быть получены в значительных количествах и с высокой чистотой. Получение соединений из природных источников часто является трудоемким, а растворимые эпоксидные гидролазы (sEH) быстро гидролизуются метаболиты. С другой стороны, получение этих метаболитов с помощью химических реакций является очень неэффективным, из-за трудностей получения чистых региоисомеров и энантиомеров, низких урожаев и обширной (и дорогостоящей) очистки. Здесь мы представляем эффективный ферментатическийсинтез 19 (S), 20 ( R)- и 16 (S), 17 (R)-эпоксидокосапентаевские кислоты (EDPs) из ДГК через эпоксидацию с BM3, бактериальный фермент CYP450, изолированный первоначально из Bacillus megaterium (что легко выражается в Escherichia coli). Характеристика и определение чистоты осуществляется с помощью ядерной магнитно-резонансной спектроскопии (ЯМР), высокопроизводительной жидкой хроматографии (HPLC) и масс-спектрометрии (МС). Эта процедура иллюстрирует преимущества ферментативного синтеза эпоксидных метаболитов PUFA, и применима к эпоксидации других жирных кислот, включая арахидоновая кислота (АА) и eicosapentaenoic кислоты (EPA) для производства аналогичных эпоксикозасатрино кислоты (EET) и эпоксикозатетененоии кислоты (EE), соответственно.

Введение

Поскольку интерес к роли, которую полиненасыщенные жирные кислоты (в частности, омега-3 и омега-6 полиненасыщенные жирные кислоты) играют в биологии человека, в последние годы вырос интерес, исследователи обратили внимание на широкий спектр привлекательных преимуществ, которые их метаболиты Выставка. В частности, значительной точкой внимания были метаболиты эпоксидной жирной кислоты, вырабатываемые цитохромом класса P450. Например, многие эпоксидные паоксиды PUFA, в том числе эпоксикозатриноиновые кислоты (EET), эпоксидокозапентаеновые кислоты (EDPs) и эпоксикозатететрееновые кислоты (Экэ), играют важную роль в регуляции артериального давления и воспаления1,2 , 3 , 4 , 5. Интересно, что конкретные энантиомеры и региоисомеры АА и ЭПК эпоксиды, как известно, имеют различное влияние на сосудосуживание6,7. В то время как физиологические эффекты энантиомеры и региоизомы EETs и EE's были задокументированы, мало что известно о влиянии аналогичных эпоксидокосапентаевных кислот (ЭДП), образованных из ДГК. Широкое использование рыбьего жира8, который богат как EPA и ДГК, также вызвал интерес к EDPs9. Преимущества этих добавок, как полагают, отчасти из-за вниз по течению ДГК метаболитов (16,17-EDP и 19,20-EDP является наиболее распространенным), потому что в ививо уровни EDPs координировать очень хорошо с количеством ДГК в диете10, 11.

Изучение механизмов и целей этих эпоксидных жирных кислот метаболомией, химической биологией и другими методами оказалось сложным, отчасти потому, что они существуют как смеси реджио- и стерео-изомеров, и метод получения чистого количества enantiomers и regioisomers не требуется. Обычные средства для химического синтеза этих соединений оказались неэффективными. Использование пероксикислот, таких как мета-хлоропероксибензоиновая кислота для эпоксидации, имеет много недостатков, в частности, отсутствие селективности эпоксидации, что требует дорогостоящей и кропотливой очистки отдельных региоизомеров и энантиомеров. Тотальный синтез метаболитов ДГК и ЭПК возможен, но также страдает от недостатков, которые делают его нецелесообразным для крупномасштабного синтеза, таких как высокие затраты и низкие урожаи12,13. Эффективное общее производство может быть достигнуто с помощью ферментативного синтеза, так как ферментативные реакции режио- и стереоселекционные14. Исследования показывают, что ферментативная эпоксидация АА и EPA (с BM3) является регипоцитивным и энантиоселективным15,16,17,18, но эта процедура не была протестирована с ДГК, или на большом Масштаб. Общая цель нашего метода заключалась в расширении и оптимизации этой хемоэнсиматической эпоксидации, чтобы быстро производить значительное количество чистых эпоксидных жирных кислот в качестве их отдельных энантиомимов. Используя представленный здесь метод, исследователи имеют доступ к простой и экономичнейой стратегии синтеза ЭДП и других эпоксидных метаболитов PUFA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ВНИМАНИЕ: Пожалуйста, проконсультируйтесь со всеми соответствующими листами данных о безопасности материалов (MSDS) перед использованием перечисленных химических веществ.

1. Выражение дикого типа BM3

  1. Привить pBS-BM3 трансfected DH5 "E. coli (щедрое пожертвование от доктора Ф. Энн Уокер) в 5 мл стерильного бульона LB с 0,5 мг ампициллина добавил в 20 мл культуры трубки.
  2. Инкубировать клеточную культуру в шейкере при 37 градусах по Цельсию при 24 ч при 200 об/мин. Добавьте культуру ночного стартера (5 мл) и 100 мг ампициллина в 1 л стерильного бульона LB в колбе Фернбаха или Эрленмейера. Встряхните при 37 градусах по Цельсию при 6 ч при 200 об/мин, затем при 30 градусах по Цельсию при 200 об/мин.
  3. Соберите и центрифуги ячеек культуры на 4 кв к в течение 10 минут на 1000 х г. Откажитесь от супернатанта и храните клеточные гранулы при -78 градусов по Цельсию до очистки ферментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант может быть либо химически стерилизованы путем лечения отбеливателем или стерилизованы с помощью автоклава, а затем вылил в канализацию.

2. Очистка BM3.

  1. Лиза клетки
    1. Оттепели клеточные гранулы на льду и повторно в 40 мл ледяного (4 кВ) буфера растворификации (10 мм Трис, 0,01 мм фенилметилсульфонил фтора (PMSF;), 0,01 мм EDTA; pH 7.8).
      ВНИМАНИЕ: PMSF является токсичным при контакте.
    2. Находясь на льду, снотрадите клетки в течение 1 мин с ультразвуковым гомогенизатором (выходная мощность устанавливает10, долг 100%), а затем 1 мин перерыв на льду для того, чтобы линза клеток. Повторите эту процедуру 6 раз. Центрифуга клетки lysate при 4 кв к в течение 30 мин на 11000 х г, чтобы гранулы клеточного мусора.
  2. Хроматография сродства
    1. Подготовьте сильный столбец обмена анионов (см. ТаблицаМатериалов; диаметр: 2,8 см х 6 см, объем колонны: 37 мл) путем промывания с 5 объемами столбцов (CV) буфера A (10 мм Трис, рН 7,8) при 4 градусах По Цельсию.
    2. Добавьте клеточные лисаты в уравновеш— колонку и промойте колонку 3 CV холодного буфера A. Elute BM3, промыв колонну холодным буфером B (10 мМ Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
    3. Соберите красновато-коричневую элюентную фракцию. Если белок используется не сразу, смешайте его с равным объемом глицерола и заморозьте вспышкой с жидким азотом. Храните замороженный раствор при -78 градусах Цельсия.

3. Эпоксидация ДГК по BM3

  1. Подготовьте реакцию, добавив 0,308 г (0,940 ммоль) ДГК в 18,8 мл диметилсульфоксида (ДМСО) до 2 л буфера реакции (0,12 М фосфат калия, 5 мМ МГКл2, рН 7,4) вместе с 20 Нм размороженного фермента BM3. Концентрация фермента может быть определена методом спектрального анализа угарного газа/дитионита19.
  2. В то время как раствор помешивается, начните реакцию, добавив 1 эквивалент NADPH (никотинамид аденин динуклеотид фосфат уменьшается, соль тетры натрия, 0,808 г, 0,940 ммоль) растворяется в реакционном буфере. Перемешать реакцию в течение 30 минут в то время как восходящей воздухчерез реакционную смесь с воздухом заполненный шар омывается шприц и игла.
  3. Используя спектрофотометр (см. ТаблицуМатериалов), проверьте поглощение реакционной смеси на уровне 340 нм, чтобы определить, исчерпан ли NADPH. Если нет оставшегося абсорбции, указывающей на потребление NADPH, реакция завершена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, реакция завершается через 30 минут.
  4. Утолить реакционную смесь, медленно добавляя 1 м щавелевой кислоты, капли, пока рН раствора не достигнет 4.

4. Извлечение ЭДП

  1. Извлеките закаленный буферный раствор с 2 l диэтил-эфира (ангирута, без перекиси) 3 раза. Соберите слой эфира (6 л) и высушите сульфатом магния (MgSO4).
  2. Фильтр MgSO4 из раствора и концентрат высушенного слоя эфира на роторном испарителе, чтобы получить сырой остаток EDP.
  3. Очистите остатки с помощью флэш-колонки хроматографии (достаточно 40 г картриджа кремнезема). Начните с 10% этилового ацетата (EtOAc) в гексанах и нарастить до 60% EtOAc в гексанах более 22 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Три основных пика получены и собраны, eluting в порядке 1. не отреагированный ДГК; 2. смесь изомеров EDP; и 3. ди эпоксид (нормальные продукты чрезмерного окисления (см. рисунок1)).
  4. Смешайте фракции и сконцентрируйте их на вращающемся испарителе. Из этого примера 0,074 г, (24%) ДГК, 0,151 г (47%) изомеров EDP, и 0.076 г, (22%) ди эпоксида были получены.

5. Эстерификация ЭДП, разделение16 ( S), 17 ( R)- и 19 (S), 20 (R )-EDP, и сапонификация эфиров

ВНИМАНИЕ: Trimethylsilyldiazomethane (TMS-диазоменан) очень токсичен как при контакте, так и при вдыхании. Используйте только в дымовой капот с соответствующим индивидуальным защитным оборудованием.

  1. Разбавить эпоксиды (0,151 г, 0,435 ммоль) в круглодной колбе или небольшой флакон с 2 мл ангидруса метанола (MeOH) и 3 мл ангидры толуола, добавить перемешать-бар, и добавить TMS-диазометана (1,2 молярных эквивалентов, или 0,26 мл раствора 2 м.
  2. Подождите 10 минут и добавьте дополнительные TMS-диазометан (0.050 мл) до тех пор, пока не останется бледно-желтый цвет.
  3. После 30 минут тщательно сконцентрируйте смесь с помощью роторного испарителя и очистите остатки флэш-колонкой хроматографии. Elute с 4% EtOAc в гексанах (с использованием 40 г кремнезема желоколонка или картридж) в течение 22 мин. В этом примере 19,20-EDP метиловый эфир (0,116 г, 74%) и 16,17-EDP метилэфир (0,029 г, 19%), были получены в виде чистых масел (общая урожайность, 93%).
  4. Соберите фракции, содержащие очищенные метилэтикоэмиомеры EDP. 19(S),20 (R)-EDP метил эфир elutes первый, а затем 16 (S), 17 (R)-EDP метиловый эфир.
  5. Если какие-либо смешанные фракции остаются (содержащие оба изомеров; могут быть оценены тонкослойной хроматографией (TLC) в 8:1 гексан/EtOAc и окрашены перманганата калия (KMnO 4)), повторно хроматограф их с той же системой растворителя, как и раньше.
  6. Концентрируйте фракции, содержащие отдельные региоисомеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, личность и чистота могут быть оценены NMR (с помощью CDCl3 в качестве растворителя; см. легенду на рисунке 2).
  7. Для преобразования отдельных региоизомеров метил-этира EDP в их кислотные формы разбавьте эстер EDP в THF:water (примерно 0,7 мл/0,1 ммоль эфира). Добавьте 2 M aqueous LiOH (3 молярных эквивалента) и перемешайте на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полнота реакции может быть оценена TLC, используя 3:1 гексаны / EtOAc, окрашивание с KMnO4; коэффициент удержания продукта составляет 0,3 евро.
  8. Утолить реакцию медленно с formic кислотой, до тех пор пока pH смеси не достигнет 3-4. Добавьте воду и этиловый ацетат (1-2 мл/0.100 ммоль эфира) и разделите слои. Извлеките слой воды с помощью EtOAc (3 х 5 мл), промойте насыщенным раствором рассола (NaCl) и высушите слой EtOAc над ангидровым сульфатом натрия (Na2SO4).
  9. Сконцентрируйте раствор этилового ацетата с помощью роторного испарителя, добавьте гексаны (10 мл) и снова концентрируйтесь. Повторите дважды, чтобы азеотропно удалить остаточные для мической кислоты. Очистите остатки с помощью флэш-колонки хроматографии, eluting с 10-30% EtOAc более 15 мин.
  10. Сосредоточьтесь на желаемых фракциях и высушите в vacuo, чтобы позволить себе очищенную кислоту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе, энантиомерной чистоты могут быть оценены (по хираль HPLC, см. легенды для Рисунок 3 - Рисунок 4 для колонки и условий). Химическую чистоту можно оценить по C18 (ахираль) HPLC (см. Таблица материалов и ссылка 14).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Хроматограмма флэш-колонки (выполненная с использованием автоматизированной системы очистки вспышки, как описано ниже), полученная при очищении сырой смеси от ферментатической эпоксидации показана на рисунке 1. После эстерификации и разделения regioisomers,чистый 16 ( S), 17 (R)-EDP и 19 (S), 20 (R)-EDP метиловые эфиры были получены. Как правило, они присутствуют в приблизительном соотношении 1:4 к1:5, при этом осн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы представляем здесь оперативно простой и экономически эффективный метод подготовки двух наиболее распространенных эпоксидных метаболитов ДГК - 19,20 и 16,17-EDP. Эти эпоксидные жирные кислоты могут быть подготовлены в высоко энантиочисты (как их S,R-изомеры) форме с использованием фермента bm3 дикого типа. Ниже описано несколько критических точек, которые могут быть использованы для устранения неполадок, а также расширение нашего метода подготовки энантиочистых эпоксидных метаболитов АА и ЭПК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.

Благодарности

Эта работа финансируется R00 ES024806 (Национальные институты здравоохранения), DMS-1761320 (Национальный научный фонд) и стартап-фонды из Мичиганского государственного университета. Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Джун Яна (Калифорнийский университет в Дэвисе) и Лалиту Каршаллу (Мичиганский государственный университет) за помощь в оптимизации ферментативной реакции, и д-ра Тони Шилмиллера (МГУ Масс-спектрометрии и метаболомики) для помощи в получении данных HRMS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Бикарбонат аммонияSigma9830NA
АмпициллинGoldBioA30125NA
Безводный сульфат магнияFisher ScientificM65-3NA
Безводный метанолSigma-Aldrich322515NA
Безводный сульфат натрияFisher ScientificS421-500NA
Безводный толуолСигма-Олдрич244511НК
арахидоновая кислота (АА)Ну-Чек ПрепУ-71АВоздухочувствительный. 
Диэтиловый эфирSigma296082NA
DMSO (класс молекулярной биологии)Sigma-AldrichD8418NA
Докозагексаеновая кислота (ДГК)Nu-Chek PrepU-84Aчувствительный к воздуху. 
ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота)Инвитроген15576028НК
эйкозапентаеновая кислота (ЭПК)Ну-Чек Преп  U-99Aчувствительный к воздуху. 
ЭтилацетатSigma 34858NA
Картриджи флэш-колонки 25, 40, 4, 12 г размерыFisher Scientific145170203, 145154064, 5170200В качестве альтернативы можно использовать обычную колоночную хроматографию
Муравьиная кислота (класс ВЭЖХ)J.T. Baker0128-01NA
ГлицеринSigmaG7757NA
ГексаныVWRBDH24575NA
LB БульонSigmaL3022
NA Гидроксид литияSigma-Aldrich442410NA
Хлорид магнияFisher Scientific2444-01NA
Метанол (класс ВЭЖХ)Sigma-Aldrich34860-41-RNA
NADPH Тетранатриевая сольSigma-Aldrich481973чувствительный к воздуху. 
Щавелевая кислотаSigma-Aldrich194131NA
pBS-BM3 трансфицированная DH5α E. coliNANA NA
PMSF (фенилметансульфонилфторид)SigmaP7626Токсична!
МарганцовкаSigma-Aldrich223468для окрашивания TLC.
Фосфат калия двухосновнойSigma795496NA
Фосфат калия одноосновнойSigma795488NA
Q Sepharose Fast Flow смола (GE Healthcare Life sciences)Fisher Scientific17-0515-01Для анионообменной очистки фермента
Sodium Chloride Sigma71376NA
Тетрагидрофуран, безводныйSigma-Aldrich186562NA
ТМС-Диазометан (2,0 М в гексанах)Сигма-Олдрич362832Очень токсичен.
Tris-HClGoldBioT-400NA
Также необходимо:
Автоматическая система очистки вспышки (мы использовали Buchi Reveleris X2) Колонка для
C18 (Zorbax Eclipse XDB-C18)Центрифуга Agilent
с емкостью 10 000 x g
Хиральная колонна для ВЭЖХ (целлюлоза люкс-3), 250 x 4,6 мм, 5 и микро; M, 1000 Å)Phenomenex
поставляет: разделительную воронку объемом 2 л, стаканы и колбы Эрленмейера емкостью 1000-2000 л, флаконы 20 мл, флаконы с ВЭЖХ, небольшие колбы с круглым дном и мешалки.
ВЭЖХ (мы используем аналитический насос Shimadzu Prominence LC-20AT и УФ-видимый детектор SPD-20AShimadzu
Nanodrop 2000 Thermo-Fisher Scientific
NMRNMR: спектрометр Agilent DD2 (500 МГц)
Роторный испарительBuchi
Sonic dismembrator или ультразвуковой гомогенизаторCole-Parmer
ВЭЖХ Buchi Общая химия спектрофотометр

Ссылки

  1. Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
  2. Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
  3. Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
  4. Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
  5. Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211(2016).
  6. Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
  7. Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
  8. Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).
  9. Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
  10. Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
  11. Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
  12. Khan, M. A., Wood, P. L. Method for the synthesis of DHA. , WO2012126088A1 (2012).
  13. Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
  14. Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
  15. Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
  16. Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
  17. Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
  18. Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
  19. Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
  20. Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019).
  21. Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

фермент BM3ЯМР-анализочистка методом ВЭЖХмасс-спектрометрияфлэш-хроматографияэпоксидные жирные кислотыдокозагексаеновая кислотаарахидоновая кислота
Ферментативный синтез эпоксидированных метаболитов докосахексаеноа, Эйкозапентаэноии и Арахидоновых кислот
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.