Белок-белковые взаимодействия (ИПП) имеют основополагающее значение для создания биологических эффектов. Многие из них тесно связаны с болезнью, и все чаще признаются в качестве важных мишеней для действия лекарств1. Для изучения этих белковых взаимодействий существует множество методов, некоторые из которых обсуждаются в этой коллекции или в других статьях JoVE. Каждый метод имеет свои достоинства и ограничения2; тем не менее, не существует единого идеального метода для всех ИПП из-за огромного разнообразия этих взаимодействий, которые происходят в различных субклеточных компартментах с широким диапазоном сродства (от пикомолярного до миллимолярного) и могут быть только преходящими по своей природе.
Анализы киназ in vitro являются косвенным подходом к изучению ИПП, который может быть использован для анализа того, как киназы выполняют свою функциональную роль по переносу фосфатной группы из АТФ в субстрат. Cui et al.3 используют этот метод в сочетании с триптическим расщеплением и масс-спектрометрией для идентификации циклин-зависимых киназ-1-специфичных сайтов фосфорилирования на фрагменте белка центромеры человека F (CENP-F). Для функциональной верификации новых сайтов фосфорилирования авторы используют анализ связывания, сочетающий CENP-F, содержащий фосфомиметическую мутацию, и α кариоферина, рецептор ядерного транспорта, что обеспечивает перекрестную валидацию.
Коиммунопреципитация является широко используемым методом изучения ИПП, при котором антитело используется для захвата определенной мишени вместе с любыми другими белковыми молекулами, которые с ней связаны. Zheng и коллеги4 применяют эту технику для изучения индуцируемых гипоксией факторов (HIFs), которые функционируют как гетеродимеры, состоящие из регулируемой кислородом субъединицы α и конститутивно экспрессируемой β субъединицы, также известной как ARNT3. Интересным замечанием об их протоколе является то, что клетки индуцируются и собираются в условиях гипоксии, а эндогенные белки из ядерных фракций затем коиммунопреципитируются. Как отмечают авторы, одним из ограничений метода является то, что он не может определить, являются ли ИЦП прямыми или косвенными.
Nolan et al.5 представляют протокол измерения количества молекул и их яркости на изображениях флуоресцентной микроскопии «Число и яркость» (N&B), который может быть применен для обнаружения гомоолигомеризации белков. Этот метод может быть использован как in vitro, так и in vivo и применяется для точного количественного определения олигомерного состояния меченых mVenus FKBP12F36V до и после добавления димеризующего препарата. Авторы обсуждают достоинства метода по сравнению с родственными технологиями и подчеркивают важность коррекции обесцвечивания и долгосрочных колебаний интенсивности. Конфокальные микроскопы, оснащенные цифровыми детекторами, упрощают количественное определение, но N&B также возможен с аналоговыми детекторами.
Аффинная очистка мультибелковых комплексов вместе с идентификацией их компонентов является широко используемым методом для понимания функций таких комплексных белков. В протоколе Luzarowski et al.6 этот метод сделан еще на шаг вперед, одновременно характеризуя как PPI, так и белок-метаболитные взаимодействия (PMI) в трансгенных клетках растений Arabidopsis. Меченые нуклеозиддифосфаткиназы очищаются аффинностью с помощью процедуры тандемной аффинной очистки (TAP) с последующим идентификацией захваченных белков и малых молекул с помощью масс-спектрометрии. Уникальность данного протокола заключается в возможности идентификации как гидрофобных, так и гидрофильных лигандов; это протокол экстракции «три в одном», который позволяет изучать как ИПП, так и ИПП, а также применяет аффинную очистку к посадке клеток.
Преимущество анализа близости-лигирования заключается в том, что он используется для обнаружения взаимодействий между эндогенными белками в клетках и тканях. Карчугина иЧернофф 7 используют эту методику, чтобы показать присутствие гетеродимеров киназ MST1 и MST2 в шванновских клетках человека (ГСК) и эмбриональных клетках почек человека (HEK-293). В их статье есть несколько ценных советов о том, как успешно выполнить технику. Требуются соответствующие первичные антитела, выращенные у разных видов против каждого взаимодействующего белка, и, поскольку специфичность и чувствительность антител являются ключевыми, концентрации антител должны быть точно настроены. Авторы сочли предметные стекла со стеклянной камерой удобными для анализа нескольких клеточных линий и комбинаций антител, но отметили, что крайне важно удалить всю силиконовую вставку между лунками, чтобы избежать различий в конфокальном расстоянии во время микроскопии. Кроме того, для проверки результатов используются различные положительные и отрицательные контрольные показатели.
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) — это чувствительный анализ, который может быть использован для получения разрешения на атомном уровне и количественной информации о взаимодействиях белков и взаимодействий белок-лигандов. Винкелаари его коллеги используют эту технику для изучения взаимодействия двух белков (виментина и энвоплакина), обнаруженных в десмосомах, клеточных структурах, участвующих в межклеточной адгезии, которые обычно обнаруживаются в тканях, испытывающих интенсивное механическое напряжение. Авторы используют 15N-меченый домен виментина и получают 2D-спектр с помощью гетеронуклеарной одиночной квантовой корреляции (HSQC). В присутствии домена из энвоплакина наблюдается обширное уширение линии и исчезновение пика, что согласуется с белковым взаимодействием. Авторы также исследуют основу взаимодействия с помощью мутагенеза и микромасштабного термофореза (МСТ) для получения количественной информации.
Малоугловое рентгеновское рассеяние (SAXS) — это метод, который может быть использован для получения информации о размере и конформации макромолекулы в растворе и создания молекулярной оболочки из больших, многодоменных или белковых комплексов с низким разрешением. В протоколе Mrozowich et al.9 метод используется для создания структуры нидогена-1 и ламинина γ-1 с низким разрешением в комплексе. Этот метод может представлять интерес для исследователей, изучающих ИПП в больших белках с несколькими глобулярными доменами, которые слишком велики для ЯМР-спектроскопии и сложны для кристаллизации для рентгеновской кристаллографии.
Было подсчитано, что в человеческом интерактоме насчитывается около 650 000 взаимодействий— этого достаточно, чтобы занять исследователей в этой области в течение некоторого времени. Недавней разработкой, ставшей возможной благодаря достижениям в области микроскопии, масс-спектрометрии и машинного обучения, является пространственная протеомика, которая может дать большое представление об этой областив будущем. Эта коллекция методов ИПП поможет исследователям решить эту важную проблему, избегая при этом потенциальных ловушек.