Method Article

Характеристика на молекулярном уровне с использованием надежных биохимических подходов нового белка киназы

DOI:

10.3791/59820

⸱

June 30th, 2019

 ,  ,  , 
1Centre de Biophysique Moléculaire, CNRS, UPR 4301, University of Orléans and INSERM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы охарактеризовали новый белок киназы, используя надежные биохимические подходы: анализ Western Blot с выделенным специфическим антителом на различных клеточных линиях и тканях, взаимодействие экспериментов по коиммунопреции, активность киназы, обнаруженная вестерном Помарка с использованием фосфо-специфических антител и по маркировке АТФ32P.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обширное секвенирование всего генома выявило множество открытых кадров чтения (ORF), предоставляющих много потенциальных белков. Эти белки могут иметь важную роль для клетки и могут распутать новые клеточные процессы. Среди белков, киназы являются основными субъектами, поскольку они принадлежат к клеточной сигнализации путей и имеют возможность включения или выключения многих процессов, имеющих решающее значение для судьбы клетки, таких как рост клеток, деление, дифференциация, подвижность, и смерть.

В этом исследовании мы сосредоточились на новом потенциальном белке киназы, LIMK2-1. Мы продемонстрировали его существование Western Blot с помощью специфического антитела. Мы оценили его взаимодействие с восходящим регуляющим белком с помощью экспериментов по коиммунопреционированию. Coimmunoprecipitation является очень мощным методом, способным обнаружить взаимодействие между двумя белками цели. Он также может быть использован для обнаружения новых партнеров белка приманки. Белок приманки может быть очищен либо с помощью тега инженерии его последовательности или через антитела специально ориентации его. Эти белковые комплексы могут быть разделены SDS-PAGE (Натрий Dodecyl Сульфат Полиаккриламид гель) и определены с помощью масс-спектрометрии. Иммунопрецицифицированный LIMK2-1 также использовался для проверки своей киназы в пробирке по маркировке АТФ32P. Этот устоявшийся асссможет использовать множество различных субстратов, а мутившие версии приманки могут использоваться для оценки роли конкретных остатков. Эффекты фармакологических агентов также могут быть оценены, поскольку этот метод является высокочувствительным и количественным. Тем не менее, обработка радиоактивности требует особой осторожности. Активность киназы также может быть оценена с помощью специфических антител, нацеленных на фосфо-группу модифицированной аминокислоты. Эти виды антител не являются коммерчески доступными для всех фосфо модифицированных остатков.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На протяжении многих десятилетий, многочисленные сигнальные пути были выяснены и их участие в важнейших клеточных процессов, таких как деление клеток, дифференциация, подвижность, запрограммированная гибель клеток, иммунитет и нейробиологии, было показано. Киназы играют значительную роль в этих сигнальных путей, поскольку они часто тонко регулируют их активацию или инактивацию и являются частью переходных универсальных комплексов, которые реагируют на внешние раздражители1,2,3. Мутация и дисрегуляция киназы часто приводят к заболеваниям у людей, и поэтому они стали одной из наиболее важных целей наркотиков за последние сорок лет4.

В этом контексте важно иметь возможность обнаруживать взаимодействие киназы с их регуляторами или субстратами вниз по течению и выявлять новых партнеров. Очищение аффинита и иммунопрецит очень мощные методы изоляции белковых комплексов5. Белок приманки или киназы могут быть помечены с конкретной последовательности пептида позволяет использовать коммерческие бусы ковалентно в сочетании с антителами ориентации пептида. Этот материал позволяет высокую воспроизводимость в экспериментах6,7,8. Эндогенные белки также могут быть иммунопреципиципированы с помощью антител, нацеленных непосредственно на белок приманки. Антитела могут быть связаны с протеином А или белок G агарозных бусин или просто инкубируются этими бусинами до добавления лизата. Лисис буферы должны быть оптимизированы, чтобы позволить растворить белок, не теряя взаимодействия и избежать деградации белка. Основным недостатком этого подхода является то, что взаимодействие обнаруживается при клеточном лисисе; поэтому, преходящее или слабое взаимодействие, вместе с теми, которые требуют субклеточного контекста могут быть пропущены. Другие методы могут быть использованы для работы непосредственно в клетке, таких как Близость Ligation Assay (PLA)9, в vivo кросс-ссылок сродство очистки (XAP)10, Биолюминесценция Резонансная передача энергии (BRET) или Фюрстер Резонанс энергии Трансфер (FRET)11,12. Кроме того, иммунопрецитифиция не подходит для определения термодинамических констант привязки, для которых требуются физические методы, такие как поверхностный плазмонный резонанс, истермальная калорийность или микромасштабная термофорез 13,14.

Активность киназы может быть оценена с помощью нескольких методов. В этом, мы сосредоточились на фосфо-специфических антител и in vitro No32P » ATP (Аденозин ТриФосфат) маркировки. Фосфо-специфические антитела нацелены на модификацию фосфатов определенного остатка белка. Они могут быть использованы в Западной помарки или ELISA (Фермент-связанных иммуносорбентных асссе) после лизиса клеток, для иммуногистохимии, а также на неповрежденных клеток с использованием цитометрии потока или иммунофлуоресценции. Их недостатки могут включать в себя их отсутствие специфичности, которые могут быть оценены с помощью мутировавшей версии целевого белка, и их не коммерчески доступны для всех белков. Маркировка In vitro No32P' ATP является очень надежным, хорошо зарекомендовавшим себя и высокочувствительным методом15. Можно использовать иммунопромилиациированные или рекомбинантные белки, а также различные субстраты. Воздействие лекарств также может быть оценено, поскольку этот метод является количественным. Его основным недостатком является то, что радиоактивность, связанная с подходом, требует осторожного обращения. Возможны также альтернативные методы, основанные на измерении флуоресцентных или люминесцентных пептидных субстратов и пользующихся измененными флуоресцентными/люминесцентными свойствами при фосфорилировании. Такие методы также позволяют высокую пропускную связь, что требуется, например, при скрининге молекул, которые могут быть потенциальными ингибиторами мишени киназы. Действительно, киназы представляют собой один из крупнейших классов наркотиков целей, проводимых фармацевтическими компаниями16.

В этом исследовании мы сосредоточились на белке LIMK2-1 (LIMK2-1 означает Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). Белок киназы LIMK2 был впервые описан в 1995году 17. Три изоформы LIMK2 производятся с помощью альтернативного сплайсинга: LIMK2a, LIMK2b и LIMK2-1. В настоящее время LIMK2-1 описан только на уровне мРНК в одном исследовании18. В этом мы характеризуем этот потенциальный новый белок киназы на молекулярном уровне, используя надежные биохимические подходы. Во-первых, мы демонстрируем, что LIMK2-1 действительно синтезируется. Как и два своих аналога, LIMK2a и LIMK2b, он взаимодействует с восходящей киназы ROCK (Rho-связанных белка киназы). Мы показываем, что LIMK2-1 имеет активность киназы на Myelin Basic Protein (MBP), но не на кофилине, каноничном субстрате киназы LIM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка клеток для трансфекции

ВНИМАНИЕ: Все шаги клеточной культуры должны выполняться в специальной лаборатории, и клетки манипулируются в микробиологическом кабинете класса 2.

  1. Семенные клетки HEK-293 (Эмбриональная почка человека) в 10 см пластин в 10 мл DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) дополнены 10% сыворотки плода теленка. Культура в течение 3 до 5 дней под 5% CO2, при 37 градусах По Цельсию, пока клетки не достигнут 90% слияния.
  2. Лечить 10 см пластин с коллагеном R для увеличения клеточной сливки к пластиковым пластинам.
    1. Добавьте 5 мл раствора коллагена R, 200 раз раз разбавленного фосфатным соленовым буфером (PBS) в пластине 10 см. Наложите жидкость на всю поверхность пластины.
    2. Инкубировать при комнатной температуре не менее 1 ч в шкафу биобезопасности.
    3. Удалите раствор коллагена и отбросьте его. Добавьте 5 мл PBS, разложите его по всей поверхности пластины, удалите ее и отбросите. Повторите эту стирку один раз.
    4. Добавьте 8 мл DMEM, дополненную 10% сыворотки плода икры. Храните подготовленные пластины в шкафу биобезопасности.
  3. Возьмите пластины HEK-293 со ступени 1.1 в шкафу для биобезопасности. Удалите средство из пластин и выбросить его в специальный мусор отбеливателя. Добавьте 2 мл дополненного DMEM и промойте клетки, чтобы отсоединить их с помощью потока микропайпета 1 мл, заботясь о том, чтобы избежать пены.
  4. Соберите клетки в трубке 15 мл и добавьте 4 мл дополненного DMEM. Гомогенизировать с 10 мл пипетки, путем pipetting вверх и вниз в 3 раза.
  5. Возьмите 2 мл этого клеточного раствора и добавьте их в обработанные коллагеном пластины, содержащие дополнение DMEM от шага 1.2.4.
  6. Расти в течение 24 часов в инкубаторе при 5% CO2 и 37 градусов по Цельсию. Клетки должны быть 50-80% конфих во время трансфекции.

2. Переходные преображания

  1. Удалите средство из пластин, отбросьте его в специальный мусор отбеливателя, и добавить 10 мл свежего дополненного DMEM. Положите обратно пластины в инкубатор при 37 градусах По Цельсию при подготовке трансфекционной смеси.
  2. В трубке 15 мл добавьте 450 л раствора 10 мм Tris-HCl pH 7.5/1 mM EDTA (Tris означает Tris (гидроксиметил) аминометана и EDTA для этиленитритритрилотетраацетической кислоты) раствора и 50 мл раствора 2,5 М. Смешайте инверсией.
  3. Добавьте 10 мкг плазмидной ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты), приготовленной из препарата миди на жидкой культуре бактерий, преобразованных с помощью выделенной плазмиды. Смешайте инверсией.
  4. При плавном возбуждении вихря добавьте 500 л буферизированного соленого 2x концентрата (состав: BES, 10,7 г/л, NaCl, 16,0 г/л, Na2HPO4, 0,27 г/л; BES означает N,N-Bis (2-гидроксиэтил)-2-аминоэтесульфоновая кислота, N,N-Bis (2-гидроксиэтил)taurine) медленно падают за каплей.
  5. Инкубировать не менее 15 мин (до 45 мин) при комнатной температуре в шкафу для биобезопасности. Не вихрь, не смешивайте! Перемещение труб очень осторожно, чтобы не нарушать комплекс образования между ДНК и фосфатом кальция.
  6. Возьмите пластины от шага 2.1 к шкафу безопасности. Добавляйте комплексы ДНК очень осторожно, капля за каплей, на клетки по всей поверхности пластины.
  7. Инкубировать от 24 до 72 часов в инкубаторе при 37 градусах Цельсия. Обычно максимальное выражение белка достигается в течение 48 часов.

3. Лисис

ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте на льду и с холодными буферами для предотвращения деградации белка.

  1. Подготовить лисис буфер: 50 мм Tris-HCl, рН 7.5, 100 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 0,1% Тритон X-100, 50 мМNaF, 10 мкм пирофосфат, 1 мКм Na3,20 мм p-nitrophenyl фосфат, 20 мМ-г-г-г/мЛ. , 1 мкг/мл лейпептина и 1 мМ PmSF (фтор феодосий феолор феолор фенилметилсулфонил). Для каждой трансинфицированной пластины требуется около 4 мл буфера изли.
  2. Удалите пластины с трансинфицированными клетками из инкубатора. Положи их на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого шага можно работать на «нормальной» скамейке.
  3. Удалите средства массовой информации, и выбросить его в специальный мусор отбеливателя.
  4. Вымойте дважды с 3 мл холодного PBS: добавить 3 мл PBS на стороне пластины капля за каплей, чтобы избежать отсоединения транс-инфицированных клеток, распространение по всей поверхности пластины, удалить PBS и отказаться от него; повторить этот шаг еще раз. В конце, тщательно удалить остальную часть PBS, наклонив пластину, чтобы предотвратить разбавление буфера лисиса для следующего шага.
  5. Добавьте 500 л холодного буфера лисиса на трансfected промытые клетки. Распространение его по всей поверхности пластины.
  6. Инкубировать 10 мин на льду. Время от времени (по крайней мере дважды), снова распространение буфера по всей поверхности пластины.
  7. Очистите клетки и соберите их в микроцентрифуге трубки.
  8. Центрифуга в течение 10 мин при 10 000 х г при 4 градусах Цельсия.
  9. Соберите супернатант в новой микроцентрифуговой трубке. Эта фракция соответствует лизату (экстракту целых клеток). Откажитесь от гранул, которые соответствуют мусору клеточной мембраны.
  10. Соберите аликвот этой фракции в новую микроцентрифуговую трубку (около 50 л). Эта фракция соответствует "TOTAL фракции" или "Cell Lysate" или "Whole Cell экстракт", позволяющий анализ ли транс-инфицированных белков выражаются Западной пятно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент образцы могут быть непосредственно использованы для анализа Western Blot. Буфер Laemmli должен быть добавлен в образец, который затем нагревается при 95 градусах по Цельсию в течение 5 мин, центрифугирован при 10 000 х г в течение 5 минут и загружается на соответствующие SDS-PAGE. Образцы также могут храниться при -80 градусов по Цельсию.

4. Иммунопрецистом

  1. Аккуратно resuspend агарозные бусы в сочетании с соответствующими антителами: HA (человеческий грипп гемагглютинин), Флаг, или GFP (Зеленый флуоресцентный белок) путем гладкой инверсии.
  2. Вырежьте конец кончика 200 л от микропипетты, чтобы шарики вошел в кончик. Пипетка бисер вверх и вниз несколько раз, чтобы насытить кончик, чтобы обеспечить правильный объем бисера.
  3. Возьмите 40 л бусин в микроцентрифуговой трубке.
  4. Добавьте 500 кЛ буфера TENET (30 мм Tris-HCl pH 7.5, 120 mM NaCl, 5 мМ EDTA, 1% Triton X-100). Смешайте инверсией. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г при 4 градусах По Цельсию. Удалите тщательно супернатант и отбросьте его. Добавьте 500 зл TENET. Инкубировать не менее 1 часа при 4 градусах Цельсия на вращающемся колесе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот прединкубационный шаг в TENET позволяет уменьшить неспецифические взаимодействия и тем более уменьшить фоновый сигнал.
  5. Вымойте бисер дважды с 500 зл и сбуфером лиза.
    1. Центрифуга 2 мин при 1000 х г при 4 градусах Цельсия.
    2. Удалите тщательно супернатант буфер, и отбросить его.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь, чтобы не аспирировать бусы во время этих шагов стирки.
    3. Добавьте 500 л люсис буфера. Гомогенизировать путем инвертирования трубки.
    4. Повторите шаги 4.5.1- 4.5.3.
  6. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г при 4 градусах Цельсия. Тщательно удалите супернатант буфер, и отбросить его.
  7. Инкубировать бусы с лисатом от шага 3.9 в течение 2 до 4 часов при 4 градусах По Цельсию на вращающемся колесе.
  8. Вымойте иммунопромилитированные бусины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент, иммунопрористого бисера можно мыть пять раз с буфером лисиса, а затем eluted с буфером Laemmli. Элуат может быть использован для анализа Western Blot или хранится при -80 градусах Цельсия. Кроме того, бисер можно мыть дважды с буфером лисиса, а затем три раза с буфером киназы для выполнения маркировки АТФ32P.

5. Анализы коиммунопреционных

  1. Вымойте иммунопрористированные бусы со ступени 4.7 буфером лиза.
    1. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г в охлажденной центрифуге при 4 градусах Цельсия.
    2. Аккуратно удалите супернатант и отбросьте его.
    3. Добавьте 500 л люсис буфера. Гомогенизировать путем инвертирования трубки.
    4. Повторите шаги 5.1.1-5.1.3 4 раза.
  2. Элуцион
    1. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г в охлажденной центрифуге при 4 градусах Цельсия.
    2. Аккуратно удалите супернатант и отбросьте его. Удалите последние капли супернатанта шприцем Гамильтона, чтобы избежать устремления бисера, и отбросьте супернатант.
    3. Добавьте 40 qL 4x буфера Laemmli (200 mM Tris/HCl pH 6.8, 4% SDS, 40% глицерола, 0.5 M-mercaptoethanol, 0.02% bromophenol голубой). Гомогенизировать, аккуратно нажав трубку.
    4. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
    5. Центрифуга в течение 5 мин при температуре 10 000 х г при комнатной температуре.
    6. С шприцем Гамильтона, удалить супернатант и собрать его в новой трубке микроцентрифуга. Эта фракция соответствует "Eluate", который может храниться при -80 градусов по Цельсию, или непосредственно проанализированы Western Blot.

6. Кинасе асссе

  1. Подготовка буфера киназы: 50 мМ HEPES-NaOH pH 7.5 (HEPES означает 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеетанетанесульфоновая кислота), 150 мМ NaCl, 5 мМ МГCl2, 5 мМ MnCl2, 50 мМ NaF, 1 мМ Na3VO4, 20 мм з-глицерофосфат, 1 мкг/мл лейпептина и 1 мМ ПМСФ. Для каждого состояния иммунопреприностии требуется около 2 мл буфера киназы.
  2. Вымойте иммунопрористированные бусы со ступени 4,7 дважды с 500 зл и с буфером лиза.
    1. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г в охлажденной центрифуге при 4 градусах Цельсия.
    2. Аккуратно удалите супернатант и отбросьте его. Добавьте 500 л люсис буфера. Гомогенизация путем инверсии.
    3. Повторите шаги 6.2.1 и 6.2.2.
  3. Вымойте иммунопреципибилные бусы три раза с 500 зл иназовых буфера.
    1. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г в охлажденной центрифуге при 4 градусах Цельсия.
    2. Аккуратно удалите супернатант и отбросьте его. Добавьте 500 кл. буфера киназы. Гомогенизация путем инверсии.
    3. Повторите шаги 6.3.1 и 6.3.2 дважды.
  4. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г в охлажденной центрифуге при 4 градусах Цельсия.
  5. Аккуратно удалите супернатант и отбросьте его. Удалите последние капли супернатанта шприцем Гамильтона, чтобы избежать устремления бисера, и отбросьте супернатант.
  6. Добавьте 40 qL буфера киназы к иммунопреципицированных бусинах. Приостановите бисер, осторожно нажав трубку.
  7. Подготовьте смесь длямаркировки АТФ (окончательный объем составляет 22,5 л, в комплекте с буфером киназы) в безопасной блокировке-трубке.
    1. Добавьте необходимый объем буфера киназы, чтобы достичь конечного объема в 22,5 л.
    2. Вырезать конец 20 л кончик микропайпета. Отрежь иммунопромилитированные бусы со ступени 6.6 трубачом вверх и вниз несколько раз. Соберите 10 юрб из этих шариков в трубку с безопасным замком.
    3. Добавьте АТФ из раствора запаса 10 мкм, чтобы достичь 50 мМ концентрации конечного. В соответствии с количеством обработанных образцов, разбавление запасного раствора АТФ в буфере киназы предлагается, чтобы позволить пипетке от 1 до 2 л, чтобы убедиться, что объем правильный.
    4. Добавьте 2,5 мкг субстрата (кофилин или миелин основной белок, MBP в данном случае исследования).
  8. Добавьте 5 «Ci из» 32P» АТФ (3000 Ci/mmol), чтобы инициировать реакцию. Смешайте трубачи вверх и вниз медленно.
    ВНИМАНИЕ: С этого момента, работа должна быть проделана в месте безопасности, предназначенных для радиоактивных манипуляций с осторожностью, специальная защита и соответствующие средства контроля (радиоактивный щит, счетчик Гейгера, конкретные отходы сбора, личная грудь и значки для обнаружения радиоактивного воздействия, советы по фильтру).
  9. Инкубировать в течение 20 мин при 30 градусах По Цельсию.
  10. Остановите реакцию с помощью 6-й буфер 5x Laemmli.
  11. Нагрейте при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
  12. Центрифуга при температуре 10 000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  13. Нагрузка на SDS-PAGE. Приступай к миграции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы передняя линия свободного АТФа No32P не выходила из геля, чтобы избежать загрязнения цистерны для миграции.
  14. Попятнать гель при комнатной температуре.
    1. Снимите гель со стеклянных пластин.
    2. Продолжить с тремя ванными в воде при комнатной температуре.
    3. Пятно гель на ночь с Coomassie Blue при комнатной температуре.
    4. Destain гель с несколькими ванны мыть с водой при комнатной температуре.
  15. Оберните гель полиэтиленовой пленкой.
  16. Выставляется на одну ночь или более на экранфосора.
  17. Прочитайте экран на фосформагере, чтобы обнаружить помеченные полосы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синтезируется белок LIMK2-1
LIMK2-1 упоминается в банках данных, но пока только одна бумага показала существование его мРНК18. По сравнению с двумя омологами, LIMK2a и LIMK2b, LIMK2-1 имеет дополнительный C-терминальный домен, идентифицированный как ингибизорный домен protein Phosphatase 1 (PP1i). Мы разработали антитела, которые нацелены на пептид этого домена, аминокислоты 671-684(рисунок 1A).
BLAST исследовани...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При этом мы использовали надежные биохимические инструменты, чтобы охарактеризовать на молекулярном уровне новый белок, LIMK2-1, который считается киназой на основе его последовательности и его омологов, LIMK2a и LIMK2b20.

Во-первых, мы продемонстрировали существование LIMK2-1 на уровне белка с помощью анализа Western Blot с конкретным антителом. После этого мы оценили его взаимодействие с восходящей киназы ROCK1, которая, как известно, регулирует LIMK2a и LIMK2b, омоло...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана La Ligue contre le Cancer, l'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen, и La R'Gion Centre Val de Loire. Большое спасибо Орели Коссон и Дебора Касас за данные цитометрии потока, и Кейрон Хикман-Льюис для тщательного проверки рукописи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Антитело против актинаSigma-AldrichA1978для Вестерн Блот
Антитела против c-MycInvitrogenMA1-21316для Вестерн Блот
Антитела против кофилинаКлеточная сигнальная технология3312/5175для Вестерн Блот
Антитела против GFPSanta Cruzsc-9996для Вестерн Блот
Антитела против HARoche Прикладная научная11687423001для Western Blot
Антитела антифосфо-кофилинCell Signaling Technology3313для Western Blot
Антитела Anti-PP1iEurogentecразработаны для этого исследованияWestern Blot
AprotininEuromedexA-162Bдля лизиса буфера
ATPInvitrogenPV3227для γ[ 32P] маркировка
γ[ 32P] ATPPerkin ElmerNEG502Aза γ[ 32P] мечение
BES солевой буферSigma-Aldrich14280для трансфекции
β-глицерофосфатSigma-AldrichG9422для лизиса и киназного
буфераβ-меркаптоэтанолSigma-AldrichM3148для Laemmli
BSASigma-AldrichA3059для блокирующего буфера
Бромфенол BlueSigma-AldrichB0126для Laemmli
CaCl2Sigma-AldrichC3881для трансфекции
ЦентрифугаSigma111-541
Collagen RPan BiotechP06-20166для контроля трансфекции
миРНКAmbionAM4611для специфичности
антител PP1iCoomassie PageBlue Раствор для окрашивания белкаThermo-Fisher24620для окрашивания гелем
EDTASigma-Aldrich3690для лизиса буфер
Электрофорез BioradMini-Proteanдля вестерн-блота
EZview Красный гель анти-HA аффинностиSigma-AldrichE6779для иммунопреципитации
GeneSys программное обеспечениеOzymeдля приобретения вестерн-блоттинга
Программное обеспечение GeneTollsOzymeдля количественного определения вестерн-блоттинга
GFP-ловушкишарики Chromtekдля иммунопреципитации
GlycineEuromedex26-128-6405для переносного буфера
GST-кофилинUpstate Cell signaling12-556для γ[ 32P] мечение
шприцем Hamilton 100 млHamilton710для тщательного удаления надосадочной жидкости из шариков без их аспирации
HEPESSigma-AldrichH3375для киназного буфера
ImageQuant TL программное обеспечениеGE Healthcareдля регистрации и количественного определения радиоактивности
LIMK2 siRNAAmbions8191для PP1i специфичность антител
LeupeptinSigma-AldrichSP-04-2217для лизиса и киназного буфера
MBPUpstate Cell signaling13-173для γ[ 32P] мечение
MgCl2Sigma-AldrichM8266для киназного буфера
MnCl2Sigma-Aldrich244589для киназного буфера
NaClEuromedex1112для лизиса и киназного буфера
NaFSigma-AldrichS-1504для лизиса и киназного буфера
Okaidic кислотаEuromedex0-2220для лизиса буфер
PMSFSigma-Aldrich78830для лизиса и киназного буфера
-нитрофенилфосфатEuromedex1026для лизиса буфер
PVDF мембрана Immobillon-PMerck-MilliporeIPVH00010 размер пор 0,45 ммдля вестерн Блот
Вращающееся колесоLabincoдля инкубации шариков
Безопасный замок eppendorfEppendorf0030120.086для анализа киназы
SDSSigma-Aldrich5030для Laemmli и буфер для миграции
Ортованадат натрияLCLaboratories S8507для лизиса и буфера киназы
пирофосфат натрияFluka71501для буфера для лизиса
Super Signal West DuraProtein Biology34075для Western Blot
Syngene PxiOzymeтканей Western Blot


 		Биоцепь

 		P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Печень
P1234188 Поджелудочная железа
P1234260 Тестис		для анализа вестерн

 
Передаточный узелBioradMini-Trans-Blotдля вестерн-блоттинга
Tris Euromedex26-128-3094 Bдля буфера лизиса
Tween-20Sigma-AldrichP7949для блокировки буфера
Typhoon FLA9500GE Healthcareдля чтения авторадиографии
Typhoon TrioAmersham Bioscienceдля чтения авторадиографии
Ватман из ватманаGE Healthcare3030-672для Вестерн Блот
для для экстрактов

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
  2. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. 298, Science. New York, N.Y. 1912-1934 (2002).
  3. Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
  4. Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48(2018).
  5. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
  6. Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
  7. Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
  8. Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
  9. Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
  10. Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, Clifton, N.J. 401-410 (2018).
  11. Raykova, D., et al. Let There Be Light! Proteomes. 4, (2016).
  12. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  13. Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
  14. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648(2014).
  15. Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
  16. Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
  17. Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
  18. Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
  19. Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
  20. Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
  21. Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kinase ProteinImmunoprecipitationWestern BlotCo immunoprecipitationKinase Activity AssaySDS PAGEGamma P32 ATP LabelingLIMK2 1ROCK InteractionCell Culture

Related Articles