Изучение митотической и меиотической разложения дрожжей ядерной динамики флуоресценции Live-клеток Микроскопии

Микроскопия живых клеток позволяет исследователям исследовать ядерную динамику, не убивая деление дрожжевых клеток и устраняет необходимость в смертельных фиксаторах и пятнах. Можно наблюдать стабильность, движение, локализацию и время флуоресцентно помеченных белков, которые участвуют в важных событиях, таких как репликация хромосомы, рекомбинация и сегрегация, в дополнение к мембране и цитоскелету Движения. Поддерживая жизнеспособность клеток и нетоксичный сигнал обнаружения, есть минимальное физиологическое вторжение. При правильном выполнении этот метод микроскопии может уменьшить смешанные эффекты, возникающие в результате расширенной технической обработки или от ложной химической реактивности. Кроме того, в ходе эксперимента, исследователи могут сделать соответствующие наблюдения деления дрожжей питания и стрессовых состояний, пролиферативной эффективности и апоптотический статус, которые указывают на неуместные параметры изображения или ненормальной физиологии клеток^{1 ,2,3}.

Митоз и мейоз характеризуются ядерным и клеточным делением. При мейозе, в отличие от митоза, генетическое содержание вдвое, как родительские клетки приводят к дочерним клеткам⁴. Поскольку живая клеточная визуализация обеспечивает временное измерение в дополнение к пространственным отношениям, большое количество клеток может быть исследовано в режиме реального времени. Микроскопия живых клеток позволила исследователям изучить динамику ядерного деления с помощью флуоресцентных меток для гистонов⁵, сплоченных субъединиц⁶, микротрубочки⁷, центромеры⁸, кинетохоры⁹, компоненты вращанищее тело полюса (SPB)¹⁰, и те из хромосомного пассажирского комплекса (CPC)¹¹. Вне аппарата сегрегации хромосом, живая контора изображения также захватили поведение белков, необходимых, но не непосредственно участвует в сегрегации хромосомы. Функция этих белков было показано, влияют на репликацию, хромосома рекомбинации, ядерное движение, и хромосома привязанности к микротрубочки^12,13,14. Эти наблюдения способствовали лучшему пониманию клеточных явлений, функциональные компоненты которых не поддаются биохимической или генетической экспертизе. С новыми достижениями в области технологии микроскопии, ограничения, такие как плохое разрешение, фотоотража, фототоксичность, и стабильность фокуса уменьшится, тем самым способствуя улучшению в режиме реального времени наблюдения митотической и мейотической ядерной динамики^{1, 2,3}. Meiosis является особенно сложной задачей, поскольку это терминальный путь дифференциации, который требует пристального внимания к времени.

Цель юга в этом протоколе состоит в том, чтобы представить относительно простой метод изучения в реальном времени динамики ядерного деления дрожжей при митозах и мейозе. Для этого необходимо использовать клетки, которые не подвергались воздействию экологического стресса, подготовить агарозные прокладки, которые могут выдержать длительную визуализацию, и смонтировать клетки в плотности, которые облегчают визуализацию одноклеточной динамики. Кроме того, в этом протоколе используются клетки, несущие флуоресцентно помеченные белки, которые служат полезными маркерами для ядерной кинетики (Hht1-mRFP или Hht1-GFP), хромосомной сегрегации (Sad1-DsRed), динамики цитоскелетов (Atb2-mRFP), транскрипционной активации в G1/S (Tos4-GFP) и стабильности сплоченности в мейозе (Rec8-GFP). Этот метод также вводит дополнительные ядерные и цитозолические маркеры(таблица I), которые могут быть использованы в различных комбинациях для решения вопросов о конкретных клеточных процессов. Кроме того, основные инструменты Фиджи представлены, чтобы помочь исследователям обрабатывать изображения живых клеток и анализировать различные типы данных. Сила этого подхода проистекает из использования в режиме реального времени наблюдений белковой динамики, времени и стабильности для описания процессов, которые являются неотъемлемой частью для правильного исполнения митоза и мейоза.

1. Медиа Подготовка^15,16

1. Фондовые решения
   1. Приготовьте 50-x раствор соленого бульона, добавив 52,5 г MgCl₂6H₂0, 0,735 г CaCl₂Х2Х₂0, 50 г KCl и 2 г Na₂S0₄ в бутылке, содержащей 1 л дистиллированной воды. Тщательно смешайте раствор и стерилизуйте с помощью фильтрации. Место при 4 градусах по Цельсию для длительного хранения.
   2. Сделать 1000x витаминный бульон решение путем смешивания 1 г пантотеновой кислоты, 10 г никотиновой кислоты, 10 г инозитол, и 10 мг биотина в бутылке, содержащей 1 л дистиллированной воды. Хорошо перемешать раствор и стерилизовать с помощью фильтрации. Хранить при 4 градусах по Цельсию для длительного хранения.
   3. Приготовьте раствор минерального бульона в 10 000 раз, добавив 5 г борной кислоты, 4 г МнСО_4,4 г nSO₄No7H₂O, 2 г FeCl₂No6H₂O, 1 г КИ, 0,4 г молибдовой кислоты, 0,4 г Кусо₄ , и 10 г лимонной кислоты в бутылке, содержащей 1 л дистиллированной воды. Тщательно смешайте раствор и стерилизуйте с помощью фильтрации. Место при 4 градусах по Цельсию для длительного хранения.
   4. Сделайте индивидуальные решения по запасу питательных веществ, добавив 7,5 г аденина, лейцина, гистидина или лизина в бутылку, содержащую 1 л дистиллированной воды. Используйте только 3,75 г, чтобы сделать uracil раствор. Стерилизовать решения с помощью автоклавирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Со временем, uracil осаждает из раствора. Чтобы принести в раствор снова, тепло в микроволновой печи на 60% мощности в 10 с шагом или место в 55 градусов по Цельсию водяной бане в течение 20 минут. Закрутите теплый раствор, пока все сгустки uracil исчезают.
2. Дрожжевой экстракт плюс добавки (ДА)
   1. В колбу 2 л добавьте 1 л дистиллированной воды, 5 г дрожжевой экстрактной базы, 30 г глюкозы и 225 мг каждого из аденина, урацила, L-гистидина, L-леуцина и L-лизина. Добавьте 20 г агара, чтобы сделать твердую среду.
   2. Используйте магнитную панель перемешать, чтобы полностью растворить ингредиенты в раствор. Агар растает после того, как среда стерилизовать с помощью автоклавирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для удобства, готовый к использованию порошок YES также коммерчески доступен.
3. Эдинбург минимальная среда (EMM) и pombe глутамата среды (PMG)
   1. В 2 l колбу, объединить 1 л дистиллированной воды с 3 г калия водорода фталата, 2,2 г Na₂HPO₄, 5 г NH₄Cl, 20 г глюкозы, 20 мл раствора соленого бульона, 1 мл раствора витаминного бульона , и 0,1 мл раствора минерального бульона. Замените NH₄Cl 2,2 г соли мононатрия L-глутаминовой кислоты для приготовления PMG. Чтобы сделать твердую среду, добавьте 20 г агара.
   2. Используя магнитную панель перемешать, растворить ингредиенты тщательно. Агар растает после того, как среда стерилизовать с помощью автоклавирования. Перед использованием, добавить питательные бульонные растворы по мере необходимости. На каждые 1 л среды, добавить 15 мл каждого из аденина, лейцина, гистидина и лизин. Используйте 30 мл для uracil, так как он менее концентрирован, чем другие питательные растворы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для удобства готовые к использованию порошки EMM и PMG также доступны на коммерческой основе.
4. Солодовой экстракт (ME)
   1. Используйте 2 l колбу, чтобы смешать 1 л дистиллированной воды с 30 г экстракта солода и 225 мг каждого из аденина, uracil, гистидин, и лейцин. Отрегулируйте рН до 5,5. Включите 20 г агара, чтобы сделать твердую среду.
   2. Растворите компоненты в раствор с помощью магнитной панели перемешивания. Агар растает после того, как среда стерилизовать с помощью автоклавирования.
5. Спороизоляционный агар с добавками (SPAS)
   1. В колбу объемом 2 л добавьте 1 л дистиллированной воды, 10 г глюкозы, 1 г КХ₂PO₄, 1 мл витаминного бульона, 45 мг каждого из аденина, урацила, гистидина, лейцина и гидрохлорида лизин. Добавьте 20 г агара, чтобы сделать твердую среду.
   2. Используйте магнитную панель перемешать, чтобы тщательно объединить ингредиенты. Агар растает после того, как среда стерилизовать с помощью автоклавирования.

2. Расщепление Дрожжи Культура^15,16

1. Используйте ДА твердой среде, чтобы проснуться расщепления штаммов дрожжей от криогенной сохранения. В зависимости от температурных требований каждого штамма, инкубировать при температуре либо 25 градусов по Цельсию или 32 градусов по Цельсию в течение 3-5 дней.
2. Когда колонии видны, подготовить стартер жидкой культуры. Выберите клетки из отдельных колоний и привить их в пробирки, содержащие 3 мл ДА жидкой среде. Расти при соответствующей температуре до середины или позднего входа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для правильной аэрации используйте трубки или фляги с объемами, по крайней мере, в 5 раз больше, чем предполагаемый объем жидкой культуры. Скорость встряхивания между 150-220 об/мин обычно для рутинного роста культуры.
3. Распределите 250-500 л стартовой культуры в колбу 50 мл, содержащую 9,5-9,75 мл либо ДА, EMM или PMG плюс соответствующие добавки. Разрешить клеткам расти до нужной плотности и проверить под микроскопом для надлежащей морфологии клеток и питания государства.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для хранения пробужденные штаммы в течение месяца, печать ДА пластины с парафина лентой и место на 4 градуса По Цельсию.

3. Подготовка образца²

1. Установка слайда микроскопа
   1. Добавьте 2 г агарозы в стакан 500 мл, содержащий 100 мл либо минимальных средних плюс добавок (митоза) или жидких SPAS (мейоз). Разогрейте раствор агарозы в микроволновой печи при 60% мощности с шагом в 10 с или поместите в водяную ванну 55 градусов по Цельсию в течение 10 мин. Закрутите раствор для обеспечения эффективного плавления. Подготовка агарозы слайд решений установки (Рисунок 1A), чтобы обеспечить быструю подготовку колодки и предотвратить расплавленной агарозы от затвердевания преждевременно.
   2. Разрешить расплавленной агарозы остыть в течение 1 мин при комнатной температуре и обойтись 50-100 л пятна на слайдах микроскопа с использованием широкой пипетки советы. Перед тем, как агароза остынет, поместите микроскоп слайд на вершине для создания спред площадку около 1,5-2 см в диаметре(рисунок 1B-C). Ширина агарозной площадки, как правило, пропорциональна продолжительности времени изображения. Другими словами, более толстые колодки выдерживают более длительные периоды визуализации.
   3. Используйте углеводородную смесь в качестве герметика для обеспечения надлежащего покрытия слайдов с толстыми агарозными прокладками и для предотвращения гибели клеток от воздействия растворителя на краях крышки. Смешайте равные части (w/w) вазеле, ланолина и парафина в стакане 500 мл. Нагрейте ингредиенты на горячей тарелке при температуре 120 градусов по Цельсию в течение 5 мин. По мере того как компоненты расплавяют, тщательно закружите расплавленный раствор для того чтобы обеспечить соотвествующее смешивание.
2. Установка образца
   1. Для изучения митотических событий, растут клетки из стартовых культур в жидком EMM или PMG плюс добавки примерно до середины журнала фазы (OD₅₉₅ из 0,4). Центрифуга 1 мл клеточной подвески на 1375 х г в течение 1 мин, удалить супернатант и resuspend клеточной гранулы в минимальной среде плюс добавки до окончательного объема 100 зл.
   2. Для изображения мейотических событий, растут клетки от стартовых культур в минимальной среде плюс добавки к позднему журналу фазы (OD₅₉₅ 0,7-1.0). Объедините равные объемы противоположных клеток типа мата (h^- и h) в 1 мл суспензии ячейки. Клетки центрифуги на 1375 х г в течение 1 мин и повторно йетва в жидком ME. Повторите этот шаг трижды, чтобы обеспечить эффективное удаление питательных веществ.
   3. После последней стирки ME, resuspend клетки в 1 мл ME и добавить его в 50 мл колбу, содержащую 9 мл ME. Инкубировать 12-16 ч при 22-25 градусах По Цельсию при минимальной скорости вращения (50-100 об/мин). Обильные флочкуляции клеток, что приводит к многим круглым деления дрожжей сгустки и указывает на эффективное спаривание.
   4. Возьмите 1 мл образца брачной культуры и центрифуги при 1375 х г в течение 1 мин. Устраните супернатант, но оставьте 250 л в трубке, чтобы повторно приостановить клетки. Перед размещением клеток на агарозных прокладки, вихрь энергично в течение 5 с, чтобы нарушить сгустки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные 250 Л ME, используемые для повторной приостановки клеток, содержат факторы спаривания, которые помогают клеткам входить в мейоз.
   5. Поместите 20 зл либо митотической или мейотической подвески клеток на 2% агарозной прокладке. Удалите излишки среды, инвертируя слайд и положить его на верхней части без ворса бумажное полотенце для 2-3 с(рисунок 1D). Установите слайд колодки вверх и аккуратно поместите стеклянный coverslip, обеспечивая не генерировать пузырьки воздуха(рисунок 1F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Устранение избыточной среды с помощью бумажного полотенца является более эффективным по времени, чем поглощение гравитации, что особенно важно в экспериментах мейоза.
   6. Чтобы создать монослой ячейки, поверните крышку по часовой стрелке указательным пальцем для одного (митоза) или двух (мейоз) полных поворотов(рисунок 1F). Убедитесь, что клеточная материя рассеивается по агарозной площадке, что позволяет лучше едать одиночные клетки или аски. С помощью небольшой деревянной палкой, обойтись расплавленного герметика по краям coverslip для уплотнения каждой агарозной площадки (Рисунок 1G).
   7. После того, как агароза площадку запечатана, поместите его на стадии микроскопа и дайте ему уравновесить в течение 10-15 минут в соответствующих условиях изображения (например, температура) (Рисунок 1H), чтобы пузырьки воздуха рассеиваться и пусть любой в последнюю минуту агароуз сдвиги происходят. Начните визуализацию после того, как слайд эффективно уравновесится, и не удаляйте его со сцены до окончания сбора данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль температуры и влажности определяется используемой системой микроскопов и специфическими экспериментальными требованиями. При наличии, применять температуру и влажность контроля для всех изображений экспериментов. При отсутствии исследователи должны разработать способ предотвращения колебаний температуры, особенно во время экспериментов по мейозу.

4. Изображения в реальном маштабе времени² и обработка

1. Используйте цель 40x, чтобы найти соответствующие поля зрения на изображение. Переход к цели 60x, чтобы начать сбор данных. В зависимости от используемой системы микроскопа, последующая переориентация и секция на образец в каждый момент времени будет происходить вручную или через микроскоп- или программно-автоматизированный процесс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения, представленные в этом протоколе, были собраны с помощью деконволюционного, флуоресцентного микроскопа, оснащенного фильтрами Sedat, RFP и GFP, нано-движения, объектива 60x NA 1.4 и 12-битной камеры CCD. Встроенные механические ставни и моторизованные фильтровые колеса позволяют снижать эксцитную экспозицию и фотоотбелевание образцов.
2. Используйте соответствующее программное обеспечение для получения и обработки изображений. Для деконволвных изображений нанисяте функции оптической передачи, предоставленные производителем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об оборудовании и программном обеспечении микроскопа, используемом в данном протоколе, обратитесь к таблице материалов.
3. Использование обычного флуоресцентного микроскопа для получения изображений в живых клетках гарантирует, что микроскоп собирает данные в цифровом формате, имеет 40x или 60x цели с числовыми диафрагмами (NA) больше 1,2, и способен выполнять оптическое сечение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Без этих требований изображения будут показывать уменьшенное разрешение, ставя под угрозу качество микроскопических измерений и качественных наблюдений.
4. Используйте бесплатные плагинные программы (например, Фиджи), чтобы свести к минимуму систематические ошибки размытия, возникающие в результате потери контрастности во время приобретения изображения^17,18,19,20 и для обеспечения надлежащего количественного анализа интенсивности флуоресценции и других временных и динамических событий в клетке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие доступные коммерческие программы деконволюации можно найти в таблице материалов.
5. Выберите наборы фильтров микроскопа, которые лучше всего соответствуют флюорофорам под наблюдением. Убедитесь, что возбуждающие и эмиссионные фильтры имеют правильные проходы полосы, которые позволяют специфическое обнаружение флуоресцентных белков. Например, для обнаружения сигнала CFP, пропуск диапазона возбуждения и выбросов 430/25 и 470/30 является целесообразным, но не для флуоресценции RFP.
6. Используйте подход с минимальными эффективными настройками (MESA) при расщеплении изображений дрожжей в нескольких временных точках. Другими словами, избегайте длительного использования волн возбуждения и используйте самую низкую силу возбуждения и время экспозиции, которые генерируют приемлемые, но поддающиеся количественной оценке и воспроизводимые данные изображений.
7. Для длительного изображения во время митоза или мейоза, ограничить интервал между моментами времени приобретения до 5-10 мин. Хотя 2% агарозных колодок может выдержать от 12 до 16 г сеансов визуализации, изменение клеток из-за испарения агарозы, вероятно. Поэтому, выполнять полный митоз или мейоз эксперименты в 4-6 ч или 8-10 h окна, соответственно.
8. Собирайте данные визуализации для 4-8 ч, состоящий по крайней мере из 24-48 точек времени приобретения, соответственно, одного белка флуоресценции, и z-стек на точку времени и флуоресцентный канал, состоящий из 13 секций с интервалом 0,5 мкм с использованием 60x цели. Это требует не менее 0,5-1 ГБ места для хранения жестких дисков. Таким образом, помимо устранения фотоотбелевания и смещенияклеток, создайте рабочий процесс, который учитывает вычислительные возможности 1,^2,3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры приобретения обычно устанавливаются и модифицируются в программном обеспечении, которое управляет функциями микроскопа и которое собирает и обрабатывает изображения.
9. Для более детального изучения конкретных ядерных процессов выполняйте приобретение изображений каждые 5-10 с, если выбросы не уменьшаются существенно после частого воздействия. Провести предварительный анализ интенсивности флуоресценции в течение различных периодов времени, чтобы определить точку, после которой точность собранных данных больше не является надежной^1,3.
10. В программном обеспечении для приобретения изображений и обработки изображений используйте максимальную интенсивность проекции на изображения z-стекидля наблюдения за всеми структурами с высокой плотностью флуоресценции на 2D плоскости независимо от их вертикального расположения 1,^{2, 3}. Это облегчает быстрое изучение ядерных процессов, происходящих в различных вокселе. Соберите изображение среднего фокусного яркого поля для создания эталонной картины поднаблюдениеживаемых ячеек.

5. ImageAnalysis^20,21

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ изображений в этом протоколе выполняется с использованием Фиджи. Для других программ анализа и Фиджи плагины см Таблица материалов.

1. Загрузите изображение deconvolved, выбрав функцию Bio-Formats Importer в меню Plugins. В всплывающем окне опций импорта выберите режим Hyperstack, цветпот по умолчаниюи проверьте Autoscale перед нажатием кнопки OK.
2. Убедитесь, что отображаемый окон имеет правильное количество каналов флуоресценции и временные рамки, прокручивая боком на соответствующих барах внизу. Сохранить как файл Tiff, который не сжимает данные и предотвращает потерю информации.
3. Откройте изображение, содержащее панель масштаба, генерируемую при обработке данных программным обеспечением микроскопа. Определите длину пикселей панели шкалы с помощью инструмента "Прямая линия" для нарисования параллельной линии аналогичного размера и выберите Measure из меню Analyse. Добавьте панель масштаба, установив соотношение пикселей к метре, выбрав шкалу набора из меню «Анализ».
   1. В всплывающем окне шкалы набора введите расчетное расстояние в пикселях и Известное расстояние в мкм,установите соотношение аспекта Pixel до 1,0, поместите микрон в качестве единицы длиныи проверьте глобальное поле перед нажатием OK кнопку.
4. Используйте опцию Set Measurements в меню «Анализ», чтобы выбрать различные параметры для количественной оценки при выборе измерения. Для целей этого протокола выберите следующие метрики: Площадь, Периметр, Среднеесерое значение, медиана, Мин и макс серое значение, Интегрированная плотность, позиция стека, и дисплей этикетка.
5. В зависимости от точности собранных данных, введите более 1 для десятичных мест вариант и проверить научное поле нотации, если это необходимо. После применения команды Измерения всплывающее окно результатов будет отображать значения для каждого соответствующего параметра. Сохранить результаты в виде файла .csv для будущего анализа в программе статистики.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не обязательно разделять изображение на его составные флуоресцентные каналы для определения длины, если нет сигнальных помех между различными цветами, и в этом случае следовать шагу, описанному ниже.
6. В случае вмешательства сигнала выберите инструмент Color and Channels из меню изображения и проанализируйте каждый цвет отдельно. Чтобы измерить длину нелинейных структур, нажмите правой кнопкой мыши на инструменте Line и используйте вариант сегментированной линии или линии Freehand для отслеживания нужных объектов.
   1. Для линейных структур или для определения расстояния между двумя точками используйте функцию «Прямая линия» и выберите measure из меню «Анализ». Значения длины в мкм будут автоматически добавлены к параметрам, ранее выбранным в рамках опции Set Measurements.
7. Для измерения изменений в размере сигнала и интенсивности флуоресценции сначала создайте область интереса(ROI) библиотеки, которая повышает точность количественной оценки и облегчает быстрые измерения по всему стеку изображения. Выберите инструмент цвета и каналов под меню изображения.
8. В всплывающем окне каналов проверьте цветовой канал, для которого будет измерена интенсивность или область. Выберите функции «Настройка и порог» в меню «Изображение». Проверьте темную фоновую коробку, выберите метод по умолчанию (если иное не требуется собранными данными) и выберите Red для наложения сигналов интереса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение стабильности белка, движения и локализации тесно зависит от цветового порога, используемого для создания библиотек рентабельности инвестиций. Важно выбрать правильный метод порогового значения для типа флуоресцентного сигнала маркера, который будет визуализирован^17,18.
9. Используйте инструмент Wand, чтобы выделить каждую интересуемую структуру и нажать букву T на клавиатуре, чтобы добавить выбранную рентабельность инвестиций в всплывающее окно менеджера roI. Повторите этот процесс для каждого среза (тайм-фрейм) в стеке изображения и храните все ROIs, нажав на кнопку More и выбрав Сохранить.
10. Откройте папку для загрузки ROI-менеджера на молнии и нажмите на каждый идентификатор ROI на левой боковой панели. Выберите измерение из меню «Анализ» и повторите эту команду в каждом идентификаторе ROI для количественной оценки объектов, представляющих интерес, во всех срезах стека изображений.
11. Если смещение ячейки не является проблемой и фокусная плоскость остается неизменной для всех срезов стека, нажмите на Multi measure в менеджере рентабельностиинвестиций. В всплывающем окне выберите измерять все срезы вместо одного ряда на срез для измерения итератов в стекле изображения. Сохранить результаты в виде файла csv и проанализировать измерения в программе статистики.
12. Для нескольких ядерных сигналов, включающих структуру интереса, нажмите клавишу Shift при выборе объектов с помощью инструмента Wand для создания единой рентабельности инвестиций. Кроме того, создать рентабельность инвестиций постоянного размера с овальным инструментом, чтобы охватить все сигналы интереса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот овальный подход может быть необходим для измерения и описания поведения сигнала в области, где поток флуоресценции изменяется в размерах и интенсивности с течением времени. Интенсивность сигнала, в данном случае, является средней плотностью сигнала над заданной областью.
13. Качественно определить локализацию двух флуоресцентных сигналов путем изменения цвета области перекрытия сигнала. Однако по мере сужения зоны локализации различить перекрытие сигналов труднее. В этом случае выполните последующие шаги, описанные ниже.
14. Используя инструмент каналов, описанный в шаге 5.6, нарисуйте прямую линию по каждому указанному сигналу и выберите команду профиля участка в меню «Анализ».
    1. Повторите этот шаг для всех цветов, о котором идет речь, используя одну и ту же нарисованную линию.
    2. В всплывающем окне образца, которое появляется после каждого шага профилирования, нажмите кнопку «Список», чтобы вызвать окно Значения участка и сохраните измерения для каждого сигнала в виде файла csv.
    3. В программе статистики создайте график, который графикирует значение серого цвета для каждого сигнала на основе его соответствующего расположения (в мкм) вдоль нарисованной линии. Отсутствие дублирования между участками профиля сигнала, как правило, указывает на отсутствие совместной локализации.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте инструмент Plot Profile на прогнозируемых изображениях для изучения совместной локализации сигнала. Это надежно только в том случае, если такое перекрытие также наблюдается через изображение z-стека.
15. Для мониторинга динамического поведения флуоресцентных белков с течением времени используйте инструмент Multi Kymograph, найденный в меню Analyse. Полученное изображение показывает движение флуоресцентного сигнала через серию сжатых снимков в каждом срезе z-стека, который представляет отдельные временные точки.
    1. Используйте инструмент каналов, описанный в шаге 5.6, чтобы изолировать объект интереса в правильном канале. Убедитесь, что выбранный объект или структура не сильно смещается через z-стек. Поместите прямую линию или прямоугольник над объектом, выберите инструмент Multi Kymograph из меню «Анализ» и введите нужную ширину линии, накладывающей объект.
16. Создавайте панели изображений, которые показывают ядерную динамику в течение определенного временного окна, используя инструмент каналов, описанный в шаге 5.6, и выбрав стеки и сделайте инструменты Монтажа из меню изображения. В всплывающем окне Make Montage введите желаемое количество столбцов и строк, установите коэффициент масштаба 1.0, выберите первый и последний срезы (временные рамки) и измените ширину границы по крайней мере до 5 перед нажатием OK. Можно выбрать, какие изображения в стеке, чтобы показать, изменив приращения в соответствии с желаемой последовательности.
    1. Для создания фильма, загрузить желаемый гиперстек, выберите Сохранить как файл avi из меню файла, выбрать один для сжатия, и ввести frame скорость 2-8 кадров в секунду. Выберите команду Make Montage, выбирая Composite в инструменте каналов для слияния или разделения всех цветов, составляющих изображение.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Два файла avi (фильм1-2) предусмотрены в этом протоколе. Используйте их на Фиджи, чтобы попробовать различные функции, выделенные на протяжении всего шага 5.
    2. Чтобы показать одну репрезентативную ячейку, используйте Transform и Поверните из меню изображения и введите степени вращения. Отрицательные числа вращают объекты влево, в то время как положительные значения вращают объекты вправо. Как только ячейка находится в надлежащей ориентации, нарисуйте прямоугольник, который охватывает всю ячейку через z-стек или в течение временных рамок интереса и выберите Урожай из меню изображения. Продолжить, как упоминалось в шаге 5.16 и 5.16.1 для создания панели изображений или фильма.
17. Добавьте панель масштаба в панель изображений или фильм, выбрав панель инструментов и масштабов из меню «Анализ». В всплывающем окне шкалы бар, введите 5-15 для ширины в микронах для одиночных ячеек или 100-250 для целых полей зрения, выберите белый или черный цвет, и выбрать соответствующее место для размещения шкалы бар.
    1. Для фильмов полезно показать время прогрессии во время ядерных событий. Чтобы показать изменение времени между кадрами, выберите изображение, нажмите на стеки,используйте инструмент Time Stamper, укажите стартовый кадр в временной серии и выберите подходящее место для отображения времени.

Будь живые клетки изображения используется для митоза или мейоза, очень важно использовать здоровые клетки деления дрожжей, прежде чем делать какие-либо наблюдения. Качество полученных данных в значительной степени зависит от исходного материала. Если клетки голодают из-за ограничения питательных веществ или разрастания, они будут показывать избыток вакуол и уменьшение размера клеток (Голод, Рисунок 2A). Для экспериментов митоза, лучше всего избегать использования клеток, которые показывают клеточный стресс (Голод, Рисунок 2A). В противном случае экспериментальные результаты будут непоследовательными и невоспроизводимыми. Чтобы обойти это ограничение, выберите правильный дикий тип управления и ознакомиться с различными фенотипами мутантов, представляющих интерес. Например, митотические клетки, голодающие в течение 12 ч, перестают активно размножаться ДНК. Так как выражение Tos4-GFP связано с G1/S-фазовой активностью22,23, логарифмическими клетками, несущими этот маркер и один для ядерного деления (Sad1-DsRed10) показывают панъядерное выражение Tos4-GFP, Sad1-DsRed foci разделения, и текущих септации (предлагая активную репликацию ДНК и деление клеток) (Лог, Рисунок 2A), в то время как голодающие клетки не показывают такой активности (Голод, Рисунок 2A). Этот результат согласуется с последствиями ограничения питательных веществ в расщеплении дрожжей, что уменьшает транскрипцию в G1, активирует контрольно-пропускной пункт цикла G1/S, и способствует входу G05. Для экспериментов мейоз, клетки должны расти до высокой плотности, но не достигнув стационарной фазы. После этого клетки обоих типов матов смешиваются и инкубируются вместе в носителях азота с низким содержанием азота. Неспособность спариваться, как в случае, когда клетки недостаточно голодали азота, предотвратит их попадание мейоза (Неэффективно, Рисунок 2B). Надежная флоккуляция суспензии клеток увеличивает взаимодействие между клетками и тем самым указывает на успешное спаривание и эффективную мейотическую индукцию (Эффективная, Рисунок 2B).

Агарозе гель колодки и физическое нарушение клеточных сгустков гарантировать надлежащую визуализацию одиночных клеток или asci (Журнал, Рисунок 2A; Эффективно, Рисунок 2B). Колодки должны обеспечивать жесткую, но влажную платформу, на которой клетки одновременно фиксируются на месте и защищены от высыхания. Кроме того, колодки должны быть достаточно толстыми, чтобы выдерживать изменения из-за испарения и обеспечить выровненные поверхности, что позволяет надлежащее внимание во всем приобретении изображения (Рисунок 1C). Вращение Coverslip необходимо для разделения и распространения клеток в рамках спаривания агрегатов(рисунок 1F; Эффективно, Рисунок 2B). Без этого шага, несколько asci, но многочисленные гаплоидные клетки наблюдаются, потому что asci стать в ловушке в недоступных слоях спаривания сгустки, в то время как гаплоидные клетки свободны, чтобы заполнить все доступные монослойные пятна (Рисунок 2B). Даже для митотические эксперименты, где слипание клеток является менее проблематичным, coverslip вращения перемещает клетки вокруг площадки для создания одного слоя клеток с достаточным пространством между клетками, чтобы уменьшить эффекты скученности и позволяют дублирования клеток (Журнал, Рисунок 2A ).

Atb2 является компонентом, участвующим в сегрегации хромосом при расщеплении дрожжей митоза и мейоза7,14. При флуоресцентном маркировке этот цитоскелетный компонент позволяет изучить этапы, характеризующие ядерное разделение при митозе. Во время профазы (0'-20', Рисунок 3A), ядро митотического шпинделя происходит в ядерной стороне веретенообразных полюсных тел (SpBs), как показали волокна Atb2-mRFP, установленные на фоне панядерного фона Htt1-GFP 5. Во время метафазно-анафазного перехода (20'-40', рисунок 3A) митотический шпиндель простирается наружу, а ядро распадается на две части. Когда клетка входит в телофазу (60'-80', рисунок 3A),Atb2-mRFP расширяется двунаправленно до тех пор, пока хромосомы не будут полностью разделены. После этого, Волокна Atb2-mRFP перегруппируются и распространяются по всей поверхности клетки, чтобы восстановить свою межфазную форму в каждой из полученных дочерних ячеек. Цитокинез (Зgt;120',Рисунок 3A)возникает только после того, как перегородка образуется и делит клетку путем деления. После изменений в интенсивности Hht1-GFP в течение митотического цикла показывает три важных шага в ядерной динамике: метафаза-анафаза (средняя интенсивность, уплотнение ДНК: 20'-40',Рисунок 3A-B), телофаза (низкая интенсивность, разделение ДНК: 60'-80', Рисунок 3A-B), и G1 (увеличение интенсивности, дублирование ДНК: 100'-120',Рисунок 3A-B). Аналогичным образом, но с помощью клеток, которые носят только Hht1-mRFP и с использованием мульти-кимографа инструмент (см. шаг 5.15) на Фиджи, можно наблюдать митотическое разделение от метафазы к telophase и оценить ядерные движения, участвующие во время надлежащего сестра хроматид сегрегации (Нормальный, Рисунок 3C). Ней-сегрегации kymographs показать сигнальную активность между двумя основными ядерными путями, указывая на возможную неправоту сегрегации из-за фрагментации хромосомы или неуместного разделения хроматидов (Отставание, Рисунок 3C).

Как упоминалось ранее, в подающий надежды и деления дрожжей, Tos4 транскрибируется в G1 и функции во время репликации ДНК в фазе S22,23. Это можно наблюдать в kymograph где выражение Tos4-GFP увеличивает в ядре после того как Sad1-DsRed10 foci двигают к противоположным направлениям (показывая ядерное разделение), но перед формами перегородки, которая precede cytokinesis (39', Рисунок 3D ; 36', Рисунок 3E). Фаза высокой активности Tos4-GFP начинается в конце перехода M-G1/S (45', Рисунок 3E)и заканчивается в G2 (Nogt;60', Рисунок 3E), сразу после деления клеток. Хотя значительно рассеивается во время G1, Tos4-GFP интенсивность сигнала увеличивает сяпфазы и на протяжении S-фазы и совместно локализуется с сегрегированными Sad1-DsRed foci (45'-60', Рисунок 3E). Этот результат показывает период сепсения в дрожжах деления, когда дублирование генома началось в дочерних клетках (G1/S), но цитокинез еще не произошло.

Hht1 является гистон H3 в расщепления дрожжей и обычно модифицируется с флуоресцентными метками, чтобы визуализировать ядерную ДНК5,14. При митозах, по мере перехода клеток от метафазы к телофазе (20'-120', рисунок 3A),наблюдаются два различимых изменения ядерной массы. Первое изменение включает в себя сокращение ядерных размеров в метафазе (20', Рисунок 3A), в то время как второе показывает расщепление ядра во время анафазы (40', Рисунок 3A). Помимо обмена этими изменениями с митотическими клетками, мейотические клетки демонстрируют ядерные колебания (т.е. конехвостые) (-100' до -50', Рисунок 4A-B) во время гомологичной рекомбинации и дальнейшего уменьшения размера ядра в конце анафазы II (70'-90', Рисунок 4A). Hht1-mRFP используется для изучения фенотипов неправильной сегрегации, таких как отстающие или фрагментированные хромосомы (отставание, рисунок 3C). Он также используется для наблюдения и описания ядерной динамики в каждой из фаз мейоза(рисунок 4A-B). Ядерная масса большая и колеблется в размерах во время большей части конского хвоста (HT: -100' до -50', рисунок 4A-B).).).). По мере того как клетки входят метафазы (MT: -40' до 0', Рисунок 4A-B),ядерный размер и уменьшение колебаний, в соответствии с повышенной активностью конденсата на данном этапе. Начало как анафазы I (MI: 10'-60', Рисунок 4A-B) и II (MII: 70'-90', Рисунок 4A-B) связано с дальнейшим сокращением ядерных и отсутствие механизации ядерного движения, что хорошо коррелирует с двумя ядерными дивизиями, которые характеризуют Meiosis I и II (MI и MII). Таким образом, мейоз связан с колебаниями ядерных размеров при выравнивании и рекомбинации гомологичных хромосом, а также с уменьшением ядерных размеров после двух раундов разделения хромосом. Аллели, которые меняют эти ядерные динамики, вероятно, связаны с регулированием стабильности генома в мейозе12,13.

Rec8 является субединицей мейотического сцепление в делении дрожжей. Он загружается на хроматин после репликации ДНК (mei-S) и держит сестру хроматидов привязали друг к другу до анафазы II. После метафазы I, Rec8 удаляется из хромосомы рук сепараза и защищен на центрометре Sgo1-PP2A. В конце гомологовой сегрегации, Rec8 также устраняется в центререре, тем самым позволяя сестра хроматид разделения (Рисунок 5A)6,24. Rec8-GFP наряду с маркерами сегрегации хромосом, такими как Sad1-DsRed или Hht1-mRFP позволяют визуализировать динамику сплоченности во время мейоза. Сигнал Rec8-GFP является панъядерным во время mei-S (ялт; lt;-90', Рисунок 5A-B), профаза I (-90'до -50', Рисунок 5A-B), и метафаза I (-40'до 0', Рисунок 5A-B). Это наблюдение показывает связь Rec8-GFP вдоль осей хромосом, которая следует за дублированием ДНК. Как клетки входят анафана I (10', Рисунок 5A-B), Rec8-GFP интенсивность уменьшается по всему ядру, но остается сильным в центрометре, где она формирует фокус в каждой ядерной массы (20'-70', Рисунок 5A-B). Этот результат согласуется с деградацией Rec8-GFP вдоль хромосомы рук, но не на центрометре, который наступает после гомологовой сегрегации. Перед анафазой II, Фокус Rec8 исчезает, освобождая сестру хроматидов для разделения в MII (70'-80', Рисунок 5A-B). Таким образом, маркер Rec8-GFP полезен для изучения условий, которые нарушают создание, удаление и общую стабильность мейотической сплоченности. В паре с маркером ядерного разделения, таких как Hht1-mRFP5,13, Rec8-GFP могут быть использованы для решения вопросов о том, как сплоченность сроки и стабильность до и во время мейоза влияют на надлежащее сегрегации хромосомы12 ,13. Этот протокол не касается белков, динамика которых происходит в основном в цитозоле. Тем не менее, таблица I показывает несколько цитозолических белков, которые обычно используются для изучения цитоскелети и мембранных процессов, необходимых для эндоцитоза, экзоцитоза и цитокинеза среди других процессов.

Рисунок 1: Подготовка агарозных прокладок для визуализации живых клеток. (A) Слайд подготовки настройки собраны с помощью пипетки отзыв держатель, лабораторная лента, и микроскоп слайды. Размещение слайдов перпендикулярно друг другу создает карман, где агарозе площадку формы. Добавление фрагментов лабораторной ленты по бокам регулирует ширину агарозной площадки к требуемым спецификациям. (B) Молтен агароза позволяет остыть, прежде чем устанавливать его на микроскоп слайды, чтобы колодки. На этом этапе необходимо постепенно распределять объем агарозы, чтобы избежать создания пузырьков воздуха. (C) Верхняя горка помещается на дозированном месте агарозы, чтобы сформировать круглую площадку с прямой поверхностью, ровными краями, и никаких видимых трещин агарозы. (D) После сдачи образца клеточной подвески на агарозной площадке, инвертировать слайд и место на вершине без ворса бумажное полотенце, чтобы удалить дополнительные жидкие среды. (E) Тщательно поместите coverslip на агарозной площадке, убедившись, что не ловушки любых пузырьков воздуха и проверки, что фокус плоскости плоская, чтобы избежать изменения клеток и фокусировки вопросов. (F) Медленно и осторожно, поверните coverslip по часовой стрелке, чтобы нарушить ячейки скопления и для создания монослой клетки, что позволяет для расширения клеток и лучшей визуализации клеток. (G,H) Используйте нагретую углеводородную смесь, чтобы запечатать агарозные прокладки и позволить им уравновесить до нужной температуры перед визуализацией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Выбор правильных ячеек. (A) Верхние панели показывают деления дрожжевых клеток, оставленных голодать в EMM плюс добавки для 72 ч и нижней панели показывает клетки, проходящие логарифмический рост. В клетках, которые остаются голодать, небольшие морфологии клеток могут быть оценены. Красная открытая стрелка показывает вакуолярные гранулы, характерные для голода. В логарифмических культурах изобилуют клетки, показывающие удлиненные морфологии и септы (красная стрелка), что указывает на активную динамику велоспорта. Правые панели показывают ячейки, выражающие сигналы Tos4-GFP и Sad1-DsRed во время голода и распространения. Панъядерная экспрессия Tos4-GFP и Сигналы Sad1-DsRed, которые локализуются на противоположные полюса клеток, видны во время активного распространения, но не в голоде. (B) Верхняя панель показывает клетки того же типа мата (h) не в состоянии спариваться эффективно. Красная открытая стрелка показывает пару вакуолярных клеток, проходящих кареоми. Это не является необычным в культурах клеток h', где 10% клеток могут переключаться мат типа на h-. Нижняя панель показывает asci в результате эффективного спаривания. Зиготические асчи принимают несколько форм, включая зигзаг (красная стрелка) и формы банановых клеток (красная открытая стрелка). Шкала бар No 5 мкм в длину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Митотической ядерной динамики. (A) Белки Histone H3 (Hht1-GFP) и микротрубули (Atb2-mRFP) следовали в течение одного цикла митоза (120 мин). Индивидуальные сигналы для Hht1-GFP и Atb2-mRFP отображаются в черно-белых панелях, в то время как слияние BF показывает их в соответствующих цветах. (B) Количественная оценка интенсивности Hht1-mGFP в течение митотического цикла. Изменение уровней Hht1 свидетельствует о ядерном делении при митозах и дублировании ДНК в G1. (C) Kymographs показывая нормальную или аномальную сегрегацию в митозах, где в результате ядерные пути либо раздвоения и сохранения целостности ДНК или отклоняться и способствовать фрагментации хромосомы или преждевременного разделения хроматид, соответственно. (D,E) Kymograph и микрографические панели, показывающие продолжительность M-to-G1/S, выявленные в ходе сегрегации Sad1-DsRed и появления ядерных сигналов Tos4-GFP. Обратите внимание на средние панели в E, которые были созданы с помощью FIRE LUT на Фиджи для создания термокарты с интенсивностью, которая облегчает идентификацию пятен с высоким выражением Tos4-GFP; в этом случае, локализованы в ядро и перекрывающихся сигналов Sad1-DsRed, как и ожидалось. Шкала бар No 5 мкм в длину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Мейотическая ядерная динамика. (A) Панельная серия, показывающая движение, уплотнение и деление ядра (Hht1-mRFP) во время мейоза. Лошадиный хвост (HT) показывает обширные стороны в сторону ядерных колебаний следуют Метафазы (MT), где ядерное боковое движение уменьшается и полностью останавливается прямо перед анафазой I. В мейозе I (MI), основная ядерная масса распадается на две части, в то время как в мейозе II (MII) четыре ядра образуются в процессе разделения сестры хроматид. (B) Количественная оценка изменения ядерной области (Hht1-mRFP) в профазе, метафазе, MI и MII. Ядерная область динамическая во время колебаний HT, конденсируется в МТ, и дальнейшее уменьшение размеров во время MI и MII, где мало ядерного движения наблюдается (Длинная ядерная ось). Измерение самой длинной ядерной оси (Длинная ядерная ось) основано на идее, что по мере растягивания круга она перестает иметь постоянный диаметр и генерирует по крайней мере две основные оси: длинную и короткую. Таким образом, при мониторинге изменений в ядре изменения длинной или короткой оси дают признаки ядерного движения. Шкала бар No 5 мкм в длину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Меиотическая сплоченная динамика. (A) Серия панелей, показывающая, как изменение сигнала Rec8-GFP коррелирует с мейотической ядерной динамикой. Во время HT и MT, сигнал Rec8-GFP является панядерным и следует за ядерным движением (Hht1-mFRP). В MI, Rec8-GFP рассеивается из ядра, оставляя только пару очагов, что согласуется с удалением Rec8 из хромосомы рук и созданием защиты Sgo1-PP2A в центре. По мере приближения ячейки MII, фокусы Rec8-GFP начинают исчезать и больше не видны прямо перед анафазой II. (B) Количественная оценка интенсивности Rec8-GFP от HT до MII. Подобно тому, что наблюдается в A, GFP сигнал высок через HT и MT, существенно уменьшается во время MI и полностью исчезают в MII. Эта модель подтверждает сплоченную динамику на хромосомных руках и центромере, где она удерживает привязку к хроматидам сестры до тех пор, пока не будет готова к разделению в MII. Шкала бар No 5 мкм в длину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1: Маркеры ядерной и цитосоличной динамики.

Фильм 1: Переход M-to-G1/S, показывающий тело шпинделя (SPB; Sad1-DsRed) разделение предшествующей сепселяции и накопления ядерного сигнала Tos4-GFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)

Фильм 2: Завершение митотического цикла, показывающего расширение микротрубочки (Atb2-mRFP), коррелирует с ядерным (Hht1-GFP) разделением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)

Авторам нечего раскрывать.