Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В Vesiculo Синтез прекурсоров пептидной Мембраны для автономного роста Весикл

5.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59831

⸱

28 июня 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Physics of Synthetic Systems - E14, Physics-Department and ZNN, Technische Universität München, 2Departmant of Chemistry, Center for Integrated Protein Science (CIPSM), Technische Universität München, 3Nanosystems Initiative Munich

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлены протоколы для создания пептидных основе малых unilamellar пузырьков способны к росту. Для облегчения производства везикуло мембранного пептида эти пузырьки оснащены системой транскрипции-перевода и пептидно-кодирующей плазмидой.

Аннотация

Соизвобихация биохимических реакций является центральным аспектом синтетических клеток. Для этого реакционные отсеки на основе пептида служат привлекательной альтернативой липосом или пузырькам на основе жирных кислот. Внешне или в пределах пузырьков пептиды могут быть легко выражены и упростить синтез мембранных прекурсоров. Здесь предусмотрен протокол для создания пузырьков диаметром 200 нм на основе амфифильных эластиноподобных полипептидов (ELP), используя обезвоживание-регидратацию из стеклянных бусин. Также представлены протоколы для бактериального выражения И очищения ELP через обратную температуру цикла, а также их ковалентной функционализации с флуоресцентными красителями. Кроме того, в настоящем докладе описывается протокол, позволяющий транскрипции РНК aptamer dBroccoli внутри пузырьков ELP, как менее сложный пример для биохимической реакции. Наконец, предусмотрен протокол, который позволяет в везикуло экспрессии флуоресцентных белков и мембранного пептида, в то время как синтез последнего приводит к росту везикулы.

Введение

К созданию синтетических живых клеточных систем обычно подходят с двух разных направлений. В методе «сверху вниз» геном бактерии сводится к ее основным компонентам, что в конечном итоге приводит к минимальной клетке. При подходе «снизу вверх» искусственные клетки собираются из молекулярных компонентов или клеточных подсистем, которые должны быть функционально интегрированы в последовательную клеточную систему.

При подходе de novo разобщенное необходимые биохимические компоненты обычно достигается с помощью мембран, изготовленных из фосфолипидов или жирных кислот1,2,3,4. Это потому, что "современные" клеточные мембраны в основном состоят из фосфолипидов, в то время как жирные кислоты считаются правдоподобными кандидатами пребиотических мембранных корпусов5,6. Для образования новых мембран или для облегчения роста мембраны, амфифилические строительные блоки должны быть предоставлены из внешнего7 или в идеале через производство в мембранном отсеке с использованием соответствующих анаболических процессов4 ,8.

В то время как синтез липидов является относительно сложным метаболическим процессом, пептиды могут быть произведены довольно легко с помощью клеточных реакций экспрессии генов9,10. Таким образом, пептидные мембраны, образованные амфифильных пептидов представляют собой интересную альтернативу липидных мембран в качестве корпусов для искусственных клеток мимики, которые способны расти11.

Амфифильные эластиновые диблокитеры (ELPs) являются привлекательным классом пептидов, которые могут служить строительным блоком для таких мембран12. Основной мотив аминокислотной последовательности ELPs является (GaGVP)n, где "а" может быть любой аминокислоты, за исключением пролин и "n" является число мотив повторяет13,14,15,16,17 . ELPs были созданы с гидрофобным блоком, содержащим главным образом фенилаланин для и гидрофильных блоков в основном состоит из глутаминовой кислоты11. В зависимости от параметров раствора, таких как рН и концентрация соли, ELPsдемонстрируют так называемый обратный переход температуры при температуре T t, где пептиды проходят полностью обратимый переход фазы от гидрофильной к гидрофобной Государства. Синтез пептидов может быть легко реализован внутри пузырьков с помощью экстракта бактериальных клеток "TX-TL"11,18,19,20,21, который обеспечивает все необходимые компоненты для сочетания транскрипции и переводческих реакций.

TX-TL система была инкапсулирована вместе, с шаблоном ДНК кодирования ELPs в ELP пузырьков с использованием обезвоживания-регидратации из стеклянных бусин в качестве твердой поддержки. Формирование пузырьков происходит путем регидратации высушенных пептидов с поверхности бисера11. Другие методы22 для образования везикулы могут быть использованы, которые потенциально показывают более низкую polydispersity и более большие размеры везикулы (например, электро-образование, передача участка эмульсии, или microfluidics-основанные методы). Для проверки жизнеспособности метода инкапсуляции, транскрипция флюорогенного aptamer dBroccoli23 может быть использована в качестве альтернативы11, что является менее сложным, чем экспрессия генов с системой TX-TL.

Благодаря экспрессии мембранных строительных блоков в везикуло и их последующему включению в мембрану, пузырьки начинают расти11. Мембрана включения ELPs может быть продемонстрирована с помощью исследования FRET. С этой целью, ELPs, используемые для формирования первоначальной популяции везикл, спрягаются с флуоресцентными красителями в равных долях, составляющих пару FRET. При экспрессии немаркированных ELPs в vesiculo и их вхождение в мембрану, помеченные ЭЛП в мембране разбавляются и, следовательно, сигнал FRET уменьшается11. В качестве универсального и распространенного метода спряжения используется медь катализированный азиде-алкын циклоуг. При использовании стабилизирующего лиганда, такого как трис (бензилтриазолметилметил)-амин, реакция может осуществляться в вавном растворе при физиологическом рН без гидролиза реагентов11, что подходит для спряжений реакций с пептидами.

В следующем протоколе представлено подробное описание подготовки к выращиванию пептидосом на основе ELP. Описано выражение пептидов и образование везикул с использованием метода стеклянных бусин. Кроме того, описано, как реализовать транскрипцию флюорогенного апртами dBroccoli aptamer и транскрипции-перевод реакции для экспрессии белка внутри пузырьков ELP. Наконец, при условии, что это процедура для спряжения ЭЛП с флюорофорами, которые могут быть использованы для доказательства роста везикля через FRET ассссе11.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Выражение эластиноподобных полипептидов

  1. День 1: Подготовка стартовой культуры и принадлежностей для экспрессии пептида
    1. Подготовка и автоклав экспрессии культуры фляги (4 х 2,5 л) и 3 L среды LB. Для 1 L среды LB, добавить 25 г порошка LB 1 л ультрачистой воды.
    2. Подготовьте стартерную культуру с 100 мл среднего LB, 50 л стерильной фильтрованного (0,22 мкм фильтра) раствора хлорамфеникол (25 мг/мл в EtOH) и 50 л стерильной фильтруе (0,22 мкм фильтра) карбенициллина (100 мг/мл в 50% EtOH и 50% ультрачистых водоотворенных).
    3. Добавьте небольшую полосу из предсделанного бактериального запаса, содержащего штамм E. coli BL21 (DE3)pLysS с вектором экспрессии pET20b (я), кодируя полипептидную последовательность MGHGVGVP ((GEGVP)4(GVGVP))4((GFGVP) 4 (GFGVP) 4 (GVGVP)3 (GFGVP)4GWP (сокращенно как EF) до предварительно разогретых 100 мл стартовой культуры и инкубировать при 37 кв с для 16 ч с 250 об/мин в дрожащем инкубаторе (E. coli штаммов и векторов доступны по запросу).
    4. Предварительно разогреть фляги культуры выражения и LB-носители на ночь на 37 градусов по Цельсию, чтобы они были готовы на следующий день.
  2. День 2: Выражение белка
    1. Добавьте 750 мл средней для каждой культуры выражения колбу, 375 л стерильной фильтрованного (0,22 мкм фильтра) хлорамфениколного запаса (25 мг/мл в EtOH) и 375 л стерильной фильтрированной (0,22 мкм фильтра) карбенициллина (100 мг/мл в 50% воды).
    2. После агитации для распространения антибиотиков, принять 2 мл средств массовой информации в качестве эталонного образца для измерения оптической плотности на 600 нм (OD600).
    3. Добавьте 7,5 мл стартовой культуры в флягу выражения и инкубировать на 1 ч при 37 градусах По цельсии с 250 об/мин.
    4. После этого шагаOD 600 каждой колбы будут проверяться каждые 20 минут.
    5. Когда оптическая плотность достигает примерно 0,8 снизить температуру до 16 градусов по Цельсию и вызвать экспрессию пептида, добавив 750 л 1 М стерильной фильтруется й-изопропил тиогалактозид (IPTG) в ультрачистой воде в каждой фляге выражения.
    6. Инкубировать флягу с индуцированными бактериями при 16 градусах по Цельсию на 16 ч с 250 об/мин.
  3. День 3: Извлечение выраженного полипептида
    1. Предварительно взвесить флягу для центрифугирования, чтобы определить массу клеточной гранулы после сбора урожая.
    2. Урожай все бактерии из экспресс-фляг и центрифугации в течение 20 минут с помощью предварительно охлажденных центрифуги на 4000 х г и 4 кв. C.
    3. Вылейте супернатант и профолите центрифуги бутылки на стерильное бумажное полотенце.
    4. Взвесьте фляги центрифугации и вычислите массу клеточных гранул.
    5. Resuspend клетки, которые pelleted вниз от 750 ml первоначально культуры клетки, в 15 ml фосфат-буферизированного соливого (PBS, pH 7.4) трубацией, и центрифуге на 4,000 x g на 20 min на 4 c. Вылейте супернатант и профолите центрифуги бутылки на стерильное бумажное полотенце.
    6. Приостановить клеточной гранулы для лизис шаг в 2 мл буфера на 1 грамм клеточной гранулы с использованием PBS (pH 7.4) дополнены лизозим (1 мг/мл), 1 мм фенилметилфонил фтора (PMSF), 1 мМ бензамидина, и 0,5 Ю DNase I.
    7. Сножайте клетки для дальнейшего лизиса на льду с помощью звукового атлетатора при 8 Вт в течение 9 мин с чередующимися 10 s sonication и 20 s паузы, а затем 9 минут паузы, во время которой образец должен быть охлажден на льду. Повторите 9 мин sonication шаг еще раз.
    8. Добавьте 2 мл 10% (w/v) полиэтиленеимина (PEI) на 1 л исходной клеточной культуры для осадков нуклеиновой кислоты.
    9. Распределите образец по 2 мл центрифуговых труб и инкубировать при 60 градусах по Цельсию в течение 10 мин, а затем инкубацию в течение 10 минут при 4 градусах По Цельсию.
    10. Centrifuge раствор на 16000 х г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия и соберите супернатант, содержащий ELP.
  4. Очистка белка с помощью обратной температуры цикла:
    1. Отрегулируйте супернатант до рН 2, чтобы переключить гидрофильные части пептида на гидрофобные и вызвать агрегацию. Для регулировки рН используются фосфорная кислота и гидроксид натрия. полосы pH достаточны для определения уровня рН.
    2. Для повышения урожайности очистительного образца нагреть образец до 60 градусов по Цельсию и добавить хлорид натрия до 2 М.
    3. Впоследствии центрифуги образца на 16000 х г в течение 10 минут при комнатной температуре (RT).
    4. Откажитесь от супернатанта и повторно растворите гранулы в PBS (но только половина первоначального объема используется по сравнению с предыдущим шагом).
    5. Отрегулируйте рН до 7 с фосфорной кислотой и гидроксидом натрия. полосы рН достаточно точны, чтобы определить рН.
    6. Centrifuge образец впоследствии на 16000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
    7. Соберите супернатант и повторите шаги 1.4.1-1.4.6 до 3x всего, за исключением того, что в последнем повторении шага 1.4.4 вместо PBS добавляется только вода.
    8. Измерьте концентрацию пептидов с помощью спектрометра поглощения. Используйте коэффициент вымирания 5500/M/cm на уровне 280 нм.
    9. Отрегулируйте концентрацию ЭЛП до 700 мкм.

2. Везикл Производство С использованием стеклянных бусин метод

  1. Сконцентрируйте раствор ELP до 1,1 мМ с помощью центробежного вакуумного концентратора.
  2. Смешайте 200 л концентрированного раствора ELP с 1250 л л хлороформом/метаноловой смесью с последующим вихрем.
  3. Добавьте 1,5 г сферических стеклянных бусин (212–300 мкм в размерах) к круглой нижней колбе размером 10 мл.
  4. Добавьте раствор, содержащий ELP и смесь хлороформа/метанола, в круглую нижнюю колбу и перемешайте нежной тряской.
  5. Соедините колбу с роторным испарителем. Отрегулируйте скорость до 150 об/мин и отрегулируйте давление до -0,2 х 105 Па (-200 мбар) в течение примерно 4 минут, пока жидкость не испарится при комнатной температуре.
  6. Поместите круглую нижнюю колбу в ошикатор, по крайней мере 1 ч, чтобы остальные хлороформы и метанола испаряются. Чтобы избежать потери стеклянных бусин, слабо прикрепленная алюминиевая фольга должна быть обернута вокруг круглого нижнего отверстия колбы.
  7. Для одного эксперимента смешайте 100 мг пептидных стеклянных бусин с 60 злителю раствора отеков, таких как PBS. Инкубировать этот образец при 25 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
  8. Centrifuge образец быстро с столешница центрифуга для осадка стеклянные бусы.
  9. Используйте пипетку для сбора супернатанта, который содержит пузырьки.

3. Транскрипция РНК Aptamer dBroccoli внутри Vesicles

  1. Очистите лабораторную скамейку салфетками, содержащими решение для обеззараживания RNase, чтобы создать рабочую среду без RNase.
  2. Смешайте ssDNA (5 мКМ), включающий последовательность T7 promotor и dBroccoli (GAGACGGTCGGGTCCATCTGAGACGGGGGGTCCAGATTCGTGATTCGCTGTTTGAGASGAGGTGGGGGGATGGATTASTAGTGGGGGATTASGATAGTGGGGGGATAGTGGTGG, а также некодирующая прядь (5 мкм) в нуклеайированную воду Рнкпол реакционный буфер (40 мМ Tris-HCl ( pH 7.9), 6 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол (DTT), и 2 мМ спермидин, чтобы подготовить шаблон ДНК для реакции транскрипции.
  3. Инкубировать раствор при температуре 90 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем медленное снижение температуры до 20 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
  4. Подготовьте раствор 1 мМ (5)-5-(3,5-дифторо-4-гидроксибензилена)-2,3-диметил-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-один (DFHBI) растворив 1,26 мг DFHBI в 5 мл ДМСО.
  5. Подготовьте реакцию транскрипции, смешивая буфер реакции РНКПол (40 мМ Tris-HCl (pH 7.9), 6 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол (DTT), и 2 мм спермидин с 125 мМ KCl, 15 мМ MgCl2, 4 мМ rNTP, 10 ММ DFHBI, 200 НМ шаблон ДНК, 0,5 УТ /Л RNase ингибитор мурин, и вода.
  6. Непосредственно перед началом реакции добавьте 4 U/L Полимеразы T7.
  7. Используйте эту реакционную смесь в качестве раствора отеков в шаге 2.7 и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение всего эксперимента, который обычно составляет 1 ч.

4. Реакция транскрипции-перевода (TX-TL)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для реакции транскрипции-перевода требуется экстракт сырой клетки, а также буфер реакции и ДНК. Экстракт сырой клетки готовится, как описано в Sun et al.18. Для реакции TX-TL используйте следующее: 33% (v/v) сырого экстракта кишечной палочки, 42% (v/v) буфер реакции и 25% (v/v) фенол-хлороформ очищенной ДНК плюс добавки. Окончательные концентрации составляют примерно 9 мг/мл белка, 50 мМ HEPES (pH 8), 1,5 мм АТФ, 1,5 мм ГТП, 0,9 мм CTP, 0,9 мм UTP, 0,2 мг/мл tRNA, 26 мм кофермента А, 0,33 мм НАД, 0,75 мм ЦАМП, 68 мм фолиновой кислоты, 1 мм , 30 мМ PEP, 1 мМ DTT, 2% PEG-8000, 13,3 мм мальтоза, 1 U T7 РНК полимераза, и 50 нм плазмид ДНК в ультрачистой воде.

  1. Фенолхлороформная очистка шаблона ДНК
    1. Приготовьте шесть ночных культур с 5 мл среднего LB и 5 л стерильной фильтрованного (0,22 мкм фильтра) карбеничиллина (100 мг/мл в 50% EtOH и 50% ультрачистой воды).
    2. Добавьте небольшую полосу из готовых бактериальных запасов, содержащих DH5 'E. coli с вектором экспрессии pET20b (я) к каждой предварительно разогретой культуре 5 мл на ночь и инкубировать при 37 кВ для 16 ч с 250 об/мин. В зависимости от того, какой пептид (EF) или белок (YPet или mVenus) должен быть выражен, используется специфическая космида кодирования.
    3. Извлеките плазмид с мини-подготовительным комплектом как описано в руководстве потребителя или путем следовать протоколу обеспеченному Чжан и др.24.
    4. Подготовьте 100 кЛ предварительно очищенной плазмидной ДНК (концентрация может варьироваться от 200-600 нг/Л) и смешайте с 100 л л роти-фенола/хлороформа/изоамила (рН 7,5-8.0) в микроцентрифуговой трубке, чтобы обеспечить лучшую фазу разделения.
    5. Аккуратно инвертировать трубку до 6x и центрифуги в течение 5 минут при 16000 х г на RT.
    6. Добавьте 200 л хлороформа в верхнюю часть трубки и инвертировать трубку до 6x.
    7. Центрифуги образца на 16000 х г в течение 5 мин на RT.
    8. Пипот супернатант в отдельную трубку и добавить 10 зл 3 М ацетата натрия для осадков этанола.
    9. Добавьте 1 мл -80 градусов по Цельсию холодный этанол и храните образец при -80 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
    10. Центрифуги образца при 16000 х г в течение 15 мин при 4 градусах По Цельсию.
    11. Декант супернатант и добавить 1 мл -20 градусов по Цельсию холодный 70% (v/v) этанол.
    12. Центрифуга при 16 000 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
    13. Удалите жидкость путем пипетки. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить ДНК гранулы.
    14. Храните образец на RT в течение примерно 15 минут, чтобы испарить оставшийся этанол.
    15. Добавьте ультрачистую воду в образец, чтобы отрегулировать концентрацию образца примерно до 300 нм, которая измеряется поглощением на уровне 260 нм.
  2. Подготовка реакции TX-TL
    1. Оттепель подготовленный экстракт сырой клетки и буфер реакции на льду.
    2. Для рекшера реакции 60 л, добавить плазмид ДНК (фенол-хлороформ очищенный) до 37,5 л реакционного буфера 50 мМ HEPES (pH No 8), 1,5 мм ММ АТП, 1,5 мм ГТП, 0,9 мМ CTP, 0,9 мМ UTP, 0,2 мг/мл tRNA, 26 мм. , 0,75 мМ CAMP, 68 мм фолиновой кислоты, 1 мм спермидин, 30 мм ПЭП, 1 мМ DTT, 2% PEG-8000, и 13,3 мм мальтоза), а затем добавление 28,7 мл экстракта сырой клетки. Заполните до окончательного тома с ультрачистой водой до 58,8 л.
    3. Непосредственно перед началом реакции добавьте 1,2 л раствора полимеразы T7 РНК и смешайте образец, прокладывая вверх и вниз.
    4. Используйте эту реакционную смесь в качестве раствора отеков в шаге 2.7 и инкубируйте при 29 градусах Цельсия в течение всего эксперимента, который обычно составляет 4–8 ч.

5. Спряжение эластиноподобных полипептидов с флюорофорами через Медный катализдированный Азиде-алкинь Юисген Циклоуг

  1. Подготовьте в DMSO раствор 20 мМ NHS-azide linker (з-азидобутириновая кислота N-гидроксисуччинимидэ эстер).
  2. Смешайте 250 л раствора ELP (600 мкм) с PBS (8 г/л NaCl, 0,2 г/l KCl, 1,42 г/L Na2HPO4, 0,27 г/л K2HPO4, pH 7.2) и NHS-azide (1,2 мм) и incubate для 12 ч.
  3. Загрузите образец в 10 kDa диализной кассеты и хранить его на 4 кк с 12 ч в 1 л ультрачистой воды, чтобы удалить соли и остаточный NHS-azide.
  4. Смешайте активированный ELP (500 мкм) с алкином-конъюгированным красителем (500 мкм), Cy5-alkyne, или Cy3-alkyne.
  5. Смешайте этот образец с 1 мМ TBTA (трис (бензилтриазолметилметил) амин), 10 мМ TCEP (трис (2-карбоксетил)-фосфин гидрохлорид) и 10 мМ CuSO4 и инкубировать при 4 КС на 12 ч.
  6. Загрузите образец в кассету диализа 10 kDa и храните его при 4 градусах по Цельсию на 12 ч в 1 л ультрачистой воды, чтобы удалить соли и остаточные алкиненовые конъюгированные красители.
  7. Эти одиозные ELPs, модифицированные в красителях, используются в смеси 1:1 с маркировкой Cy3 и с маркировкой Cy5, аналогичной пептидам во второй части.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Везикл производства
На рисунке 1 показаны изображения электрон-микроскопии передачи (TEM), подготовленные с различными растворами отеков и методом стеклянных бусин (также см. Vogele et al.11). Для выборки на рисунке 1A, только PBS был использован в качестве отечного раствора, чтобы доказать образование пузырьков и определить их размер. Когда TX-TL был использован в качестве отеков решение(Рисунок 1...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Регидратация пленки является общей процедурой для создания небольших униламеллярных пузырьков. Основным источником отказа является неправильное обращение с материалами, используемыми в процедуре.

Первоначально ЭЛП производятся клетками кишечной палочки. Урожайность после очистки ELP может значительно варьироваться в зависимости от того, насколько тщательно протокол проводится во время его решающих шагов. Это обратный ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.

Благодарности

Мы с благодарностью отмечаем финансовую поддержку через DFG TRR 235 (Появление жизни, проект P15), Европейский исследовательский совет (грантовое соглашение No 694410 AEDNA) и Международную высшую школу науки и инженерии TUM (проект No 9.05) . Мы благодарим Э. Фальгенгауэр за помощь в подготовке образцов. Мы благодарим А. Дупина и М. Шварца-Шиллинга за помощь в системе TX-TL и полезные дискуссии. Мы благодарим Н.Б. Холланда за полезные дискуссии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2xYTMP биомедицинские3012-032
3-PGASigma-AldrichP8877
5PRIME Phase Lock GelTM tubeVWR733-2478
алкин-конъюгированный Cy3Sigma-Aldrich777331
алкин-конъюгированный Cy5Sigma-Aldrich777358
ATPSigma-AldrichA8937
БензамидинКарл РотCN38.2
BL21 Розетта 2 E. coli штаммNovagen71402
Bradford BSA Protein Assay KitBio-rad500-0201
cAMPSigma-AldrichA9501
КарбенициллинКарл Рот6344.2
ХлорамфениколСигма-ОлдричC1919
ХлорамфениколКарл Рот3886.3
ХлороформКарл Рот4432.1
CoAСигма-ОлдричC4282
CTPUSB14121
CuSO4CarlRothP024.1
DFHBILucerna Technologies410
ДМСОКарл РотA994.1
ДНКаза INEBM0303S
DTT Sigma-AldrichD0632
ЭтанолКарл Рот9065.2
Фолиевая кислотаSigma-AldrichF7878
Стеклянные шарики, промытые кислотойSigma-AldrichG1277
GTPUSB16800
HEPESSigma-AldrichH6147
IPTG (β-изопропилтиогалактозид)Sigma-AldrichI6758
KClCarl RothP017.1
K-глутаматSigma-AldrichG1149
LB бульонCarl RothX968.2
лизоцимSigma-AldrichL6876
МетанолКарл Рот82,2
MgCl2RothKK36,3
Mg-глутаматSigma-Aldrich49605
Микро биоспиновые хроматографические колонкиBio-Rad732-6204
NADSigma-AldrichN6522
NHS-азидный линкер (эфир оксисукцинимида азидомасляной кислоты)BaseclickBCL-033-5
PEG-8000Карл Рот263,2
pH полоскиКарл Рот549,2
ФенилметилсульфонилфторидКарл Рот6367,2
Фосфатно-солевой буферVWR76180-684
Фосфорная кислотаSigma-AldrichW290017
ПолиэтилениминSigma-Aldrich408727
Раствор двухосновного фосфата калияSigma-AldrichP8584
Одноосновной раствор фосфата калияSigma-AldrichP8709
Qiagen Miniprep KitQiagen27106
RNAPol реакционный буферNEBB9012
Мышиный ингибитор РНКазыNEBM0314S
РНКазеZap WipesThermoFisherAM9788
rNTPNEBN0466S
Роти-Фенол/Хлороформ/Изоамиловый спиртCarlrothA156.1
RTS Amino Acid Sampler5 Prime2401530
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)Thermo-Scientific66382
Хлорид натрияCarl Roth9265.1
Гидроксид натрияCarl Roth8655.1
СпермидинSigma-Aldrich85558
Стерильно-фильтрованный (0.22 µ КарлРотXH76.1
Т7 полимеразаNEBM0251S
TBTA (трис(бензилтриазолилметил)амин)Sigma-Aldrich678937
TCEP (трис(2-карбоксиэтил)-фосфина гидрохлорид)Sigma-AldrichC4706
трис основаниеFischerBP1521
тРНК (из кишечной палочки)Roche Applied НаукаMRE600
UTPUSB23160
Carl

Ссылки

  1. Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
  2. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
  3. Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
  4. Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058(2016).
  5. Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
  6. Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
  7. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
  8. Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
  9. Chu, H. -S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
  10. Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
  11. Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862(2018).
  12. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
  13. McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
  14. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
  15. Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
  16. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  17. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
  18. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).
  19. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  20. Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
  21. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
  22. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  23. Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
  24. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).
  25. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ELPFRET
В Vesiculo Синтез прекурсоров пептидной Мембраны для автономного роста Весикл
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.