Здесь представлены протоколы для создания пептидных основе малых unilamellar пузырьков способны к росту. Для облегчения производства везикуло мембранного пептида эти пузырьки оснащены системой транскрипции-перевода и пептидно-кодирующей плазмидой.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В Vesiculo Синтез прекурсоров пептидной Мембраны для автономного роста Весикл
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Соизвобихация биохимических реакций является центральным аспектом синтетических клеток. Для этого реакционные отсеки на основе пептида служат привлекательной альтернативой липосом или пузырькам на основе жирных кислот. Внешне или в пределах пузырьков пептиды могут быть легко выражены и упростить синтез мембранных прекурсоров. Здесь предусмотрен протокол для создания пузырьков диаметром 200 нм на основе амфифильных эластиноподобных полипептидов (ELP), используя обезвоживание-регидратацию из стеклянных бусин. Также представлены протоколы для бактериального выражения И очищения ELP через обратную температуру цикла, а также их ковалентной функционализации с флуоресцентными красителями. Кроме того, в настоящем докладе описывается протокол, позволяющий транскрипции РНК aptamer dBroccoli внутри пузырьков ELP, как менее сложный пример для биохимической реакции. Наконец, предусмотрен протокол, который позволяет в везикуло экспрессии флуоресцентных белков и мембранного пептида, в то время как синтез последнего приводит к росту везикулы.
Введение
К созданию синтетических живых клеточных систем обычно подходят с двух разных направлений. В методе «сверху вниз» геном бактерии сводится к ее основным компонентам, что в конечном итоге приводит к минимальной клетке. При подходе «снизу вверх» искусственные клетки собираются из молекулярных компонентов или клеточных подсистем, которые должны быть функционально интегрированы в последовательную клеточную систему.
При подходе de novo разобщенное необходимые биохимические компоненты обычно достигается с помощью мембран, изготовленных из фосфолипидов или жирных кислот1,2,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Выражение эластиноподобных полипептидов
- День 1: Подготовка стартовой культуры и принадлежностей для экспрессии пептида
- Подготовка и автоклав экспрессии культуры фляги (4 х 2,5 л) и 3 L среды LB. Для 1 L среды LB, добавить 25 г порошка LB 1 л ультрачистой воды.
- Подготовьте стартерную культуру с 100 мл среднего LB, 50 л стерильной фильтрованного (0,22 мкм фильтра) раствора хлорамфеникол (25 мг/мл в EtOH) и 50 л стерильной фильтруе (0,22 мкм фильтра) карбенициллина (100 мг/мл в 50% EtOH и 50% ультрачистых водоотворенных).
- Добавьте небольшую полосу из предсделанного бактериального запаса, содержащего штамм ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Везикл производства
На рисунке 1 показаны изображения электрон-микроскопии передачи (TEM), подготовленные с различными растворами отеков и методом стеклянных бусин (также см. Vogele et al.11). Для выборки на рисунке 1A, только PBS был использован в качестве отечного раствора, чтобы доказать образование пузырьков и определить их размер. Когда TX-TL был использован в качестве отеков решение(Рисунок 1.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Регидратация пленки является общей процедурой для создания небольших униламеллярных пузырьков. Основным источником отказа является неправильное обращение с материалами, используемыми в процедуре.
Первоначально ЭЛП производятся клетками кишечной палочки. Урожайность после очистки ELP может значительно варьироваться в зависимости от того, насколько тщательно протокол проводится во время его решающих шагов. Это обратный .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.
Благодарности
Мы с благодарностью отмечаем финансовую поддержку через DFG TRR 235 (Появление жизни, проект P15), Европейский исследовательский совет (грантовое соглашение No 694410 AEDNA) и Международную высшую школу науки и инженерии TUM (проект No 9.05) . Мы благодарим Э. Фальгенгауэр за помощь в подготовке образцов. Мы благодарим А. Дупина и М. Шварца-Шиллинга за помощь в системе TX-TL и полезные дискуссии. Мы благодарим Н.Б. Холланда за полезные дискуссии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2xYT | MP биомедицинские | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| алкин-конъюгированный Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| алкин-конъюгированный Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Бензамидин | Карл Рот | CN38.2 | |
| BL21 Розетта 2 E. coli штамм | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Карбенициллин | Карл Рот | 6344.2 | |
| Хлорамфеникол | Сигма-Олдрич | C1919 | |
| Хлорамфеникол | Карл Рот | 3886.3 | |
| Хлороформ | Карл Рот | 4432.1 | |
| CoA | Сигма-Олдрич | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4Carl | Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| ДМСО | Карл Рот | A994.1 | |
| ДНКаза I | NEB | M0303S | |
| DTT Sigma-Aldrich | D0632 | ||
| Этанол | Карл Рот | 9065.2 | |
| Фолиевая кислота | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Стеклянные шарики, промытые кислотой | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-изопропилтиогалактозид) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-глутамат | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB бульон | Carl Roth | X968.2 | |
| лизоцим | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Метанол | Карл Рот | 82,2 | |
| MgCl2 | Roth | KK36,3 | |
| Mg-глутамат | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Микро биоспиновые хроматографические колонки | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-азидный линкер (эфир оксисукцинимида азидомасляной кислоты) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Карл Рот | 263,2 | |
| pH полоски | Карл Рот | 549,2 | |
| Фенилметилсульфонилфторид | Карл Рот | 6367,2 | |
| Фосфатно-солевой буфер | VWR | 76180-684 | |
| Фосфорная кислота | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| Полиэтиленимин | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Раствор двухосновного фосфата калия | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Одноосновной раствор фосфата калия | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol реакционный буфер | NEB | B9012 | |
| Мышиный ингибитор РНКазы | NEB | M0314S | |
| РНКазеZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Роти-Фенол/Хлороформ/Изоамиловый спирт | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| Хлорид натрия | Carl Roth | 9265.1 | |
| Гидроксид натрия | Carl Roth | 8655.1 | |
| Спермидин | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Стерильно-фильтрованный (0.22 µ Карл | Рот | XH76.1 | |
| Т7 полимераза | NEB | M0251S | |
| TBTA (трис(бензилтриазолилметил)амин) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (трис(2-карбоксиэтил)-фосфина гидрохлорид) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| трис основание | Fischer | BP1521 | |
| тРНК (из кишечной палочки) | Roche Applied Наука | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
Ссылки
- Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
