Метод Ex Vivo для оценки спонтанной подвижности репродуктивных путей мыши и алгоритмотслеживания движения uterus на основе MATLAB для анализа данных

Как основной женский орган, матка имеет решающее значение для размножения и имеет важное значение для питания плода¹. Матка состоит из трех слоев: периметрия, миометрия и эндометрия. Миометрий является основным сократительный слой матки и играет ключевую роль в родах. Эндометрий является самым внутренним слоем, выстилающими полость матки, и необходим для имплантации эмбриона. У небеременных женщин репродуктивного возраста, слой эндометрия сбрасывается ежемесячно в начале менструального цикла. Миометрий помогает в этом процессе пролития путем поддержания спонтанных сокращений миометрия, необходимых для очистки ткани некротической эндометрия из матки¹.

К сожалению, повышенная контрактильность миометрии может привести к негативным побочным эффектам, таким как дисменорея, или болезненные менструальные спазмы. Это особенно наблюдается у молодых женщин и nulliparous женщин². Тем не менее, дисменорея отличается для каждой женщины и зависит от силы их миометрических сокращений; более сильные сокращения часто связаны с ощущением тяжелых судорог³. Миометрия контрактильность может быть визуализирована с помощью УЗИ матки и часто признается как эндометрия волн. Повышенное высвобождение простагландинов во время менструации⁴ в матке, переживающей эдометрия, как полагают, способствует увеличению гиперконтрактильности миометрии, что приводит к ишемии и гипоксии мышц матки и, таким образом, увеличивается боль³.

Тяжелая дисменорея может препятствовать повседневной деятельности некоторых женщин и от 3 до 33% женщин имеют очень сильную боль, которая может привести к женщине быть прикован к постели в течение 1 до 3 дней каждый менструальный цикл⁵. Дисменорея является основной причиной гинекологической заболеваемости у женщин репродуктивного возраста независимо от возраста, национальности и экономического положения⁵. По оценкам, распространенность дисменореи является как высокой, так и переменной, в диапазоне от 45% до 93% у женщин репродуктивного возраста⁵.  Дисменорея связанных боль оказывает влияние на повседневную жизнь женщин и может привести к плохой успеваемости у подростков, более низкое качество сна, ограничение повседневной деятельности, и изменения настроения⁵.

Многие женщины, которые испытывают серьезные дисменорея прибегают к внебиржевой лекарства, чтобы облегчить их боль. Такие безрецептурные препараты содержат ингибиторы циклооксигеназы (КОКС),которые предотвращают образование простагландинов 6. Тем не менее, ингибиторы COX связаны с неблагоприятными сердечно-сосудистыми событиями, и около 18% женщин с дисменореей не реагируют на эти ингибиторы⁷. Таким образом, существует необходимость в новых лекарствах для уменьшения менструальных спазмов. В виду того что над contractility uterus способствует к pathogenesis dysmenorrhea, одной по возможности стратегией может быть польза утробных релаксантов.

Полезно количественно овоздействии потенциальных релаксантов в модели естественных спонтанных миометрийных волнообразных сокращений. Однако, до сих пор, не эффективный метод ex vivo для тестирования мышечно-расслабляющие препараты в нетронутой матки не было описано. В настоящее время изометрические измерения напряжения используются для оценки эффектов релаксантных препаратов. Во время таких измерений мышечная полоса матки поддерживается на постоянной длине при предварительной нагрузке в тканевой ванне, в то время как сила сокращения мышц матки регистрируется до и после стимуляции окситоцина в присутствии или отсутствии релаксанта препарата. Хотя этот подход очень полезен, он требует дорогостоящего оборудования. Кроме того, изометрические сокращения не похожи на спонтанные волнообразные сокращения миометрия, которые естественным образом происходят в нетронутой матке. Уникально, маточные волны миометрия у грызунов могут быть визуализированы как подвижность рога матки, когда весь репродуктивный тракт (яичники, яидуки, матка и влагалище) поддерживается в буферном растворе. Здесь мы представляем метод ex vivo для мониторинга спонтанной подвижности нетронутой мышиной матки, помещенной в чашку Петри, содержащую кислородом буфер Кребса. Мы также описываем алгоритм количественной оценки подвижности с использованием трекера движения MATLAB. Этот новый подход обеспечивает легкую и менее дорогую альтернативу для проверки релаксант потенциал естественных средств правовой защиты и синтетических соединений.

Все процедуры с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Медицинской школе Университета Индианы (Индианаполис, IN). В исследовании использовались 2-5-месячные F2-129S-C57BL/6 сексуально зрелых самок мышей.

ПРЕДЕКТО: Обеспечьте безопасность, надев лабораторное пальто, маску и перчатки при работе с животными и биоопасными материалами.

1. Подготовка решения

1. Подготовка Кребс буфер, который содержит: 130 мм NaCl, 5 мм KCl, 2 мМ CaCl₂, 1,2 мМ₂PO₄, 0,56 мМ MgCl₂, 25 мм NaHCO₃, и 5 мм глюкозы, рН 7,4. Непрерывно окисляйте буфер Кребса смесью сжатых газов, содержащих 5% CO₂ и 95% O₂ при сохранении температуры буфера при температуре 37 градусов по Цельсию с помощью циркулирующей водяной ванны.
2. Подготовка Dulbecco в фосфат-буферный солен (DPBS), который содержит: 2,68 мМ KCl, 1,47 мМ KH₂PO₄, 136,89 мм NaCl, и 8,1 мм Na₂HPO₄, рН 7,4.

2. Подготовка животных

1. Анестезия мышей с использованием ингаляции изофлуран (3%) с очисткой ототходы газа. Обеспечить адекватную анестезию, оценивая рефлексы вывода. Pinch задний нос, чтобы подтвердить никаких движений не вызываются, что свидетельствует о потере рефлекторной реакции. После достижения глубокой анестезии, эвтаназии животное путем обезглавливания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран может вызвать плавное расширение мышц. Таким образом, подготовка репродуктивного тракта должна быть широко промывают и инкубируются в буфере Кребс, по крайней мере 15-30 минут до начала экспериментов ex vivo. Изофлуран может вызвать раздражение и дискомфорт при контакте с кожей, поэтому будьте осторожны.
2. Поместите тело на большой взвешивании лодки выстроились с бумажным полотенцем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Беременные женщины-лаборанты не должны участвовать в экспериментах с изофлураном, поскольку он может уменьшить вес плода, уменьшить околению скелета плода, и увеличить риск спонтанного аборта^8,9. Вдыхание CO₂ может быть использовано в качестве замены для эвтаназии мышей.

3. Определение эструсического цикла Этап

1. С небольшими щипцы, поднимите клитор, чтобы получить доступ к вагинальный остюй и медленно вставьте микропайпет отзыв, содержащий 10 ЗлЛ DPBS во влагалище.
   1. Убедитесь, что наконечник micropipette вставляется через остиу под углом от 10 до 30 ", чтобы избежать прокола стенки влагалища. После вставки жидкость все еще должна быть видна в наконечнике. Если жидкость не видна, кончик был вставлен слишком далеко во влагалище, и парацервикаальной области влагалища, возможно, были перфорированы.
   2. Слегка потяните вниз на мышцы влагалища остюя с кончиком микропипетты, чтобы воздух, чтобы выйти из влагалища.
2. Медленно промыть вагинальной полости, пипетка вверх и вниз 2-3 раза с 10 ЗЛ DPBS и поместите нарисованную подвеску клетки на стеклянную горку.
3. Используйте перевернутый фазовый контрастный микроскоп для определения стадии эструсического цикла с помощью цитологического анализа. Процедура выполняется, как описано в другом месте^10,11. Убедитесь, что суспензия клеток не высохнет до проведения цитологического анализа. При необходимости подвеска может быть разбавлена свежим DPBS.

4. Мышь репродуктивного тракта Ddissection

1. Упорядочить мышь в положении на спине и распространение его конечностей, чтобы разоблачить абдоминопелевич области.
2. Спрей с 70% этанола для увлажнения и дезинфекции области абдоминопеля.
3. Используя щипцы, осторожно поднимите кожу, расположенную выше клитора. Сделайте небольшие поперечные разрезы на боковые аспекты нижней области живота, вплоть до верхних конечностей, чтобы разоблачить брюшной полости(рисунок 1А). Во время этого процесса образуется внешний лоскут. Как небольшие разрезы постоянно делаются, лоскут будет увеличиваться в размерах.
4. Тщательно прорезать брюненее, чтобы разоблачить желудочно-кишечного тракта(Рисунок 1B). Важно отметить, что рога матки часто могут быть расположены непосредственно под перитонеум, так что делать разрезы осторожно и не прикасаться к рогам, как это может повлиять на подвижность матки.
5. Используя щипц, удалите фасцию и жировую ткань, покрывающую желудочно-кишечный тракт. Удалите следующие сегменты желудочно-кишечного тракта из брюшной полости: двенадцатиперстную кише, джеджунум, илеум, секум, восходящую и поперечную толстую кишку(рисунок 1С).
6. Чтобы найти репродуктивные органы, сначала определить мочевого пузыря(рисунок 1С, "4"), которые могут иметь спущенный вид из-за аннулирования после эвтаназии. Влагалище будет прямо под мочевым пузырем.
7. Найдите лобковый симфиза при слиянии лобковых костей (каудально в мочевой пузырь).
8. Используя ножницы, удалить лобковой симфиза, тщательно делая разрезы на боковых сторонах через межпубные фиброкартилагинной ткани, чтобы получить доступ к и обеспечить маршрут для извлечения влагалища (Рисунок 1D).
9. Вырезать через промежности, расположенных между анусом и нижней части вульвы.
10. Используя щипцы, поднимите влагалище и медленно акциз прямой кишки.
11. Определите два рога матки, которые раздвоены в вилку, ростокаль новагин. Найдите запутанный яйц и яичник в конце каждого рога, которые могут быть скрыты под оставшимися сегментами желудочно-кишечного тракта. Используйте небольшие рассекающие ножницы для удаления любых связок, которые соединяются с рогами, яичницами и яичниками в брюшной полости.
12. Удалить репродуктивного тракта, который включает в себя влагалище, матка, яйточки, и яичники, из брюшной полости.
13. Перенесите изолированный репродуктивный тракт(рисунок 1E) в 100 мм чашку Петри, наполненную 10 мл DPBS. Не сжимайте рога матки, чтобы избежать повреждения миометрия.
14. Используйте щипцы и хирургические ножницы, чтобы удалить любые соединительные и жировые ткани, окружающие рога матки и влагалище, а также любой мех в лобковой области, которые могут помешать качеству изображения. Удалить широкую связку, чтобы подвижность рогов матки.
15. Вымойте изолированный репродуктивный тракт свежим DPBS два раза и перенесите его в 35-мм чашку Петри, наполненную 3 мл насыщенного кислородом раствора Кребса.

5. Тканевая визуализация

1. Поместите чашку Петри, содержащую репродуктивный тракт, в кислородизированный буфер Кребса на черной поверхности. Поддерживайте блюдо при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать инфракрасную прокладку для поддержания ткани при 37 градусах Цельсия.
2. Разрешить 15-30 мин для спонтанных сокращений, чтобы начать. Запись спонтанной мотылеки матки в течение 10 минут от осевой плоскости с использованием любого типа цифрового видеооборудования.
3. Перенесите препарат в чашку Петри, содержащую кислородированный буфер Кребса, дополненный испытательным соединением. Запись спонтанной мотылеки матки в течение примерно 10 минут от осевой плоскости с использованием любого типа цифрового видео оборудования.
4. Вымойте весь репродуктивный тракт в 100 мм Петри блюдо с 10 мл DPBS для оценки обратимости лечения.
5. Перенесите препарат в чашку Петри со свеженасыщенным буфером Кребса. Запись спонтанной мотылеки матки в течение примерно 10 минут от осевой плоскости с использованием любого типа цифрового видео оборудования.
6. Перенесите препарат в еще 35-мм чашку Петри, наполненную кислородом кребс-буфером, дополненный транспортным средством для испытательного соединения, чтобы не было механически индуцированных изменений в спонтанной подвижности матки. Это важный контроль.
7. Перенесите видеоматериалы на жесткий диск компьютера.

6. Анализ данных

1. Делайте клипы с использованием любого программного обеспечения для редактирования видео из оригинальных видеоматериалов, содержащих эпизоды управления, лечения и мытья.
2. Используйте программное обеспечение MATLAB и предоставленный скрипт (см. онлайн Дополнительный материал) для количественной оценки спонтанной подвижности матки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнение Computer Vision Toolbox для MATLAB должно быть установлено, чтобы сценарий был полностью функциональным.
   1. Откройте сценарий MATLAB, перейдите на вкладку редактора и нажмите Run.
   2. Выберите первый видеофайл и нажмите Open.
   3. Введите этикетку для видеофайла в всплывающем диалоговом окне и нажмите OK.
   4. Введите временной интервал (ы), необходимый для расчета скорости движения рога (евклидовское расстояние / кс).
   5. Используйте курсор мыши, чтобы выбрать две точки на первом кадре видео. Всплывающее окно попросит подтвердить, что выбранные точки должны использоваться для отслеживания. Нажмите "Начать", чтобы инициировать процесс отслеживания в реальном времени, который будет отображаться в всплывающем окне. Кроме того, нажмите Reselect Points, чтобы пересмотреть эти две точки.
   6. Следите за точностью процесса отслеживания на всплывающем окне.
   7. Обратите внимание на скорость по сравнению с графиком рассеяния времени и расстоянием против участка рассеяния времени в новом всплывающем окне. Сохранить эти две цифры, выбрав файл (ru) Сохранить как в том же окне для документирования данных.
   8. Найдите папку с названием PointTrackerData,автоматически созданную MATLAB, в том же каталоге, где находится сценарий MATLAB. Определите файл Excel под названием label-Data, содержащий точки данных, собранные из видео, в двух отдельных вкладок листа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любое альтернативное программное обеспечение для отслеживания движения может быть использовано для количественной оценки спонтанной подвижности матки.
3. Для выполнения статистического анализа используйте соответствующее программное обеспечение (например, Excel или SigmaPlot 13).

На рисунке 1 показаны репрезентативные изображения, сделанные в течение всей процедуры изоляции репродуктивного тракта, которые описаны в этом протоколе. Чтобы избежать загрязнения буфера мехом, что уменьшит качество видео, мы увлажнили тело мыши 70% этанола. Основным ориентиром для вскрытия раздел протокола является поиск мочевого пузыря. Матка и влагалище будут расположены ниже мочевого пузыря.

Чтобы проверить протокол, мы обработали весь репродуктивный тракт эпинефрином. Эпинефрин, как известно, вызывают мышечной гладкой мышечной релаксации. Этот гормон эндогенно вырабатывается в надпочечнике медулла и служит гормоном стресса у млекопитающих. Мы использовали 1 мкм эпинефрина в наших экспериментах. Это насыщенная концентрация, как известно, вызывают максимальную реакцию12. Была проведена серия из четырех экспериментов. Во всех исследованиях, 1 ММ эпинефрин обратимо ингибируется спонтанно подвижности матки(рисунок 2).

Для количественной оценки спонтанной подвижности репродуктивного тракта мы разработали алгоритм, позволяющий оценить среднюю скорость изменения евклидов между двумя выбранными точками на репродуктивных трактах мыши. Точечные позиции отслеживаются с помощью модуля отслеживания движения программного обеспечения MATLAB. Соответствующий скрипт для MATLAB, который мы использовали для расчета евклидов, содержится в дополнительном материале онлайн. Положение точек имеет решающее значение для успешной процедуры отслеживания движения. Тщательное внимание следует принимать в отношении качества видео, потому что световые отражения от стены чашки Петри может отвлечь движение трекер, и это может остановить отслеживание движения рога при повторном назначении точки на один из света Отражения. Мы решили разместить один из точек в середине рога, чтобы гарантировать, что это было достаточно далеко от отражений стены чашки Петри. Второй момент, как правило, выбран на влагалище, поскольку он не проявляет спонтанной подвижности. На рисунке 3 приведена выборка анализа данных, а на дополнительной диаграмме 1 показаны репрезентативные изображения, полученные во время отслеживания движения.

Рисунок 1 : Шаги всей изоляции репродуктивного тракта. (A) Разрез в коже был сделан и абдоминопелевич области был выставлен выше перитонеума (1). (B) Серозная мембрана была медленно открыта, чтобы разоблачить желудочно-кишечного тракта (2). (C) желудочно-кишечного тракта был перемещен, чтобы разоблачить рога матки (3). Мочевой пузырь (4) может быть визуализирован вблизи соединения рога. (D) рога матки были освобождены и порезы были сделаны на боковых сторонах лобковой симфизии (5), чтобы разоблачить влагалище (6). (E) Удаление изолированного репродуктивного тракта и размещение в раствор DPBS. Любой избыток меха или соединительной ткани был удален. (F) Глубокий отступ можно увидеть на влагалище (справа) после удаления прямой кишки (слева, 7). (G) Окружающая соединительная ткань удаляется. Цифровая камера и программное обеспечение Application Suite (версия 3.7.0) использовались для получения изображений в реальном времени во время вскрытия (настройка камеры: оттенок 20/насыщенность 80). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2 : Показано репрезентативное эксперимент со всем изолированным репродуктивным трактом. Изображения были приняты 15 с отделяется до (A), во время (B), и после (C) применение 1 мкм эпинефрина. Подготовка репродуктивного тракта продемонстрировала высокую подвижность в панелях А и С при отсутствии эпинефрина, но она покоилась в панели B с наличием 1 мкм эпинефрина. Неотредактированные видеоматериалы предоставляются как дополнительные видео 1-3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3 : Анализ данных в эксперименте ex vivo, описанном в Рисунок 2. (A) Показан временной курс скорости изменения расстояния Евклидов. Точки отсчета, между которыми было определено расстояние при спонтанной мотыльке матки, отображаются как зеленые точки в вшивке. Точки были выбраны в проксимальной части влагалища и среднего сегмента рога матки, как показано. Синие заполненные круги показывают значения спонтанной скорости подвижности перед добавлением эпинефрина, красные круги показывают спонтанные скорости подвижности в присутствии 1 м/м эпинефрина, а зеленые заполненные круги показывают спонтанные скорости подвижности после вымывания. (B) Сравнение средних евклидов скорость изменения расстояния (пиксели / с) до добавления эпинефрина (синий бар), в присутствии 1 мкм эпинефрина (красный бар), и после вымывания (зеленый бар). Программное обеспечение MATLAB использовалось для количественной оценки подвижности матки. Интервал t был установлен на уровне 5 s. «Расстояние» рассчитывается как разница между начальной дистанцией кадра и расстоянием кадра 5 s более поздно. Статистический анализ был выполнен с использованием Kruskal-Wallis One Way Анализ дисперсии на рангах следуют все парные процедуры множественного сравнения в соответствии с методом Данна с использованием SigmaPlot 13. Звездочка указывает на набор данных, который значительно отличался от других экспериментальных наборов данных (P q lt;0.001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительный фильм 1: Замедленное видеоклип, показывающий спонтанную мотоутику матки, прежде чем добавить 1 мкм эпинефрина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

Дополнительный фильм 2: Покадровая видеоклип, показывающий спонтанную мотоутику матки, когда буфер Кребса был дополнен 1 эпинефрином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

Дополнительный фильм 3: Замедленное видеоклип, показывающий спонтанную мотоутику матки после вымывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

Дополнительная диаграмма 1: Представитель изображения, сделанные каждые 15 с во время отслеживания движения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительный материал: сценарий алгоритма отслеживания на основе MATLAB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторам нечего раскрывать.