Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метод Ex Vivo для оценки спонтанной подвижности репродуктивных путей мыши и алгоритмотслеживания движения uterus на основе MATLAB для анализа данных

8.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59848

⸱

1 сентября 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1The Department of Anatomy, Cell Biology & Physiology, Indiana University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Сокращения матки имеют важное значение для благополучия женщин. Однако, патологически повышенная контрактильность может привести к дисменорея, особенно у молодых женщин. Здесь мы описываем простой препарат ex vivo, позволяющий быстро оценить эффективность гладких миорелаксантов, которые могут быть использованы для лечения дисменореии.

Аннотация

Dysmenorrhea, или болезненные судороги, является наиболее распространенным симптомом, связанным с менцами у женщин и его тяжесть может препятствовать повседневной жизни женщин. Здесь мы представляем простой и недорогой метод, который будет играть важную роль для тестирования новых препаратов снижения контрактности матки. Этот метод использует уникальную способность всего репродуктивных путей мыши проявлять спонтанную подвижность при поддержании ex vivo в чашке Петри, содержащей кислородом буфер Кребс. Эта спонтанная подвижность напоминает волноподобную миометрийную активность матки человека, называемую эндометрийными волнами. Чтобы продемонстрировать эффективность метода, мы использовали известный релаксант матки, эпинефрин. Мы демонстрируем, что спонтанная подвижность всего репродуктивных путей мыши может быть быстро и обратимо ингибируется 1 мкм эпинефрина в этой модели блюда Петри. Документирование изменений подвижности матки можно легко сделать с помощью обычного смартфона или сложной цифровой камеры. Мы разработали алгоритм на основе MATLAB, позволяющий отслеживать движение для количественной оценки спонтанных изменений подвижности матки путем измерения скорости движений рогов матки. Основным преимуществом этого подхода ex vivo является то, что репродуктивный тракт остается нетронутым на протяжении всего эксперимента, сохраняя все внутренние внутриутробные клеточные взаимодействия. Основным ограничением этого подхода является то, что до 10-20% матки не может проявлять спонтанной подвижности. До сих пор это первый количественный метод ex vivo для оценки спонтанной подвижности матки в модели блюда Петри.

Введение

Как основной женский орган, матка имеет решающее значение для размножения и имеет важное значение для питания плода1. Матка состоит из трех слоев: периметрия, миометрия и эндометрия. Миометрий является основным сократительный слой матки и играет ключевую роль в родах. Эндометрий является самым внутренним слоем, выстилающими полость матки, и необходим для имплантации эмбриона. У небеременных женщин репродуктивного возраста, слой эндометрия сбрасывается ежемесячно в начале менструального цикла. Миометрий помогает в этом процессе пролития путем поддержания спонтанных сокращений миометрия, необходимых для очистки ткани некротической эндометрия из матки1.

К сожалению, повышенная контрактильность миометрии может привести к негативным побочным эффектам, таким как дисменорея, или болезненные менструальные спазмы. Это особенно наблюдается у молодых женщин и nulliparous женщин2. Тем не менее, дисменорея отличается для каждой женщины и зависит от силы их миометрических сокращений; более сильные сокращения часто связаны с ощущением тяжелых судорог3. Миометрия контрактильность может быть визуализирована с помощью УЗИ матки и часто признается как эндометрия волн. Повышенное высвобождение простагландинов во время менструации4 в матке, переживающей эдометрия, как полагают, способствует увеличению гиперконтрактильности миометрии, что приводит к ишемии и гипоксии мышц матки и, таким образом, увеличивается боль3.

Тяжелая дисменорея может препятствовать повседневной деятельности некоторых женщин и от 3 до 33% женщин имеют очень сильную боль, которая может привести к женщине быть прикован к постели в течение 1 до 3 дней каждый менструальный цикл5. Дисменорея является основной причиной гинекологической заболеваемости у женщин репродуктивного возраста независимо от возраста, национальности и экономического положения5. По оценкам, распространенность дисменореи является как высокой, так и переменной, в диапазоне от 45% до 93% у женщин репродуктивного возраста5.  Дисменорея связанных боль оказывает влияние на повседневную жизнь женщин и может привести к плохой успеваемости у подростков, более низкое качество сна, ограничение повседневной деятельности, и изменения настроения5.

Многие женщины, которые испытывают серьезные дисменорея прибегают к внебиржевой лекарства, чтобы облегчить их боль. Такие безрецептурные препараты содержат ингибиторы циклооксигеназы (КОКС),которые предотвращают образование простагландинов 6. Тем не менее, ингибиторы COX связаны с неблагоприятными сердечно-сосудистыми событиями, и около 18% женщин с дисменореей не реагируют на эти ингибиторы7. Таким образом, существует необходимость в новых лекарствах для уменьшения менструальных спазмов. В виду того что над contractility uterus способствует к pathogenesis dysmenorrhea, одной по возможности стратегией может быть польза утробных релаксантов.

Полезно количественно овоздействии потенциальных релаксантов в модели естественных спонтанных миометрийных волнообразных сокращений. Однако, до сих пор, не эффективный метод ex vivo для тестирования мышечно-расслабляющие препараты в нетронутой матки не было описано. В настоящее время изометрические измерения напряжения используются для оценки эффектов релаксантных препаратов. Во время таких измерений мышечная полоса матки поддерживается на постоянной длине при предварительной нагрузке в тканевой ванне, в то время как сила сокращения мышц матки регистрируется до и после стимуляции окситоцина в присутствии или отсутствии релаксанта препарата. Хотя этот подход очень полезен, он требует дорогостоящего оборудования. Кроме того, изометрические сокращения не похожи на спонтанные волнообразные сокращения миометрия, которые естественным образом происходят в нетронутой матке. Уникально, маточные волны миометрия у грызунов могут быть визуализированы как подвижность рога матки, когда весь репродуктивный тракт (яичники, яидуки, матка и влагалище) поддерживается в буферном растворе. Здесь мы представляем метод ex vivo для мониторинга спонтанной подвижности нетронутой мышиной матки, помещенной в чашку Петри, содержащую кислородом буфер Кребса. Мы также описываем алгоритм количественной оценки подвижности с использованием трекера движения MATLAB. Этот новый подход обеспечивает легкую и менее дорогую альтернативу для проверки релаксант потенциал естественных средств правовой защиты и синтетических соединений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Медицинской школе Университета Индианы (Индианаполис, IN). В исследовании использовались 2-5-месячные F2-129S-C57BL/6 сексуально зрелых самок мышей.

ПРЕДЕКТО: Обеспечьте безопасность, надев лабораторное пальто, маску и перчатки при работе с животными и биоопасными материалами.

1. Подготовка решения

  1. Подготовка Кребс буфер, который содержит: 130 мм NaCl, 5 мм KCl, 2 мМ CaCl2, 1,2 мМ2PO4, 0,56 мМ MgCl2, 25 мм NaHCO3, и 5 мм глюкозы, рН 7,4. Непрерывно окисляйте буфер Кребса смесью сжатых газов, содержащих 5% CO2 и 95% O2 при сохранении температуры буфера при температуре 37 градусов по Цельсию с помощью циркулирующей водяной ванны.
  2. Подготовка Dulbecco в фосфат-буферный солен (DPBS), который содержит: 2,68 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 136,89 мм NaCl, и 8,1 мм Na2HPO4, рН 7,4.

2. Подготовка животных

  1. Анестезия мышей с использованием ингаляции изофлуран (3%) с очисткой ототходы газа. Обеспечить адекватную анестезию, оценивая рефлексы вывода. Pinch задний нос, чтобы подтвердить никаких движений не вызываются, что свидетельствует о потере рефлекторной реакции. После достижения глубокой анестезии, эвтаназии животное путем обезглавливания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран может вызвать плавное расширение мышц. Таким образом, подготовка репродуктивного тракта должна быть широко промывают и инкубируются в буфере Кребс, по крайней мере 15-30 минут до начала экспериментов ex vivo. Изофлуран может вызвать раздражение и дискомфорт при контакте с кожей, поэтому будьте осторожны.
  2. Поместите тело на большой взвешивании лодки выстроились с бумажным полотенцем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Беременные женщины-лаборанты не должны участвовать в экспериментах с изофлураном, поскольку он может уменьшить вес плода, уменьшить околению скелета плода, и увеличить риск спонтанного аборта8,9. Вдыхание CO2 может быть использовано в качестве замены для эвтаназии мышей.

3. Определение эструсического цикла Этап

  1. С небольшими щипцы, поднимите клитор, чтобы получить доступ к вагинальный остюй и медленно вставьте микропайпет отзыв, содержащий 10 ЗлЛ DPBS во влагалище.
    1. Убедитесь, что наконечник micropipette вставляется через остиу под углом от 10 до 30 ", чтобы избежать прокола стенки влагалища. После вставки жидкость все еще должна быть видна в наконечнике. Если жидкость не видна, кончик был вставлен слишком далеко во влагалище, и парацервикаальной области влагалища, возможно, были перфорированы.
    2. Слегка потяните вниз на мышцы влагалища остюя с кончиком микропипетты, чтобы воздух, чтобы выйти из влагалища.
  2. Медленно промыть вагинальной полости, пипетка вверх и вниз 2-3 раза с 10 ЗЛ DPBS и поместите нарисованную подвеску клетки на стеклянную горку.
  3. Используйте перевернутый фазовый контрастный микроскоп для определения стадии эструсического цикла с помощью цитологического анализа. Процедура выполняется, как описано в другом месте10,11. Убедитесь, что суспензия клеток не высохнет до проведения цитологического анализа. При необходимости подвеска может быть разбавлена свежим DPBS.

4. Мышь репродуктивного тракта Ddissection

  1. Упорядочить мышь в положении на спине и распространение его конечностей, чтобы разоблачить абдоминопелевич области.
  2. Спрей с 70% этанола для увлажнения и дезинфекции области абдоминопеля.
  3. Используя щипцы, осторожно поднимите кожу, расположенную выше клитора. Сделайте небольшие поперечные разрезы на боковые аспекты нижней области живота, вплоть до верхних конечностей, чтобы разоблачить брюшной полости(рисунок 1А). Во время этого процесса образуется внешний лоскут. Как небольшие разрезы постоянно делаются, лоскут будет увеличиваться в размерах.
  4. Тщательно прорезать брюненее, чтобы разоблачить желудочно-кишечного тракта(Рисунок 1B). Важно отметить, что рога матки часто могут быть расположены непосредственно под перитонеум, так что делать разрезы осторожно и не прикасаться к рогам, как это может повлиять на подвижность матки.
  5. Используя щипц, удалите фасцию и жировую ткань, покрывающую желудочно-кишечный тракт. Удалите следующие сегменты желудочно-кишечного тракта из брюшной полости: двенадцатиперстную кише, джеджунум, илеум, секум, восходящую и поперечную толстую кишку(рисунок 1С).
  6. Чтобы найти репродуктивные органы, сначала определить мочевого пузыря(рисунок 1С, "4"), которые могут иметь спущенный вид из-за аннулирования после эвтаназии. Влагалище будет прямо под мочевым пузырем.
  7. Найдите лобковый симфиза при слиянии лобковых костей (каудально в мочевой пузырь).
  8. Используя ножницы, удалить лобковой симфиза, тщательно делая разрезы на боковых сторонах через межпубные фиброкартилагинной ткани, чтобы получить доступ к и обеспечить маршрут для извлечения влагалища (Рисунок 1D).
  9. Вырезать через промежности, расположенных между анусом и нижней части вульвы.
  10. Используя щипцы, поднимите влагалище и медленно акциз прямой кишки.
  11. Определите два рога матки, которые раздвоены в вилку, ростокаль новагин. Найдите запутанный яйц и яичник в конце каждого рога, которые могут быть скрыты под оставшимися сегментами желудочно-кишечного тракта. Используйте небольшие рассекающие ножницы для удаления любых связок, которые соединяются с рогами, яичницами и яичниками в брюшной полости.
  12. Удалить репродуктивного тракта, который включает в себя влагалище, матка, яйточки, и яичники, из брюшной полости.
  13. Перенесите изолированный репродуктивный тракт(рисунок 1E) в 100 мм чашку Петри, наполненную 10 мл DPBS. Не сжимайте рога матки, чтобы избежать повреждения миометрия.
  14. Используйте щипцы и хирургические ножницы, чтобы удалить любые соединительные и жировые ткани, окружающие рога матки и влагалище, а также любой мех в лобковой области, которые могут помешать качеству изображения. Удалить широкую связку, чтобы подвижность рогов матки.
  15. Вымойте изолированный репродуктивный тракт свежим DPBS два раза и перенесите его в 35-мм чашку Петри, наполненную 3 мл насыщенного кислородом раствора Кребса.

5. Тканевая визуализация

  1. Поместите чашку Петри, содержащую репродуктивный тракт, в кислородизированный буфер Кребса на черной поверхности. Поддерживайте блюдо при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать инфракрасную прокладку для поддержания ткани при 37 градусах Цельсия.
  2. Разрешить 15-30 мин для спонтанных сокращений, чтобы начать. Запись спонтанной мотылеки матки в течение 10 минут от осевой плоскости с использованием любого типа цифрового видеооборудования.
  3. Перенесите препарат в чашку Петри, содержащую кислородированный буфер Кребса, дополненный испытательным соединением. Запись спонтанной мотылеки матки в течение примерно 10 минут от осевой плоскости с использованием любого типа цифрового видео оборудования.
  4. Вымойте весь репродуктивный тракт в 100 мм Петри блюдо с 10 мл DPBS для оценки обратимости лечения.
  5. Перенесите препарат в чашку Петри со свеженасыщенным буфером Кребса. Запись спонтанной мотылеки матки в течение примерно 10 минут от осевой плоскости с использованием любого типа цифрового видео оборудования.
  6. Перенесите препарат в еще 35-мм чашку Петри, наполненную кислородом кребс-буфером, дополненный транспортным средством для испытательного соединения, чтобы не было механически индуцированных изменений в спонтанной подвижности матки. Это важный контроль.
  7. Перенесите видеоматериалы на жесткий диск компьютера.

6. Анализ данных

  1. Делайте клипы с использованием любого программного обеспечения для редактирования видео из оригинальных видеоматериалов, содержащих эпизоды управления, лечения и мытья.
  2. Используйте программное обеспечение MATLAB и предоставленный скрипт (см. онлайн Дополнительный материал) для количественной оценки спонтанной подвижности матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнение Computer Vision Toolbox для MATLAB должно быть установлено, чтобы сценарий был полностью функциональным.
    1. Откройте сценарий MATLAB, перейдите на вкладку редактора и нажмите Run.
    2. Выберите первый видеофайл и нажмите Open.
    3. Введите этикетку для видеофайла в всплывающем диалоговом окне и нажмите OK.
    4. Введите временной интервал (ы), необходимый для расчета скорости движения рога (евклидовское расстояние / кс).
    5. Используйте курсор мыши, чтобы выбрать две точки на первом кадре видео. Всплывающее окно попросит подтвердить, что выбранные точки должны использоваться для отслеживания. Нажмите "Начать", чтобы инициировать процесс отслеживания в реальном времени, который будет отображаться в всплывающем окне. Кроме того, нажмите Reselect Points, чтобы пересмотреть эти две точки.
    6. Следите за точностью процесса отслеживания на всплывающем окне.
    7. Обратите внимание на скорость по сравнению с графиком рассеяния времени и расстоянием против участка рассеяния времени в новом всплывающем окне. Сохранить эти две цифры, выбрав файл (ru) Сохранить как в том же окне для документирования данных.
    8. Найдите папку с названием PointTrackerData,автоматически созданную MATLAB, в том же каталоге, где находится сценарий MATLAB. Определите файл Excel под названием label-Data, содержащий точки данных, собранные из видео, в двух отдельных вкладок листа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любое альтернативное программное обеспечение для отслеживания движения может быть использовано для количественной оценки спонтанной подвижности матки.
  3. Для выполнения статистического анализа используйте соответствующее программное обеспечение (например, Excel или SigmaPlot 13).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 показаны репрезентативные изображения, сделанные в течение всей процедуры изоляции репродуктивного тракта, которые описаны в этом протоколе. Чтобы избежать загрязнения буфера мехом, что уменьшит качество видео, мы увлажнили тело мыши 70% этанола. Основным ориентиром для вскрытия раздел протокола является поиск мочевого пузыря. Матка и влагалище будут расположены ниже мочевого пузыря.

Чтобы проверить протокол, мы обработали весь репродуктивный тракт эп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описали метод оценки спонтанной контрактности всего репродуктивного тракта грызунов, который включает в себя яичники, яидуки, рога матки и влагалище. Мы использовали аналогичный метод, чтобы продемонстрировать релаксант эффект фенилэфрин на спонтанной мотыльки матки13, однако, в прошлом мы были не в состоянии обеспечить количественный анализ данных. В этой работе мы разработали алгоритм количественного анализа данных подвижности с помощью модуля отслеживания движения MATLAB. Это полезный ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана внутренними фондами МЕ. AGO задумал исследование. XC и AGO были вовлечены в разработку описанных экспериментов.  FL и AGO проанализировали и интерпретировали данные. KLL, JOB, FL выполнили все эксперименты ex vivo. FL написал сценарий MATLAB. Рукопись написали KLL, JOB и AGO.  Все авторы прочитали и утвердили окончательный вариант рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Гидрохлорид эпинефринаSigma-Aldrich  E4642 
PBSFisher Sceintific 17-512Q
Этанол 200 PROOFDecon Laboratories2701
NaClSigma-AldrichS7653
ГлюкозаSigma-AldrichG7528
KClSigma-AldrichP9333
CaCl2 · 2H2OSigma-AldrichC5080
2PO4Sigma-AldrichS0751
MgCl2  · 6H2OSigma-AldrichM9272
NaHCO3Sigma-AldrichS6297
Изофлуран, USPPatterson Veterinary07-893-2374
Препарирование Сверхтонкозаостренный прецизионный щипец для осколковFisher Sceintific13-812-42
Изогнутые закаленные тонкие ножницы радужной оболочкиглаза Fine Science Tools14091-09
Диссекционный высокопроизводительный модульный стереомикроскопLeicaMZ6 
Цифровая 5-мегапиксельная цветная камера для микроскопа с активной системой охлажденияLeica  DFC425 C
Стереомастер Микроскоп Волоконно-оптические источники светаFisher Sceintific 12-562-21
Весовая лодкаFisher Sceintific 
Convertors Astound Стандартный хирургический халат Кардинал Здоровье 9515Перчатки маленькие, средние или большие
McKesson Corporation20-1080Маленькие, средние или большие; неопудренные стерильные латексные или нитриловые хирургические перчатки
  Чашка ПетриCorning Falcon351029100 мм
  Чашка ПетриCorning Falcon35300135 мм
95% O2- 5% CO2 газовая смесьPraxair  MM OXCD5-K
Маски с ушной петлейValumax International5430E-PP
DSLR 24,2 МП камераCanonEOS Rebel T6i
MATLAB MathWorksN/Aверсии 2019 или более поздней версии 2019 или более поздней версии
WB30304

Ссылки

  1. Kuijsters, N. P. M., et al. Uterine peristalsis and fertility: current knowledge and future perspectives: a review and meta-analysis. Reproductive BioMedicine Online. 35 (1), 50-71 (2017).
  2. Kural, M., Noor, N. N., Pandit, D., Joshi, T., Patil, A. Menstrual characteristics and prevalence of dysmenorrhea in college going girls. Journal of Family Medicine and Primary Care. 4 (3), 426-431 (2015).
  3. Dehnavi, Z. M., Jafarnejad, F., Kamali, Z. The Effect of aerobic exercise on primary dysmenorrhea: A clinical trial study. Journal of education and health promotion. 7, 3(2018).
  4. Lindner, H. R., et al. Significance of prostaglandins in the regulation of cyclic events in the ovary and uterus. Advances in prostaglandin and thromboxane research. 8, 1371-1390 (1980).
  5. Bernardi, M., Lazzeri, L., Perelli, F., Reis, F. M., Petraglia, F. Dysmenorrhea and related disorders. F1000 research. 6, 1645(2017).
  6. Marjoribanks, J., Ayeleke, R. O., Farquhar, C., Proctor, M. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs for dysmenorrhoea. The Cochrane database of systematic reviews. 7, 001751(2015).
  7. Oladosu, F. A., et al. Abdominal skeletal muscle activity precedes spontaneous menstrual cramping pain in primary dysmenorrhea. American journal of obstetrics and gynecology. 219 (1), 91(2018).
  8. Lawson, C. C., et al. Occupational exposures among nurses and risk of spontaneous abortion. American journal of obstetrics and gynecology. 206 (4), 327-328 (2012).
  9. Mazze, R. I., Wilson, A. I., Rice, S. A., Baden, J. M. Fetal development in mice exposed to isoflurane. Teratology. 32 (3), 339-345 (1985).
  10. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), 35538(2012).
  11. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current protocols in neuroscience. , Appendix 4, Appendix (2009).
  12. Segal, S., Csavoy, A. N., Datta, S. The tocolytic effect of catecholamines in the gravid rat uterus. Anesthesia and analgesia. 87 (4), 864-869 (1998).
  13. Chen, X., et al. Phenylephrine, a common cold remedy active ingredient, suppresses uterine contractions through cAMP signalling. Scientific reports. 8 (1), 11666(2018).
  14. Domino, M., Pawlinski, B., Gajewski, Z. Biomathematical pattern of EMG signal propagation in smooth muscle of the non-pregnant porcine uterus. PLoS One. 12 (3), 0173452(2017).
  15. Crane, L. H., Martin, L. Pace-maker activity in the myometrium of the oestrous rat: in vivo studies using video-laparoscopy. Reproduction, fertility, and development. 3 (5), 519-527 (1991).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

MATLAB
Метод Ex Vivo для оценки спонтанной подвижности репродуктивных путей мыши и алгоритмотслеживания движения uterus на основе MATLAB для анализа данных
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.