Method Article

Прямой ген knock-out аксолотла спинного мозга нейронных стволовых клеток через Электропорации CAS9 Белковые-gRNA комплексов

DOI:

10.3791/59850

⸱

July 9th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, South China Normal University, 2The Research Institute of Molecular Pathology (IMP), Vienna Biocenter (VBC), 3Institute for Brain Research and Rehabilitation (IBRR), South China Normal University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлено здесь протокол для выполнения времени и пространства ограниченного гена нокаут в аксолотль спинного мозга путем введения CAS9-gRNA комплекса в спинной мозг центрального канала с последующим электропорированием.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аксолотль обладает уникальной способностью полностью регенерировать спинной мозг. Это в значительной степени из-за эпендимальных клеток, оставшихся в качестве нервных стволовых клеток (НСК) на протяжении всей жизни, которые распространяются на реформу эпендимальной трубки и дифференцироваться в потерянные нейроны после травмы спинного мозга. Расшифровка, как эти NSCs сохранить плюрипотентность после развития и размножаться на повреждение спинного мозга для реформирования точной структуры до травмы может обеспечить ценную информацию о том, как млекопитающих спинного мозга может регенерировать, а также потенциальные варианты лечения. Выполнение генных нокаутов в конкретных подмножествах НСК в течение ограниченного периода времени позволит изучать молекулярные механизмы, стоящие за этими регенеративными процессами, не будучи сбит с толку эффектами, возмущающимися развитием. Описано здесь метод для выполнения гена нокаут в аксолоттный спинной мозг NSCs с помощью системы CRISPR-Cas9. Путем впрыскивать комплекс CAS9-gRNA в центральный канал спинного мозга последованного за электропорированием, гены цели постучаны вне в NSCs внутри специфически зоны спинного мозга на познаваемое timepoint, позволяющ для молекулярных изучений NSCs спинного мозга во время Регенерации.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Спинной мозг большинства позвоночных не может регенерировать после травмы, что приводит к постоянной инвалидности. Некоторые саламандры, такие как аксолотль, являются заметными исключениями. Аксолотл может полностью регенерировать структурно идентичный спинной мозг и полностью восстановить функцию спинного мозга. Большая часть регенеративной способности аксолотов огорожения обусловлена эпендимальными клетками. Эти клетки выстраивались в линию центрального канала, и в отличие от клеток млекопитающих, аксолотальные эпендимальные клетки остаются в виде нервных стволовых клеток (НСК) после эмбрионального развития. После травмы спинного мозга (например, от ампутации хвоста), эти NSCs размножаться, чтобы вырастить эпендимальной трубки и дифференцировать, чтобы заменить потерянные нейроны1,2,3. Раскрытие того, как аксолотл спинного мозга NSCs остаются плюрипотентными и активировать после травмы может предоставить ценную информацию о разработке новых терапевтических стратегий для пациентов.

В связи с достижениями в CRISPR-Cas9 ген нокаут техники, выполнение нокаутов, чтобы расшифровать функцию гена стало легче и было показано, что широкое применимость в различных видах, в том числе аксолотлы4,5, 6 , 7 (г. , 8. Недавний выпуск полного генома аксолоцла и транскриптома теперь позволяет любой геномный локус быть мишенью и для лучшей оценки вне целевых эффектов9,10,11,12 , 13 Год , 14. Разработаны оптимизированные протоколы для нокаута и стука в аксолотах с использованием системы CRISPR-Cas915. Доставка оборудования CRISPR-Cas9 в виде циноворенного рибонуклеопротеина CAS9 (РНП) оказалась более эффективной, чем использование плазмид Cas9 и gRNA-encoding4. Это, вероятно, из-за RNP быть меньше по размеру, чем плазмидные векторы, его способность создавать ДНК перерывы немедленно, и защита гРНК от деградации РНК. Кроме того, использование RNPs обходит транскрипцию и перевод; Таким образом, он избегает таких вопросов, как прочность промотора и оптимальное использование кодона, когда плазмидные элементы являются производными от различных видов.

Исследования потери функций являются одним из общих подходов к изучению потенциальных функций генов, представляющих интерес. Для того, чтобы изучить функцию генов во время регенерации, нокаут в идеале должны быть выполнены непосредственно перед травмой, чтобы избежать воздействия на развитие. Кроме того, выбивка должна быть ограничена как НСК, так и областью регенерации. Выбив из целевого гена во всех NSCs (в том числе в головном мозге, что имеет место в системах Cre-LoxP), может производить эффекты, не связанные с регенерацией, которые могут сбить с толку интерпретацию результатов. К счастью, структура аксолотового спинного мозга предоставляет уникальную возможность для времени и ограниченного пространства нокаутом в НСК. Большинство спинного мозга NSCs находятся в контакте с центральным каналом и составляют подавляющее большинство клеток в контакте с центральным каналом16,17. Таким образом, инъекция комплекса CAS9-gRNA в центральный канал, за которым следует электропорация, позволяет доставлять в спинной мозг НСК в нужном регионе в определенное время4,18,19. Этот протокол демонстрирует, как это выполняется, что приводит к весьма проникающим нокаутом в целевом спинном мозге NSCs. Последующий анализ затем проводится для изучения влияния на регенерацию и поведение НСК.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных должны проводиться в соответствии с местными и национальными правилами по экспериментам на животных и с одобрения соответствующего институционального совета по обзору.

1. Подготовка смеси CAS9-gRNA RNP

  1. Дизайн и синтез гРНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к другим публикациям для проектирования и синтеза gRNA, в том числе один исключительно в отношении акстолотлов15,20,21,22.
  2. Получить белок CAS9-NLS, готовя в доме или приобретая его на коммерческой основе.
  3. Подготовка смесь CAS9-gRNA путем смешивания 5 мкг белка CAS9-NLS, 4 мкг гРНК, 0,9 л 10x буфера CAS9, и заполнить объем до 10 qL с нуклеазой без H2O. Аликот смеси и хранить при -80 градусов по Цельсию, если не использовать сразу.

2. Подготовка агарозных пластин для электропорации

  1. Приготовьте 200 мл 2% (wt/vol) агарозного раствора в 1x DPBS. Растворите, нагревая раствор в микроволновой печи и вылейте его на 10 см посуды Петри на глубину около 10 мм (достаточно глубоко, чтобы покрыть все животное).
  2. Разрешить пластины затвердеть при комнатной температуре. Храните тарелки при 4 градусах По цельсию, если они не используются немедленно.
  3. Используя хирургические скальпели, вырезать агарозную пластину, чтобы сделать щель для проведения хвост прямо, хорошо для установки в теле животного, и два дополнительных скважин для размещения электродов (Рисунок 1E).
  4. Поместите тарелку на лед и заполните ее до краев ледяной 1x DPBS. Используйте тот же dPBS решение для изготовления пластин для обеспечения последовательной электрической проводимости в настройке.

3. Настройка электропортора

  1. Нареживаните электропоратор. Настройка пульса для того чтобы consist up одного биполярного пульса 70 V, с продолжительностью 5 ms, интервалом 50 ms, и никаком распаде напряжения. Настройка импульса передачи иметь четыре биполярных импульсов 40 В, с продолжительностью 50 мс, интервал 999 мс, и 10% распада напряжения.
  2. Подключите электроды к электропореру и отрегулируйте пинцет на части на 7 мм. Погрузите электроды в стакан DPBS до и между электропорированием.

4. Подготовка и загрузка микроинъекционных стеклянных капилляров

  1. Выполните тест рампы на пылающий / коричневый микропайпот шкив в зависимости от инструкций производителя, чтобы определить тепловую стоимость.
  2. Вытяните инъекционные капилляры с конические концы, используя следующие параметры: тепло - рампа тестное значение, тянуть 100, скорость - 100, время - 100.
  3. Наблюдайте за иглой под стереомикроскопом. Используя тонкие щипцы, разорвать капилляр под углом, так что он имеет наклонный кончик. Перерыв в положении, где он достаточно тонкий, чтобы цель центрального канала, будучи достаточно сильным, чтобы проколоть кожу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точка, в которой диаметр составляет около 20 мкм или около 50% от диаметра спинного мозга является хорошей отправной точкой. Несколько попыток могут быть необходимы для получения оптимального нарушения.
  4. Добавьте раствор Fast Green FCF в смесь RNP в соотношении 1:30 и загрузите около 5 кЛ смеси инъекций в капилляр с наконечником пипетки Microloader.
  5. Установите капилляр на пневматический насос, с наклонной кончик лицом вниз.

5. Настройка пневматического насоса

  1. Наверстрими пневматический насос. Установите трюм до 0,5 фунтов на квадратный дюйм (пси), выбрасывать до 2 пси провести, и продолжительность закрытого.
  2. Испытать капиллярные и пневматические настройки насоса путем погружения капилляра в каплю воды и нажатия педали ноги, чтобы впрыснуть. Убедитесь, что инъекционная смесь выходит в медленном, но устойчивом потоке.
  3. Отрегулируйте давление удержания если смешивание впрыска начинает протекать вне самопроизвольно или вода всасывается вверх по капилляру. Увеличьте давление выброса или сломать больше капилляров, если инъекция смесь выходит слишком медленно. Снижение давления выброса, если инъекция выходит слишком быстро.

6. Инъекция смеси RNP в спинной мозг

  1. Анестезия аксолотлов в 0,03% бензокаин раствор, по крайней мере 10 мин. Проверьте, что животные не реагируют, переворачивая их вверх дном в воде.
  2. Возьмите животное с кольцом щипцы и положите его на кровать из кремния, с левой стороны животного вверх и хвост, указывая вправо. Расположите место инъекции в середине поля зрения стереомикроскопа(рисунок 1А).
  3. Отрегулируйте микроманипулятор так, чтобы капилляр витупил на 60 градусов с правой стороны поля зрения(рисунок 1B).
  4. Определите спинной мозг и центральный канал(рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Спинной мозг трубчатой структуры выше notochord.
  5. Стремясь к центральному каналу, переместите капилляр вперед, чтобы мягко проколоть кожу и мышцу в центральный канал спинного мозга. Ограничьте движение капилляра небольшими шагами, так как спинной мозг находится прямо под хвостовыми мышцами.
  6. Нажмите и удерживайте педаль ноги, чтобы придать смесь в центральный канал. Обратите внимание, распространяется ли смесь RNP вдоль центрального канала в виде синей линии в обоих направлениях, что показывает, что капилляр был правильно расположен(рисунок 1D).
  7. Если этого не происходит, держать педаль ноги нажата при перемещении капилляра немного в и до RNP смесь начинает происходит дюйма Если капилляр засоряется тканью, очистите его, выбрасывая в воду при более высоком давлении.
  8. Отрегулируйте давление выброса так, чтобы это было достаточно, чтобы вызвать RNP смесь распространяться в центральном канале, но не так много, что он взрывает структуру.
  9. Продолжайте удерживать педаль ноги, чтобы инъекционная смесь распространяется дальше вдоль центрального канала, пока не достигнет терминала везикулы в конце спинного мозга и желудочков в головном мозге.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять до 2 минут в зависимости от размера животного. Это может быть необходимо, чтобы увеличить давление через некоторое время, чтобы вызвать RNP смесь войти в желудочки мозга.
  10. Приступить как можно скорее к электропорации после успешной инъекции.

7. Электропорация

  1. Перенесите животное с щипцов кольцами на подготовленную агарозную электропорацию пластины(рисунок 1E) на льду. Поместите хвост внутри щели, чтобы он зажат агарозой(рисунок 1F).
  2. Поместите электроды в колодцы по обе стороны хвоста. Убедитесь, что все животное и электроды покрыты ледяной PBS.
  3. Нажмите на выключатель ноги, чтобы начать электропорацию.
  4. После завершения электропорации верните животное в воду.
  5. При необходимости приступить к введению большего количества животных.
  6. Убедитесь, что электропоранные животные здоровы после анестезии и что нет никакого ущерба, нанесенного хвосту.

8. Оценка эффективности нокаута

  1. Закрепите хвост электропора. Сделайте поперечные сечения хвоста с последующим иммуногистохимическим окрашиванием для оценки эффективности нокаута на уровне белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ампутация хвоста должна быть выполнена после электропорации, отрезанный хвост может быть использован для этой цели. В качестве отрицательного контроля4можно использовать животных с помощью гРНК против Gfp или tyrosinase.
  2. Кроме того, электропоранный спинной мозг может быть извлечен и лисичен для ДНК. Выполните генотипирование ПЦР с последующим секвенированием Sanger или секвенированием следующего поколения для оценки процента отредактированных генетических локутов15.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В результате эффективность редактирования будет недооценивать фактическую эффективность редактирования для NSCs, в связи с включением неэлектропорированных клеток и нейронов, которые не имеют apical контакт с центральным просветом и, таким образом, не будет получать RNP смеси.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инъекции и электропорации комплекса CAS9-gRNA против Sox2 в аксолоттальный спинной мозг центрального канала привело к массовой потере SOX2 иммунореактивности в большинстве спинного мозга NSCs, с гРНК против тиросинезы (Тир) в качестве контроля (Рисунок 2 A).B3-tubulin (окрашенный TUJ1) является маркером для нейронов и не был выражен в NSCs, и SOX2- TUJ1-клетки, окружающие центральный канал, считались клетками, укрывающими удаления Sox2. Количественная оценк...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный протокол позволяет времени и пространства ограниченного гена нокаут в NSCs в аксолотель спинного мозга. Текущий протокол позволяет конкретно таргетинга НСК в определенное время и место с высоким penetrance. Он позволяет избежать потенциальных нежелательных эффектов, происходящих из гена нокаут в NSCs в других регионах, таких как мозг, которые происходят при использовании системы Cre-LoxP. Он также позволяет избежать эффектов развития, происходящих из стойких нокаут, что позволяет изучение функции генов сосредот...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим профессора Элли М. Танаку за ее постоянную и долгосрочную поддержку. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC) Грант (317716), исследования Начиная гранты от южнокитайского университета нормальный (S82111 и 8S0109), и Китай постдокторской науки Фонд Грант (2018M633067).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
АгарозаСигма-ОлдричА9539
БензокаинСигма-ОлдричЕ1501-100Г
Бензокаин 0,03 % (масс./об.)Смешать 500 мл 10&раз; TBS, 500 мл 400% (масс./об.) Holtfreter' s и 30 мл 10% (масс./об.) стокового раствора бензокаина. Заполните объем до 10 л с помощью dH2O. Раствор можно хранить при комнатной температуре до 6 месяцев.
Бензокаин 10 % (масс./об.)Смешайте 50 г бензокаина с 500 мл 100% (об/об.) этанола. Раствор можно хранить при комнатной температуре до 12 месяцев.
Капилляры боросиликатного стекла с наружным диаметром 1,2 мм, внутренним диаметром 0,94 ммStutter Instrument BF120-94-8
CaCl2· 2H2OMerck102382
CAS9 буфер, 10xСмешайте 200 мМ HEPES и 1,5 М KCl в воде без РНКазы. Отрегулируйте pH до 7,5. Фильтр простерилизовать, аликвотировать и хранить при &минус; 20 ° C на срок до 24 месяцев
белок CAS9-NLS   PNA BioCP03
Чашки для клеточных культур, 10смFalcon351029
Dumont #5 - Тонкие щипцыFine Scientific Instruments11254-20
ЭлектропораторNepa Gene NEPA21
BEXГенератор импульсов CUY21EDIT II
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252-5G
Быстрый зеленый раствор FCF, 5xРастворите 12,5 мг порошка Fast Green FCF в 10 мл 1&раз; ПБС.
Пылающий/коричневый пуллер для микропипеток Stutter Instrument -97
«Хольтфретер» S раствор 400% (масс./об.) Растворите 11,125 г MgSO4· 7H2O, 5,36 г CaCl2· 2H2O, 158,4 г NaCl и 2,875 г KCl в 10 л dH2O. Раствор можно хранить при комнатной температуре до 6 месяцев.
KClMerck104936
MgSO4· 7H2O НаконечникидляMerck 105886
MicroloaderEppendorf5242956003
Micromanipulator НарисигэМН-153 
NaClMerck106404
Pneumatic PicoPumpWorld Precision Instruments SYS-PV830
Кольцевые щипцыFine Scientific Instruments11103-09
СтереомикроскопOlympusSZX10 
Трис-основаниеSigma-AldrichT6066
Трис-буферный физиологический раствор, 10xРастворите 24,2 г трис-основания и 90 г NaCl в 990 мл dH2O. Отрегулируйте pH до 8,0, добавив 10 мл 37% (об/об.) HCl. Раствор можно хранить при комнатной температуре до 6 месяцев.
Пинцет с переменным зазором 2 круглых платиновых пластинчатых электрода, диаметр 10 ммNepa Gene 
дозаторов CUY650P10

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
  2. Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
  3. Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
  4. Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002(2016).
  5. Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
  6. Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
  7. Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
  8. Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
  9. Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
  10. Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
  11. Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
  12. Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
  13. Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
  14. Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
  15. Fei, J. -F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
  16. Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
  17. Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).
  18. Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
  19. Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
  20. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  21. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  22. Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260(2015).
  23. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

AxolotlSpine RegenerationNeural Stem CellsGene Knock outElectroporationCAS9 ProteinRibonuclear ProteinGuide RNAMicroscopy TechniqueSpinal Cord Injury TreatmentMolecular MechanismsInjection TechniqueAgarose Preparation