Этот протокол фокусируется на выявлении белков, которые связываются с фосфатами инозитол или фосфоинозитами. Он использует сродство хроматографии с биоинтинилатами инозитол фосфатов или фосфоинозитидов, которые обездвижены через стрептавидин агароз или магнитные бусы. Инозитол фосфат или фосфоинозид связывающие белки идентифицируются западной blotting или масс-спектрометрии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Идентификация фосфата инозитола или фосфонинозидных взаимодействующих белков по хроматографии Affinity в сочетании с Западной погреловой или масс-спектрометрией
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Фосфаты инозитол и фосфоинозиты регулируют несколько клеточных процессов в эукариотах, включая экспрессию генов, торговлю везикулами, трансдукцию сигналов, обмен веществ и развитие. Эти метаболиты выполняют эту регулятивную деятельность путем связывания с белками, тем самым изменяя конформацию белка, каталитическую активность и/или взаимодействия. Метод, описанный здесь, использует сродство хроматографии в сочетании с масс-спектрометрии или западной blotting для выявления белков, которые взаимодействуют с фосфатами инозитол или фосфоинозитидов. Инозитол фосфатов или фосфоинозитидов химически помечены биотин, который затем захватили с помощью стрептавидина сопряжены с агарозили и магнитных бусин. Белки изолированы их сродством связывания с метаболитом, затем eluted и определены масс-спектрометрии или западной blotting. Метод имеет простой рабочий процесс, который является чувствительным, нерадиоактивным, липосомы свободной, и настраиваемый, поддерживая анализ белка и метаболита взаимодействия с точностью. Этот подход может быть использован в без этике или в методах количественной спектрометрии, маркированных аминокислотами, для выявления белково-метаболитных взаимодействий в сложных биологических образцах или с использованием очищенных белков. Этот протокол оптимизирован для анализа белков из trypanosoma brucei,но он может быть адаптирован к родственным простейшие паразиты, дрожжи или млекопитающих клеток.
Введение
Инозитол фосфатов (IPs) и фосфоинозитидов (PIs) играют центральную роль в биологии эукариот через регулирование клеточных процессов, таких как контроль экспрессии генов1,2,3, везикул торговли 4,трансдукция сигнала 5,6,метаболизм7,8,9,и развитие8,10. Регулирующая функция этих метаболитов является результатом их способности взаимодействовать с бе....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Анализ IP- или PI-связывающих белков по хроматографии сродства и западной промойки
- Рост клеток, лиза и хроматография сродства
- Выращивайте клетки T. brucei до середины бревенчатого этапа и контролируйте жизнеспособность и плотность клеток. В общей сложности 5,0 х 107 ячеек достаточно для одного связывающего асссе.
- Для форм кровотока, расти клетки в HMI-9 средств дополнены 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS) на 37 КС и 5% CO2. Держите плотность клеток между 8,0 х 105 до 1,6 х 106 ячеек/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность выше, чем 1,8 х 106 6 ячеек/мл мо....
- Для форм кровотока, расти клетки в HMI-9 средств дополнены 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS) на 37 КС и 5% CO2. Держите плотность клеток между 8,0 х 105 до 1,6 х 106 ячеек/мл.
- Выращивайте клетки T. brucei до середины бревенчатого этапа и контролируйте жизнеспособность и плотность клеток. В общей сложности 5,0 х 107 ячеек достаточно для одного связывающего асссе.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Анализ RAP1 и PI (3,4,5)P3 взаимодействия сродства хроматографии и западной blotting
Этот пример иллюстрирует применение этого метода для анализа связывания ИП RAP1 от T. brucei lysate или рекомбинантным белком T. brucei RAP1. В связывающих анализах использовались личицы форм крови T. brucei, которые выражают гемагглютинин (HA) по метки RAP1. RAP1 является белок, участвующих в транскрипционном контроле варианта поверхности гликопротеина (VSG) генов3
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Идентификация белков, которые связываются с ИС или ИП имеет решающее значение для понимания клеточной функции этих метаболитов. Хроматография сродства в сочетании с западной помоткой или масс-спектрометрией дает возможность определить взаимодействующие белки ИС или ИП и, следовательно, получить представление об их регулятивной функции. ИП или ИП химически помечены (например, Ins(1,4,5)P3 химически связаны с биотином" и перекрестно к бусинкам агарозы через стрептавидин или захваченных стрептавидина магнитные бусы позволяе.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Автору нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery Launch Supplement для исследователей ранней карьеры (DGECR-2019-00081) и Университета Макгилла.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ацетон | Сигма-Олдрич | 650501 | кетон |
| ацетонитрил | Сигма-Олдрич | 271004 | растворителем |
| Бикарбонат аммония | Sigma-Aldrich | A6141 | неорганической соли |
| Avanti J6-MI | Beckman Coulter | Avanti J6-MI | Центрифуга для больших объемов (например, 1л) |
| Центрифуга для ботов | Sigma-Aldrich | B1408 | Бутылки для центрифугирования 1л культуры |
| Контрольные бусины | Эшелон | P-B000-1мл | Аффинный реагент для хроматографии - контроль |
| D-(+)-глюкоза | сигма-олдрич | G8270 | сахар, добавленный в PBS для поддержания жизнеспособности клеток |
| Дитиотреитол (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | восстановитель |
| Dynabeads M-270 стрептавидин | ThermoFisher Scientific | 65305 | Стрептавидиновые шарики для связывания с биотиновыми лигандами |
| ЭДТА без ЭДТА Коктейль ингибиторов протеазы | Roche | 11836170001 | ингибиторы протеазы |
| Электрофорез беговой буфер | Bio-Rad | 1610732 | 25 мМ Трис, 192 мМ глицин, 0,1% SDS, pH 8,3 |
| Falcon 15 мл конические центрифужные пробирки | Corning Life Sciences | 430052 | для центрифугирования культур 10 мл |
| муравьиной кислоты | Sigma-Aldrich | 106526 | кислоты |
| глицина | Sigma-Aldrich | G7126 | Аминокислота |
| HMI-9 среда для клеточной культуры | ThermoFisher Scientific | ME110145P1 | Среда для клеточных культур T. brucei кровотока |
| Imperial Protein Stain | ThermoFisher Scientific | 24615 | Окрашивание Coomassie для обнаружения белка в SDS/PAGE |
| Ins(1,4,5)P3 | Beads Echelon | Q-B0145-1ml | Affinity хроматографический реагент |
| Мгновенно Нежирные Сухой Милк | Томас Научный | C837M64 | Блокирующий реагент для западного блоттинга |
| Йодоацетамид | Сигма-Олдрич | I6125 | Алкилирующий реагент для цистеиновых белков или пептидов |
| Lab Rotator | Thomas Scientific | 1159Z92 | Для связывания анализов |
| LoBind Микроцентрифужные пробирки | ThermoFisher Scientific | 13-698-793 | Пробирки с низким связыванием белка для масс-спектрометрии |
| Nonidet P-40 (Igepal CA-630) | Sigma-Aldrich | 21-3277 | Моющее средство |
| PBS, pH 7,4 | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Физиологический буферный |
| пероксидазный субстрат для хемилюминесценции | ThermoFisher Scientific | 32106 | Субстрат для детекции вестерн-блоттинга белков |
| PhosSTOP Ингибитор фосфатазы Коктейльные таблетки | Рош | 4906845001 | фосфатаза ингибиторы |
| PI(3)P PIP Бусины | Эшелон | P-B003a-1ml | Аффинный реагент для хроматографии |
| PI(3,4)P2 Бусины PIP | Эшелон | P-B034a-1ml | Аффинный реагент для хроматографии |
| PI(3,4,5)P3 diC8 | Echelon | P-3908-1mg | Аффинный реагент для хроматографии |
| PI(3,4,5)P3 PIP Бусины | Эшелон | P-B345a-1ml | Аффинный реагент для хроматографии |
| PI(3,5)P2 PIP Бусины | Эшелон | P-B035a-1ml | Аффинный реагент для хроматографии |
| PI(4)P PIP Бусины | Эшелон | P-B004a-1ml | Аффинный реагент для хроматографии |
| PI(4,5)P2 diC8 | Echelon | P-4508-1mg | Аффинный реагент для хроматографии |
| PI(4,5)P2 Бусины PIP | Эшелон | P-B045a-1ml | Аффинный реагент для хроматографии |
| PI(5)P PIP Бусины | Эшелон | P-B005a-1ml | Аффинный реагент для хроматографии |
| Ponceau S раствор | Sigma-Aldrich | P7170 | Окрашивание белка (0,1% [w/v] в 5% уксусной кислоте) |
| Гексацианоферрат калия(III) | Sigma-Aldrich | 702587 | Соль калия |
| PtdIns PIP Beads | Echelon | P-B001-1ml | Аффинный реагент для хроматографии |
| Мембрана PVDF | Bio-Rad | 1620177 | для вестерн-блоттинга |
| Охлаждаемая центрифуга | Eppendorf | 5910 R | Микроцентрифуга для небольших объемов (например, 1,5 мл) |
| Додецилсульфат натрия | Sigma-Aldrich | 862010 | Моющее средство |
| Тиосульфат натрия | Sigma-Aldrich | 72049 | Chemical |
| Вакуумные концентраторы SpeedVac | ThermoFisher Scientific | SPD120-115 | Концентрация образца (например, для масс-спектрометрии) |
| Колбы T175 для клеточных культур | ThermoFisher Scientific | 159910 | Для выращивания 50 мл T. brucei культуры |
| Трипсин, масс-спектрометрия класса | Promega | V5280 | Трипсин для расщепления белка |
| мочевина | Sigma-Aldrich | U5128 | Денатурирующий реактив |
| Vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | Для смешивания реакций |
| Вестерн блоттинг трансфер буфер | Bio-Rad | 1610734 | 25 мМ Трис, 192 мМ глицин, pH 8,3 с 20% метанола |
| Whatman Бумага 3 мм | Sigma-Aldrich | WHA3030861 | Бумага для переноса Wester |
| 2-меркаптоэтанол (14,2 M) | Bio-Rad | 1610710 | восстановитель |
| 2x Laemmli Буфер для образцов | Bio-Rad | 161-0737 | Белковая загрузка буфера |
| 4– 20% Mini-PROTEAN TGX Сборные протеиновые гели | Bio-Rad | 4561094 | Гель для электрофореза белка |
| 4x Laemmli Буфер для образцов | Bio-Rad | 161-0747 | Буфер для загрузки белка |
Ссылки
- Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
- Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
