Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Детергент-помощь Восстановление рекомбинантных Drosophila Аластин в липосомы для Липид-смешивания анализы

7.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59867

⸱

3 июля 2019 г.

 , 
1Department of BioSciences, Rice University

В этой статье

Краткое содержание

Биологический мембранный синтез катализируется специализированными белками синтеза. Измерение фусогенных свойств белков может быть достигнуто путем липидных анализов смешивания. Мы представляем метод очистки рекомбинантного дрозофила атластина, белка, который опосредует гомотипическое слияние ER, воссоздавая его до предварительно сформированных липосом и тестируя на способность синтеза.

Аннотация

Мембранный синтез является решающим процессом в эукариотической клетке. Специализированные белки необходимы для катализа синтеза. Аластины являются эндоплазмическими белками-резидентами (ER), замешанными в гомотипическом слиянии ER. Мы подробно здесь метод очистки глутатион S-трансферазы (GST) и поли-гистидин помечены Drosophila atlastin двумя раундами сродства хроматографии. Изучение реакции синтеза в пробирке требует очищенных белков синтеза, которые должны быть вставлены в липидный двухслойный. Липосомы являются идеальными модельными мембранами, так как липидный состав и размер могут быть скорректированы. С этой целью мы описываем метод восстановления моющего средства для удаления дрозофилы атластин в предварительно сформированные липосомы. Хотя несколько методов восстановления доступны, восстановление моющих средств удаления имеет ряд преимуществ, которые делают его пригодным для атластинов и других подобных белков. Преимуществом этого метода является высокая урожайность восстановления и правильная ориентация восстановленного белка. Этот метод может быть распространен на другие мембранные белки и для других применений, которые требуют протеолипомы. Кроме того, мы описываем FRET основе липидных смешивания ассси протеолипомы, используемые в качестве измерения мембранного синтеза.

Введение

Мембранный синтез является критическим процессом во многих биологических реакциях. При биологических условиях слияние мембран не является спонтанным и требует специализированных синтеза белков для катализировать такие реакции1. ER гомотипический мембранный синтез опосредования у животных динамина связанных GTPase атластина2. Роль Аластина в гомотипическом синтезе имеет основополагающее значение для трехсторонних узлов в периферийных ER, который представляет собой большую взаимосвязанную сеть труб, которые простираются по всей клетке. Аластины имеют сохраненную морфологию домена, состоящую из большого GTPase, три спирали расслоение среднего домена, гидрофобный якорь мембраны, и короткий цитоплазмический C-терминал хвост3. Исследования в пробирке с рекомбинантным дрозофила атластина показали, что при восстановлении липосомы, он сохраняет свои фузогенные свойства. Другие аластины, в том числе человеческие омологи, не смогли резюмировать синтез в пробирке. Мы описываем здесь методологию для очищения GST и поли-гистидина помечены рекомбинантных Drosophila atlastin, восстановление его липосомы, и отслеживание слияния.

Изучение мембранного синтеза в пробирке представляет собой проблему, как фусогенные белки, как правило, мембраны якорь. Для того, чтобы изучить их, необходимо воссоздать их в модель липидных двухслойных. Большие униламеллярные пузырьки (LUV) являются полезным инструментом для изучения взаимодействия липидных белков. Мы представляем здесь систему, чтобы сделать LUVs различных липидных композиций для восстановления белка и синтеза анализов. Восстановление интегральных белков в LUVs может быть достигнуто с помощью различных методов, включая, органический растворитель опосредоченной реконституции, механические механизмы, или моющее средство при содействии восстановления4. Мы представляем здесь метод для воссоздания Drosophila атластина в предварительно сформированные липосомы путем удаления моющего средства. Преимущества этого метода восстановления включают высокие урожаи восстановления и правильную ориентацию атласина в липидном двухслойном. Кроме того, с помощью этого метода, белок не высушивается или подвергается воздействию органических растворителей, тем самым сохраняя структуру и функцию. Среди его недостатков, наличие моющих средств не может быть идеальным для всех белков и окончательные протеолипосомы могут иметь некоторые включены моющего средства в липидный двуслой. Дальнейший диализ может быть использован для устранения большего количества моющего средства. Тем не менее, диализ может занять много времени и, следовательно, может привести к потере белковой активности.

Оценка синтеза активности атластин может быть определена липидных смешивания анализы, как ранее описано2. Здесь мы разграничив метод измерения атластина опосредованного синтеза через N-(7-нитробенц-2-окса-1,3-диазол-4-ил (NBD)/Лиссамин родамин-B сульфонил (родамин) помечены липидов. Этот ассеид требует слияния доноров (помеченных) протеолипосом и приемотеля (немаркированных) протеолипосом. Освобождение FRET может быть измерено во время реакции как разбавление пары донора-приемника от "помеченных" липосом до "немаркированных" липосом в результате перемешивания липидов во время мембранного синтеза (Рисунок 1)5. Хотя этот показатель служит прокси для мембранного синтеза, он ограничен в различении мембранного синтеза и гемифузии, состояние, в котором смешиваются только внешние листовки. Для решения этой проблемы, альтернативой является внешняя листовка закалки NBD dithionite. Следуя той же методологии, как NBD / родамин липидных анализов, при закалке внешней листовки любой релиз NBD FRET путем слияния будет связано с внутренней листовки смешивания8.

Альтернативные анализы синтеза внутренним ваквистым содержанием смешивания адрес полного слияния только5. Примерами этого являются анализы тербия (Тб)/дипиколининовой кислоты (DPA) и анализы аминонафталенной трисульфонной кислоты (ANTS)/p-xylene bis (pyridinium) бромид (DPX). В Тб/ДПА анализы, пул липосом с инкапсулированным Тб смешиваются и сливается с липосомы с инкапсулированными DPA; при слиянии, флуоресценция увеличивается за счет внутренней передачи энергии от DPA к ТБ в рамках «Tb (DPA)3»3- хелатоэнсивный комплекс6. В отличие от этого, для ANTS / DPX анализы, ANTS флуоресценция угасает DPX7. В то время как эти системы решают проблему внутреннего смешивания содержимого, для удаления неинкапсулированных реагентов требуется более углубленное приготовление липосом, а также непреднамеренное взаимодействие флюорофоров.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Очистка GST-DAtl-His8

  1. Выражение белка и препарат лицизм
    1. Преобразуйте BL21 (DE3) E. coli с конструкцией GST-DAtl-His8 в pGEX4-T32 и выберите на пластине ампициллина.
    2. Выберите один трансформировать и привить 5 мл LB и ампициллин (5 л 100 мг/мл ампициллин) в 14 мл культуры трубки и инкубировать при 25 градусов с тряской при 200 об/мин для 6-8 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за протекающей экспрессии не рекомендуется инкубировать при более высоких температурах. Рост на 25 градусов по Цельсию снижает агрегацию белка в этот период роста.
    3. Прививать 200 мл ЛБ и ампициллин с 1 мл культуры 5 мл и инкубировать ночь (15-18 л) при 25 градусах Цельсия.
    4. На следующее утро, урожай клеток центрифугации (2000 х г в течение 10 минут) и повторно в 5 мл LB.
    5. Прививать 4 l LB и ампициллина и измерять OD600 (0.05-0.15). Инкубировать при 25 градусах Цельсия с встряхиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зарезервируйте некоторые носители, чтобы служить пустым для измерений OD600 перед добавлением бактерий.
    6. Измерьте OD600 каждый час, пока он не достигнет ОД между 0,4-0,5. В этот момент, снизить температуру до 16 градусов по Цельсию.
    7. Побудить с 0,2 мМ IPTG (800 л из 1 M запаса), 10 мин после инкубатордостигает 16 градусов по Цельсию. Инкубировать на ночь (15-18 ч) при 16 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более низкая температура повышает урожайность функционального белка за счет уменьшения агрегации атластина.
    8. На следующее утро, урожай клеток центрифуги на 7500 х г при 4 градусах Цельсия.
    9. Приостанавливай теклетки в 200 мл А200 (25 мМ HEPES (pH 7.4) и 200 мМ KCl).
    10. Центрифуги клетки на 11000 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
    11. Приостановите гранулы в 40 мл ломая буфера (A200 плюс 10% глицерол, 2 мМ 2-mercaptoethanol, 4% Тритон X-100 (TX100), 40mM имидазол, и один EDTA-бесплатный протеазы ингибитор коктейль таблетки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить TX-100 после повторной приостановки, чтобы избежать генерации пузырьков и пены.
    12. Пройдите через иглу 18 G и запустить клетки через ячейку разрушитель три раза на 10000 пси.
    13. Центрифуга экстракт на 125000 х г на 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно растворить гранулы 1:2 (w:v) в 8 M urea и nutate при комнатной температуре на ночь. Мочевина в качестве денатуранта будет медленно растворять любой нерастворимый пеллетный белок для анализа SDS-PAGE. Сохранить 1 Зл для SDS-PAGE и Coomassie анализ пятен.
    14. Фильтр экстракт апробировать через 0,45 мкм целлюлозы нитрата стерильной мембраны фильтр для удаления бактерий и крупных бактериальных мусора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно, сохранить 1 Зл для SDS PAGE и Coomassie анализ пятен.
  2. Очистка белка по хроматографии сродства
    1. Загрузите фильтрованный лисат на обездвиженную металлическую хроматографию сродства (IMAC) колонку с госизменой, заряженную Ni2,предварительно уравновешенный с низким буфером имидазола (A100 плюс 10% глицерол, 2 мМ 2-меркаптоэтанол, 1% TX-100, 40 мМ imidazole) мин при 4 градусах по Цельсию.
    2. Вымойте колонку с 25 мл A100 плюс 10% глицерола, 2 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1% Анапо X-100, 40 мМ имидазол а скорость 1 мл/мин при 4"C. Вылейте белок с линейным градиентом 30 мл имидазола от 40 мМ до 500 мМ и окончательной 5 мл мыть на 500 мМ.
    3. Бассейн вместе пик фракций и инкубировать в течение 1 ч при 4 КС с опухшими GSH-Agarose бусы, ранее опухшие в воде и уравновешенный в A100 с 10% глицерола, 2 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1% Anapoe X-100, и 1 мМ EDTA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ГШ-Агарозе бусы могут быть опухшие в 50 мл воды накануне и инкубировать на ночь при 4 кв С, или для 1 ч на RT. Чтобы удалить воду и уравновешиваете буфер, центрифуга в размахивая ротор ведро на 500 х г в течение 1 мин без тормоза. Аспирируй супернатант с помощью иглы 26 G.
    4. ПеллетG-Agarose бусы центрифугирование в размахивая ротор ведро на 500 х г без тормоза и удалить лизат супернатант устремлением с 26 G иглы.
    5. Перенесите бусины в полипрепную колонку 10 мл и промойте пять раз 5 мл буфера равновесия (A100 с 10% глицерола, 2 мМ 2-меркаптоэтанолом, 0,1% Anapoe X-100 и 1 мМ EDTA) центробежкой на 500 х г.
    6. Выявите белок с 1-1,5 мл окулистого буфера, дополненного 10 мМ уменьшенным глутатионом. Aliquot eluted белок и флэш заморозить в жидком азоте. Белок можно хранить при -80 градусов по Цельсию на неопределенный срок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте pH буфера elution до 7.4.
    7. Количественное содержание белка путем ассировки 9 асссы 9 и оценить чистоту sDS-PAGE и Coomassie окрашивания.

2. Восстановление рекомбинантного аластинанта в липосомы

  1. Производство липосомы методом экструзии 10 Лет
    1. Сделать липидные смеси запасов в хлороформ (10 мМ общей липидов). Необходимые липиды 1-пальмитойл-2-олеойл-глицеро-3-фосфохолин (POPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-фосфо-L-серин (DOPS), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-фосфоэтаноламин-N-(7-нитро-2-1,3-бензоксадиазол-4-yl) (NBD-DPPE), и 1,2- dipalmitoyl-sn-glycero-3-фосфоэтаноламин-N-(лиссамин родамин B сульфонил) (Rh-DPPE). Липосомы-асомы принимаются из POPC: DOPS (коэффициент моляров 85:15) и донорских липосом POPC:DOPS:Rh-PE:NBD-PE (83:15:1,5:1,5 молярного соотношения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как ЛИПидные смеси POPC:DOPS традиционно используются для анализа липидов in vitro, альтернативные липидные композиции могут быть адаптированы для различных экспериментальных целей. POPC:DOPS липосомы очень стабильны и труднее предохранитель, поэтому является очень жесткой системой для синтеза.
    2. Добавьте в липидные смеси 1 кс/мл L-й-дипалмитойл-фосфатидилхолина (холин метил-3H) в липидные смеси для определения концентрации липидов на более поздних шагах путем подсчета жидкой сцинтилляции. Зарезервируйте не менее 8 л этой акции.
    3. Перенос нужного количества липидных смесей в кремневые стеклянные трубки.
    4. Сухие липидные смеси под нежным потоком газа N2 в течение 10 мин до тех пор, пока не будет видно больше хлороформа.
    5. Высушите липидную пленку далее в сушилке, пылесосив в течение 30 минут.
    6. Добавьте достаточное количество aqueous A100 с 10% глицерол, 2 мМ 2-меркаптоэтанол, и 1 мМ EDTA в липидной пленки и вернуть концентрацию до 10 мМ. Приостановите липидную пленку, слегка провисая в течение 15 минут при комнатной температуре. Рекомендуется вихрь, который может вместить кремневые стеклянные трубки рекомендуется.
    7. Заморозить-оттепель гидратированных липидов в жидком азоте в десять раз. После замораживания в жидком азоте, разморозить липосомы, позволяя раствору сидеть при комнатной температуре в течение 30 с, а затем передать в воду для более быстрого оттаивания. Этот цикл замораживания-оттепели сведет к минимуму многоламеллярные пузырьки.
      ПРЕДЕКТО: Трубы могут трескаться, если они содержат объемы больше 0,5 мл, и если они передаются непосредственно образуют жидкий азот в воду.
    8. Передайте липид через поликарбонатные фильтры с размером 100 нм пор 19 раз с помощью мини-экструдера.
    9. Определение общей липидной концентрации липосом путем подсчета сцинтилляции
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые из липидов могут быть оставлены в стеклянных трубках и в мини-экструдере.
      1. Добавьте 4 л липидного бульона и липосом в 3 мл сцинтилляционного коктейля.
      2. Измерьте средние количества в минуту (CPMA) для акций и липосом. И рассчитать концентрацию липосом со следующей формулой:figure-protocol-1
    10. Храните липосомы при 4 градусах По Цельсию в течение недели. Более длительное хранение не рекомендуется, так как липосомы могут агрегироваться со временем, уменьшая эффективность восстановления.
  2. Восстановление моющим средством помогло включение в предварительно сформированные липосомы
    1. Рассчитайте количество буфера, белка, липосомы и дополнительного моющего средства, которое необходимо смешать:
      1. Определите желаемый общий объем. Этот объем состоит из буфера A100 с 10% глицерола, 2 мМ 2-меркаптоэтанол, и 1 мМ EDTA. Объемы менее 250 л не хорошо смешиваются в микроцентрифуговых трубках 0,5 мл.
      2. Рассчитайте объем липосом, необходимых для того, чтобы дать окончательную концентрацию липидов около 1 мМ. Вычесть объем из объема буфера.
      3. Рассчитайте объем белка, необходимого для придав желаемому белку липидное молярное соотношение (обычно 1:400). Уменьшите объем буфера соответственно.
      4. Определите, сколько дополнительного моющего средства должно быть добавлено, чтобы насытить липосомы, направленные на эффективное моющее средство к липидного соотношения (Reff) между 0,64-0,8. Не забудьте рассмотреть моющее средство, которое добавляется с белком. (Reff) определяется figure-protocol-2 уравнением DВсего является общая концентрация моющего средства и Dвода мономерной концентрации моющего средства (0,18 мМ для TX-100 и Anapoe X-100 в присутствии моющего средства)4, 11.
    2. Смешайте растворы в трубке 0,5 мл в следующем порядке: буфер, моющее средство, белок и липосомы. Добавить липосомы быстро и вихрь сразу в течение 5 с, чтобы гомогенизировать смесь.
    3. Инкубировать реакцию в nutator для 1 ч при 4 c.
    4. Сделать 0,2 г/мл неполярного полистирола адсорбент "суспензия" в воде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сделать полистирол Адсорбент шарик "суспензия" в течение предыдущих 1 ч инкубации в шаге 2.2.3.
    5. Взвесить 0,2 г полистирола адсорбент и передать в микроцентрифуг трубку.
    6. Дега бисер, добавив 1 мл метанола в трубку и перемешайте в течение 1 мин. Дегазированные бусы утонут.
    7. Аспирировать метанол и добавить воду в бисер. Пусть бисер смешать с водой в течение 5 минут, а затем аспирить воду. Повторите четыре раза, затем довести полистирол адсорбент "суспен", чтобы 1 мл объема с водой и окончательной концентрации 0,2 г/ мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Бисер должен все равно оседать на дно трубки. Если они этого не сделают, дега снова. Используйте 21 G или выше иглы, чтобы аспирировать метанол и воду из бисера.
    8. Рассчитайте количество полистирола адсорбент овых шариков, необходимых для поглощения всех моющих средств в каждом образце. 1 г полистирола адсорбентовых бусин поглощает 70 мг TX-100. Чтобы рассчитать объем полистирола адсорбентового шарика, необходимого для каждой реакции, разделите общее моющее средство в реакции (шаг 2.2.1.4) на 70 мг, а затем по концентрации шариковой суспензии (0,2 г/мл (шаг 2.2.7).
    9. Передача рассчитанного количества полистирола адсорбент шарикового суспензии на 0,5 мл трубки и аспирировать воду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вырезать конец 20-200 л наконечник для передачи бисера, вихрь трубки незадолго до pipetting для resuspend поселились бусы.
    10. Добавьте образцы в трубку 0,5 мл, содержащую полистирол адсорбент, и инкубируйте образец, пяливый в течение 1 ч при 4 градусах Цельсия.
    11. Повторите дважды оставив старые бусы позади и перенося образец на свежие бусы.
    12. Добавьте образец в четвертую трубку со свежими бусинами и инкубируйте на ночь (15–18 ч) при 4 градусах Цельсия.
  3. Утром удалите образец из полистирола адсорбентовых бусин и гранул нерастворимых белковых агрегатов путем центрифуга в течение 10 мин при 16000 х г при 4 градусах Цельсия.
  4. Восстановить супернатант и определить окончательную концентрацию липидов с помощью жидкого сцинтилляционного подсчета (см. шаг 2.1.9.2). Дополнительно, концентрация белка может быть определена amido черный протеин анализ9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для атластина протеолипосом, ферментативные анализы должны быть выполнены со свежими липосомы. Длительное хранение при температуре 4 градуса Цельсия или замораживание приводит к значительным потерям в активности атласина.

3. Липид Смешивание анализы

  1. Доведите донора и приемного протеолипосом до концентрации 0,15 мм каждый в A100 с 10% глицерола, 2 ММ-меркаптоэтанол, 1 мМ EDTA и 5 мМ MgCl2. Каждая реакция (50 л) должна быть добавлена к колодцу в плоской белой пластине 96, подходящей для флуоресценции. Подготовьте по крайней мере 4 реакции, включая тройной, и отрицательный контроль без GTP.
  2. Поместите тарелку в разогретую тарелку при 37 градусах Цельсия. Измерьте флуоресценцию NBD (возбуждение 460 нм и выброс 535 нм) в течение 5 мин каждый мин.
  3. Индуцировать синтез, добавляя 5 мМ ГТП (5 л 50 мМ GTP).
  4. Измерьте флуоресценцию NBD каждую минуту в течение 1 ч.
  5. Добавьте 5 qL 2.5% w/v n-Dodecyl q-D-maltoside для того чтобы растворить proteoliposomes и измерить максимальную флуоресценцию NBD. Читайте NBD флуоресценции в течение 15 минут каждый мин.

4. Липосомомного плавания на Iohexol Прерывный градиент12

  1. (необязательно) Проанализируйте эффективность восстановления путем плавания анализы13.
  2. Подготовка 80% и 30% ж / V iohexol в A100 с 10% глицерола, 2 мМ 2-меркаптоэтанол, и 1 мМ EDTA. Iohexol не растворяется легко, так что это должно быть подготовлено за день до nutating ночь при 4 градусах Цельсия.
  3. Тщательно смешайте 150 л 80% йохесола с 150 зл и протеолипосом, чтобы довести его до 40% йохексола. Добавьте это к 5 х 41 мм2 Ультра-прозрачая трубка, избегающая пузырьков.
  4. Слой 250 л 30% йохесола запасов медленно в верхней части образца, чтобы сделать средний слой. Избегайте пузырьков и нарушая нижний слой. Поверх среднего слоя медленно добавляйте 50 кЛ A100 с 2 мМ 2-меркаптоэтанолом и 1 мМ EDTA.
  5. Centrifuge градиент атакжем в размахивая ротор ведро на 220000 х г для 4 ч при 4 кв с медленным ускорением и без перерыва.
  6. Урожай слоев градиента и анализа SDS-PAGE и Coomassie пятно, количественная оценка может быть сделано с помощью денситометрии. Восстановленный белок должен плавать в верхнем слое, в то время как белковые и липидные агрегаты будут отложения в нижней или средней части.

5. Анализ ориентации восстановленного белка тромбинным протеолизам

ПРИМЕЧАНИЕ: Аластин конструкции сообщили здесь тромбина вырезать сайт между концом N-терминал АСТГОИна GST тега и начала атластина. Аластин в правильной ориентации будет иметь этот участок разреза доступным для протеазы, в то время как белок в неправильной ориентации будет защищен липидным двухслойным.

  1. Чтобы ассировать атластина протеолипосомной ориентации, зарезервируйте не менее 8 злитрос свежих восстановленных протеолипосом.
  2. Добавьте 8 зЛ протеолипоси и 1 Зл 1 Гулина. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 1 ч.
  3. Утолить протеазу 1 л 5 мг/мл без эдта-ингибитора протеазы и инкубировать в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.
  4. Проанализируйте образец по SDS-PAGE и Coomassie пятна. Пропорция расщепленного и незубного белка может определяться денситометрией.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эффективность восстановления атластин представлена на рисунке 2. Восстановленные протеолипосомы плавали в иохесоловом градиенте. Неинкорпорированный белок был отложен в нижнем слое (B) или в среднем слое (M). Восстановленный белок будет плавать к верхнему слою (T). Образцы градиента были собраны и проанализированы SDS-PAGE и Coomassie окрашивания. Количественная оценка геля денситометрией показывает очень высокую эффективность восстановления с незначительными потерями; 96% от общего белка бы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Методы здесь разграничены эффективный метод очистки, восстановления и измерения термоядерного синтеза активности рекомбинантного аластин. Для обеспечения высоких урожаев функционального атластина необходимо рассмотреть некоторые критические шаги. Выражение атласина должно быть сделано при низких температурах (16 градусов по Цельсию), чтобы избежать агрегации и следует стремиться к окончательной концентрации между 0,4-1,5 мг/мл. Очень разбавленный белок не будет восстановлен оптимально при соотношении белка 1:400 к липида...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим доктора Майкла Стерна и его лабораторию за их понимание и обратную связь по атластинам, связанным с проектами. Эта работа была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук (R01GM101377) и Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (R01NS102676).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10 мл поли-подготовительные хроматографические колонкиBiored731-1550
10 мм x 75 мм Кремневые стеклянные трубкиVWR608225-402
47 мм диаметр, 0,45 мкм; m pore whatman стерильные мембранные фильтрыWhatman7141 104
96 well white plateNUNC437796
Anapoe X-100Anatrace9002-931-1
Клеточный разрушительAvestinAvestin Emulsiflex C3
DOPS (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин (натриевая соль))Avanti840035P-10mgDOPS
ЭДТАРесерч органикс инк.6381-92-6Этилендиаминтетрауксусная кислота
Коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТАRoche11873580001Полный ингибитор протеазы
Sigma AldrichZ373400 Liposofast Базовый экструдер
Система жидкостной хроматографии GE Akta PrimeGE Pharmacia8149-30-0006
Глутатион агарозные шарикиSigma aldrichG4510-50ml
ГлицеринEMDGX0185-5
GTPSigma Aldrich36051-31-7Гуанозин 5' трифосфат натрия соль
гидрат HEPES, бескислотный Omnipur5330
Imidazolefluka5670
Иммобилизованная металлическая аффинная хроматография (IMAC) смоляная колонкаGE Healthcare170408011 мл HiTrap Chelating HP иммобилизованные металлические аффинные хроматографические колонки
IohexolAccurate химико-научная корпорацияAN 7050 BLKAccudenz/Nycodenz
IPTGResearch products international corp.I56000-100.0IPTG, свободный от диоксана
L-глутатион восстановленныйSigma-AldrichG4251-5g
Хлорид магнияFisher7791-18-6
МетанолOmnisolvMX0488-1
NBD-DPPE (1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(7-нитро-2-1,3-бензоксадиазол-4-ил) (соль аммония))Avanti236495NBD-DPPE
н-додецил β-D-мальтозидChem-Impex International21950
Неполярные гранулы адсорбента из полистиролаBioRad152-3920SM2 Биогранулы
Nuclepore track-травленый поликарбонат 19 мм 0,1 m поровая мембранаWhatman800309
центрифуга Optima LE80K Ultra BeckmanCoulter
Фосфатидилхолин, L-α-дипальмитоил [холин метил-3H]ARCART0284титрируемые липиды
Планшетный ридерTECANTECAN infinite M200 планшетный ридер
POPC (1-пальмитоил-2-олеол-глицеро-3-фосфохолин)850457C-25mgPOPC
Хлорид калияMP151944
Rh-DPPE (1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(лиссамин родамин B сульфонил) (аммонийная соль)))Avanti236495Rh-DPPE
Сцинтилляционный коктейльNational DiagnosticsLS-272Ecoscint XR Сцинтилляционный раствор для водных или неводных образцов
Сцинтилляция флаконыBeckman592928Быстроповоротная крышка Mini Poly-Q Флакон
ТромбинSigmaT1063-1kUТромбин из плазмы человека
Triton X-100FisherBP151-500
Ультрапрозрачные центрифужные пробирки 5 мм x 41 ммBeckman344090
Vortex 9 до 13 мм Держатель пробиркиVWR58816-138Вкладыш для вихревых кремневых стеклянных трубок
Фиксатор вихревой вставкиVWR58816-132Фиксатор необходим для держателя вихревой трубки
VortexerVWR2.235074Vortex Genie 2 модель G560
&бета;-меркаптоэтанол молекулярной биологии классаCalbiochem444203

Ссылки

  1. Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. Mechanics of membrane fusion. Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).
  2. Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
  3. McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. GTP-dependent membrane fusion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).
  4. Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
  5. Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
  6. Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).
  7. Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).
  8. Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
  9. Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
  10. MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
  11. Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).
  12. Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
  13. Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
  14. Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
  15. Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407(2016).
  16. Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
  17. Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FRETSDS PAGENBD
Детергент-помощь Восстановление рекомбинантных Drosophila Аластин в липосомы для Липид-смешивания анализы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.