Method Article

Взаимодействие с и Мембрана Пермябилизация митохондрий мозга амилоида Фибрилс

DOI:

10.3791/59883

⸱

September 28th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, 45137-66731, Iran

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь предусмотрен протокол для исследования взаимодействия между родной формой, префибриллярными и зрелыми амилоидными фибриллями различных пептидов и белков с митохондриями, изолированными из различных тканей и различных областей мозга.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растущее количество доказательств указывает на то, что мембранная пермяковая, включая внутренние мембраны, такие как митохондрии, является общей чертой и основным механизмом амилоидной агрегированной токсичности при нейродегенеративных заболеваниях. Однако большинство отчетов, описывающих механизмы нарушения мембран, основаны на фосфолипидных модельных системах, и исследования, непосредственно нацеленные на события, происходящие на уровне биологических мембран, редки. Описана здесь модель для изучения механизмов токсичности амилоидов на мембранном уровне. Для митохондриальной изоляции, градиентная среда плотности используется для получения препаратов с минимальным загрязнением миелина. После подтверждения целостности митохондриальной мембраны, взаимодействие амилоидных фибриллов, возникающих из-за з-синуклеина, бычьего инсулина и куриного яичного белка лизозима (HEWL) с митохондриями мозга крысы, как биологическая модель in vitro, исследуется. Результаты показывают, что лечение митохондрий мозга с фибриллярными сборками может вызвать различные степени проницаемости мембраны и повышения содержания ROS. Это указывает на структурно-зависимые взаимодействия между амилоидными фибрилями и митохондриальной мембраной. Предполагается, что биофизические свойства амилоидных фибрилков и их специфические связывания с митохондриальными мембранами могут служить объяснением некоторых из этих наблюдений.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Амилоидные расстройства, известные как амилоидозы, представляют собой большую группу заболеваний, определяемых появлением нерастворимых белковых отложений в различных тканях и органах1,2. Среди них нейродегенеративные расстройства являются наиболее часто встречаются формы, при которых белковые агрегаты появляются в центральной или периферической нервной системе2. Хотя ряд механизмов были предложены, чтобы участвовать в токсичности амилоидных агрегатов3, растущее количество доказательств указывает на нарушение клеточной мембраны и пермяки в качестве основного механизма амилоидной патологии4, 5. В дополнение к плазменной мембране, внутренние органеллы (т.е. митохондрии) также могут быть затронуты.

Интересно, что новые данные свидетельствуют о том, что митохондриальная дисфункция играет важную роль в патогенеза нейродегенеративных расстройств, в том числе болезни Альцгеймера и Паркинсона6,7. В соответствии с этим вопросом, многочисленные доклады указали связывание и накопление амилоида й-пептида, з-синуклеина, Хантингтина и связанных с ALS мутантов SOD1 белков митохондрии8,9,10, 11. Механизм мембранной пермяки амилоидных агрегатов, как полагают, происходит либо через образование дискретных каналов (пор) и/или через неспецифический моющее средство, как механизм5,12, 13. Следует отметить, что большинство из этих выводов были основаны на докладах с использованием фосфолипидных модельных систем, и исследования, непосредственно ориентированные на события, происходящие в биологических мембранах, редки. Очевидно, что эти искусственные липидные двуслойки не обязательно отражают внутренние свойства биологических мембран, в том числе митохондрий, которые являются неоднородными структурами и состоят из широкого спектра фосфолипидов и белков.

В настоящем исследовании, митохондрии, изолированные от мозга крыс используются в качестве биологической модели in vitro для изучения разрушительных эффектов амилоидных фибриллов, возникающих из-синуклеина (как амилоидогенный белок), инсулин абилоидогенных (в качестве модели пептида, показывающего значительные структурные гомологии с человеческим инсулином, участвующих в инъекционно-локализованных амилоидоз), и курица яичный белок лизозим (HEWL; как общий тип белка для изучения амилоидной агрегации). Взаимодействия и возможное повреждение митохондриальных мембран, индуцированных амилоидными фибриллами, затем исследуются, наблюдая за выбросом митохондриального малиата дегидрогеназы (MDH) (расположен в митохондриальной матрице) и митохондрий реактивного кислорода видов (ROS) повышение.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) медицинских наук Тегеранского университета. Максимальные усилия были предприняты, чтобы свести к минимуму страдания и пагубные последствия для крыс путем заточки гильотины лезвия и применения решительных и быстрых движений лезвия.

1. Гомогенизация мозга и митохондриальная изоляция

ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты для митохондриальной изоляции были подготовлены в соответствии с Sims и Андерсон14.

  1. Подготовка буферов для митохондриальной изоляции
    1. Приготовьте раствор Tris-HCl массой 100 мм: взвесьте 0,605 г Tris-HCl и растворите его примерно в 40 мл деионизированной воды (DW) в стакане. Перенесите раствор в объемную колбу объемом 50 мл и увеличьте конечный объем до 50 мл, добавив DW.
    2. Приготовьте раствор EDTA массой 10 мм: взвесьте 0,202 г ЭДТА и растворите его примерно в 40 мл DW в стакане. Перенесите раствор в объемную колбу объемом 50 мл и увеличьте конечный объем до 50 мл, добавив DW.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оба раствора могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение не менее 4 недель.
    3. Подготовьте раствор запасов Tris-HCl/EDTA/sucrose: добавьте 30 мл 100 мм Tris-HCl и 30 мл 10 мм EDTA в стакане. Взвесить 32,86 г сахарозы и добавить его в стакан, помешивая с магнитным мешалкой. Когда сахароза растворяется, перенесите раствор в объемную колбу объемом 100 мл и увеличьте конечный объем до 100 мл, добавив DW.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение 3 дней.
    4. Подготовьте изоляционный буфер (IB): добавьте 100 мл запасов Tris-HCl/EDTA/sucrose примерно до 150 мл DW. Отрегулируйте рН до 7,4, добавив 0,1 МЛЛ. Увеличьте конечный объем до 300 мл, добавив DW.
    5. Подготовка 15% (v/v) плотность градиента среды с IB, добавив 1,5 мл плотности градиента среднего до 8,5 мл холодного IB.
    6. Приготовьте 10 мг/мл раствора сыворотки крупного рогатого скота (BSA): взвесьте 20 мг безжирной кислоты BSA и растворите его примерно в 1,5 мл DW во флаконе 2 мл. Увеличьте конечный объем до 2 мл, добавив DW и храните его на льду до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Свежеподготовить решения из шагов 1.1.4-1.1.6 в день митохондриальной изоляции и хранить их на льду до использования.
  2. Изоляция крысиного мозга
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обезглавливание и удаление мозга крыс мужского пола (150-200 г) были выполнены в соответствии с Sims и Андерсон14.
    1. Положите стакан 30 мл в ведро со льдом и добавьте 10 мл холодного ИБ в стакан.
    2. Обезглавить крысу с небольшой гильотиной животных и удалить мозг из черепа в течение 1 минуты обезглавливания, чтобы ограничить ухудшение митохондриальных свойств.
    3. Быстро переносите мозг в стакан, содержащий холодный Ib.
  3. Гомогенизация мозга и подготовка митохондрий
    ПРИМЕЧАНИЕ: Митохондриальные фракции были изолированы в соответствии с протоколом, описанным Sims и Anderson14, с некоторыми изменениями, как описано ранее15. Важно работать быстро и держать все на льду на протяжении всей процедуры.
    1. Вымойте ткань 2x с 30 мл IB, перенесите в стакан, содержащий холодный IB, и мелко фарш мозга ножницами.
    2. Добавьте 10 томов предварительно охлажденных IB (около 10 мл IB на мозг крыс).
    3. Перенесите тканевую подвеску на 20 мл холодного гомогенизатора Dounce.
    4. Гомогенизировать части ткани с помощью девяти вверх-вниз ударов с моторизованной пестик.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте смесь на льду примерно 30 с после каждого набора из трех гомогениззационных штрихов, чтобы гарантировать, что гоменат остается холодным.
    5. Перенесите гоменат в предварительно охлажденный 10 мл центрифуги трубки и центрифуги на 1300x г и 4 КК в течение 3 мин.
    6. Тщательно освящите супернатант и перенесите его в предварительно охлажденный 10 мл центрифуги трубки и центрифуги на 21000x г при 4 КК в течение 10 минут.
    7. Откажитесь от супернатанта и resuspend гранулы в холодной 15% плотности градиент среднего раствора (5 мл для каждого мозга), мягко перемешивая смесь с пипеткой.
    8. Центрифуга в роторе с фиксированным углом 30700х г при 4 градусах по Цельсию в течение 5 минут с использованием медленного ускорения (45 с от 0 об/мин до 500 об/мин с последующим нормальным ускорением) и замедлением (без тормозов). Это должно производить две различные полосы материала(рисунок 1A, слева).
    9. Используя пипетку Pasteur, удалите острую полосу материала, накопленного в верхней части градиента, который в основном содержит миелин. Затем удалите градиентный средний раствор плотности, лежащий в основе материала (в полосе 2), насколько это возможно, не теряя ни одной обогащенной митохондриальной фракции в полосе 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Группа 2 содержит как синаптические, так и несинаптические митохондрии.
    10. Добавьте 8 мл ИБ в митохондриальную фракцию, нежно помешивая смесь пипеткой.
    11. Центрифуга при 16700х г при 4 градусах по Цельсию в течение 10 мин и тщательно удалите супернатант, оставляя нижнюю свободу гранул спокойной.
    12. Добавьте 1 мл 10 мг/мл жирных кислот, свободных BSA в центрифугу трубки, нежно перемешивая смесь кончиком пипетки. Увеличьте конечный объем до 5 мл на мозг, добавив IB.
    13. Центрифуга при 6900х г при 4 градусах по Цельсию в течение 10 мин, которая должна производить твердые гранулы(рисунок 1A, справа).
    14. Декант супернатант и осторожно resuspend митохондриальной гранулы в IB, aliquot их в 0,5 мл труб, и хранить в жидком азоте до использования.

2. Определение концентрации белка

ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация белка измеряется методом Lowry et al.16.

  1. Подготовка решений для асссеа Лоури
    1. Подготовка раствора A: весят 0,4 г NaOH и 2 г Na2CO3 и растворяйте в 80 мл DW, затем перенесите раствор на объемную колбу объемом 100 мл и увеличьте объем до 100 мл, добавив DW.
    2. Подготовка раствора B: весят 0,1 г тартрата калия натрия и 0,05 г CuSO4 и растворяйте в 8 мл DW, затем перенесите раствор в объемную колбу объемом 10 мл и увеличивайте объем до 10 мл, добавляя DW.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оба решения A и B могут оставаться стабильными при 4 градусах По Цельсию в течение 6 месяцев.
    3. Подготовка раствора C: Добавьте 0,5 мл раствора фолина к 7,5 мл DW.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте раствор C свежим и держитесь подальше от света до использования.
    4. Подготовьте стандарты BSA с окончательными концентрациями 0, 20, 40, 60, 80, 100 и 120 мкг/мл, объединив 0, 20, 40, 60, 80, 100 и 120 л 1 мг/мл BSA, соответственно, с достаточным количеством DW, чтобы сделать 1000 мл раствора.
  2. Измерение концентрации белка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для большей точности, запустить этот шаг в тройной.
    1. Добавьте 50 qL стандартных растворов и митохондриальный гомегенат к каждому колодцу пластины 96 скважин, а затем добавление 45 злителю раствора А. Затем инкубировать тарелку в течение 10 минут в теплой водяной бане, установленной при 50 градусах Цельсия.
    2. Добавьте 5 зл. раствора B и насигните тарелку в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре (RT).
    3. Добавьте 150 кл.л. раствора С и инкубируют тарелку в течение 10 минут в теплой водяной бане, установленной при 50 градусах Цельсия.
    4. Загрузите пластину в считыватель пластин и запишите значения абсорбции для стандартов и митохондриальной подвески на 650 нм. Затем, используя кривую калибровки, вычислите содержание белка в митохондриях.

3. Определение целостности митохондриальной мембраны

ПРИМЕЧАНИЕ: Целостность митохондриальной мембраны подтверждается путем измерения активности малита дегидрогеназы (MDH) в изолированных митохондриях до и после нарушения мембраны Triton X-100.

  1. Разбавить митохондриальный гомегенат до 1 мг/мл с холодным ИБ и поместить в две трубки 1,5 мл (обычно 195 л митохондрий на трубку).
  2. Добавьте 5 кЛ 20% (v/v) Triton X-100 (разбавленный DW) в одну трубку (в качестве положительного контроля для максимальной активности ферментов) и 5 ЗЛ DW в другую трубку (для контроля), а затем смешивание с мешалкой.
  3. Инкубировать трубки в течение 10 минут в теплой водяной бане, установленной при 30 градусах Цельсия.
  4. Пеллетные митохондрии путем центрифугирования труб в роторе с фиксированным углом при 16 000 х г и 4 кв 15 мин.
  5. Тщательно соберите полученные супернацианты для анализа активности митохондриальных MDH с помощью стандартного спектрофотометрического анализа, описанного в следующем разделе.
  6. Рассчитайте целостность митохондриальной мембраны следующим образом:
    figure-protocol-1

4. Определение активности MDH

ПРИМЕЧАНИЕ: Деятельность MDH была измерена спектрофотометрически, как описано Sottocasa и др.17.

  1. Подготовка решений для асссеа деятельности MDH
    1. Подготовьте раствор Tris-HCl 50 мм (pH 7.5): приготовьте раствор 7,9 мг/мл в DW с помощью Tris-HCl и отрегулируйте рН до 7,5 при 25 градусах Цельсия с 1,0 М.Н. НаОХ.
    2. Приготовьте раствор оксалоацета 50 мМ: приготовьте раствор 6,6 мг/мл с использованием оксалоацетата в Tris-HCl.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение не является стабильным один раз в растворе и должны быть подготовлены непосредственно перед использованием.
    3. Приготовьте раствор 10 мМ и NADH: приготовьте раствор 7,81 мг/мл с помощью решения «NADH» в Tris-HCl.
  2. Определение активности MDH
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные концентрации асссея в реакционной смеси 1,0 мл составляют 50 мм Трис-ХКла, 5 мм оксалатацетата и 0,1 мм з-NADH.
    1. Установите спектрофотометр до 25 градусов по Цельсию и 340 нм. Пепетт 890 l Tris-HCl буфер, 100 л раствора оксалатацета, и 10 зл NADH раствора для пустой cuvette и 880 L Tris-HCl буфер, 100 л раствора оксалатацета, и 10 л раствора NADH в образец cuvette.
    2. Инкубировать кюветы в спектрофотометр е 3-4 мин и ссылку на пустой.
    3. Затем добавьте 10 зЛ митохондриального гомегената (1 мг/мл) в образец кювета, немедленно перемешайте путем инверсии и зафиксируете снижение абсорбции из-за окисления NADH на 340 нм в течение 1 мин.

5. In vitro - синуклеин, инсулин крупного рогатого скота и фибрильное образование HEWL

  1. Препарат протеина
    1. - синуклеин:
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выражение и очищение рекомбинантного s-synuclein осуществляется, как описано Хойер и др.18 с некоторыми изменениями, и чистота-синуклеин подтверждается SDS-PAGE.
      1. Диализ очищенный й-синуклеин в одночасье против фосфатно-буферного солира (PBS).
      2. Определить концентрацию белка с использованием коэффициента вымирания 5600 М-1 см-1 при 275 нм19.
      3. Aliquots белка в 1,5 мл труб и хранить при -80 градусов по Цельсию до использования.
    2. Коровий инсулин и HEWL:
      1. Обеспечить как бык инсулина и HEWL.
      2. Растворите каждый белок в 50 мм глицина буфера (рН 1,6; настроить рН с HCl).
      3. Определить концентрацию инсулина крупного рогатого скота и HEWL с использованием коэффициента вымирания 1,0 и 2,63 для 1,0 мг/мл при 276 нм и 280 нм, соответственно20,21.
  2. Индукция амилоидной фибрилляции
    1. Приготовление растворов для амилоидной фибрилляции:
      1. Приготовьте буфер тиофлавин T (ThT): весьте 0,3 г2PO4 и растворите его в 80 мл DW, отрегулируйте рН до 6,5 и увеличьте объем до 100 мл, добавив DW.
      2. Подготовка ThT бульонный раствор (5 мм): весят 1,6 мг ThT и растворяйте его в 1 мл буфера ThT, пройдите через фильтровальную бумагу 0,22 мкм, и держитесь подальше от света при 4 градусах Цельсия до использования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение 4 недель.
      3. Подготовьте решение ThT (1 мМ): добавьте 200 л стокового раствора ThT (5 мМ) до 800 л буфера ThT.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение может храниться при 4 градусах Цельсия в течение 1 недели.
    2. В пробирке- синуклеидальное формирование фибрилкости:
      1. Добавьте аликвоты (294 л л) белкового раствора (200 мкм) и 6 л раствора ThT (1 мМ) к трубам 1,5 мл с последующим перемешиванием.
      2. Инкубировать трубки в термомиксе при 37 градусах Цельсия при постоянном перемешивании при 800 об/мин в течение 4 дней.
      3. Возьмите аликвоты (10 qL) инкубационных образцов после регулярных промежутков времени и добавьте 490 л буфера ThT, тщательно перемешайте и инкубируют в течение 5 минут на RT.
      4. Установите ширину щелей и эмиссии как 5 нм и 10 нм, соответственно, и измеряйте флуоресценцию ThT путем возбуждения на уровне 440 нм и излучение на уровне 485 нм с помощью спектрофотометра флуоресценции.
    3. В пробирке бычьего инсулина амилоидное фибрильное образование:
      1. Добавьте 637 л белкового раствора (250 мкм) в трубку 1,5 мл. Затем добавьте 13 кл л раствора ThT (1 мМ), после чего помешивая.
      2. Добавьте аликвоты (200 л) белкового раствора (250 мкм), содержащего по 20 мкм ТТ к каждой скважине из четкого дна 96 скважины и запечатайте пластину кристально чистой лентой для уплотнения.
      3. Загрузите пластину в считыватель флуоресценции и инкубировать при 57 градусах Цельсия без возбуждения.
      4. Измерьте флуоресценцию TH с интервалом 30 мин, с возбуждением на уровне 440 нм и выбросом на уровне 485 нм, на 12 ч.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхните пластину в течение 5 с перед каждым измерением.
    4. В пробирке HEWL амилоидное образование фибрилла:
      1. Добавьте аликвоты (200 л) белкового раствора (1 мМ), содержащего по 20 мкм ТТ к каждой скважине из четкого дна 96 скважины и загерметизуйте пластину кристально чистой уплотнительной лентой.
      2. Загрузите пластину в считыватель флуоресценции и инкубировать при 57 градусах Цельсия без возбуждения.
      3. Измерьте флуоресценцию ThT с интервалом 2 ч, с возбуждением на уровне 440 нм и выбросом при 485 нм, в течение 4 дней.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех трех белков, образование амилоидной фибрильной подтверждается атомной микроскопии силы(рисунок 2B).

6. Лечение митохондрий с амилоидными фибрилями, mDH релиз асссее, и ros измерения

  1. Инкубация изолированных митохондрий с амилоидными фибрилями
    1. Включите центрифугу и теплую водяную ванну и установите до 4 градусов по Цельсию и 30 градусов соответственно.
    2. Используя IF, разбавить митохондриальный гомегенат до конечной концентрации 1 мг/мл.
    3. Подготовьте две серии из 1,5 мл трубок, содержащих митохондриальные гомогенаты (одна серия для асссы высвобождения MDH, а другая для измерения митохондриальной ROS).
    4. Добавить aliquots свежих или амилоидных фибрилки из-синуклеина, бычьего инсулина, или HEWL (при конечных концентрациях 5 мкм, 10 мкм, 20 мкм, и 25 мкм; используйте PBS или глицин буфер в качестве контроля) митохондриальный homogenate (окончательный том 200 мкм) (см. Таблица 1, Таблица 1 , Таблица 1 , Таблица 1 , Таблица 1 , Таблица 1 , Таблица 1 , Таблица 1 , Таблица 2 , , и таблица 3), а затем осторожно перемешивания раствора с пипеткой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки выпуска MDH используйте Triton X-100 (при конечной концентрации 0,5% «v/v») в качестве положительного контроля для максимального высвобождения ферментов.
    5. Инкубировать трубки, содержащие митохондриальные суспензии в течение 30 минут в теплой водяной бане, установленной до 30 градусов по Цельсию.
    6. Измерьте митохондриальный выпуск MDH и содержание ROS, изложенные в разделах 6.2 и 6.3.
  2. Митохондриальный MDH релиз асссе
    1. Центрифуга инкубированных митохондриальных гомогений на 16000 х г в течение 15 минут, а затем тщательно собирать в результате супернатанты для ассеации деятельности митохондриальных MDH, как описано в разделе 4.
    2. Рассчитайте выпуск MDH как часть максимального эффекта (Triton X-100) следующим образом:

figure-protocol-2

  1. Измерение митохондриального ROS
    ПРИМЕЧАНИЕ: Содержание митохондриального ROS определяется с окислением чувствительных фторгенных прекурсоров dihydrodichlorcarboxboxyfluorescein диацетат (DCFDA)22.
    1. Подготовьте решения для измерения митохондриального ROS. Подготовьте раствор 50 км DCFDA путем растворения в метаноле (подготовьте свежий) и растворяем растворение в DW растворяем растворение в 200 мМ.
    2. Пипетка 191 л инкубированных митохондриальных гомегената к каждой скважине 96 скважин и добавить 4 злиц из 50 ММ DCFDA (1 ММ конечной концентрации) и 5 qL 200 мМ succinate (5 мМ конечной концентрации).
    3. Инкубировать тарелку в течение 30 минут в теплой водяной бане, установленной при 30 градусах По Цельсию, нежно помешивая.
    4. Загрузите пластину в считыватель флуоресценции и измерьте интенсивность флуоресценции, с возбуждением на уровне 485 нм и выбросом на уровне 530 нм.

7. Статистический анализ

  1. Выполняйте все эксперименты по крайней мере в 2разаили или в 3 раза с тройными анализами и проводим соответствующие статистические тесты. Здесь результаты представлены в виде среднего SD, и для расчета статистической значимости был использован парный t-тестстудента. P-значения менее 0,01 и 0,05 были сочтены статистически значимыми (пч ч. 0; 0,05; зли; 0,01).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол описывает модель для изучения взаимодействия амилоидной фибриль с митохондриями мозга крыскаки в качестве биологической модели in vitro. Для митохондриальной подготовки, 15% (v/v) плотность градиента среды был использован для удаления миелина в качестве основного загрязнения ткани мозга14. Как показано на рисунке 1A, центрифугация на 30700 х г производится две различные полосы материала, миелин (вкачестве основно...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Богатство экспериментальных результатов подтверждает гипотезу о том, что цитотоксичность фибриллярных агрегатов в значительной степени связана с их способностью взаимодействовать и пронизать биологические мембраны4,5. Однако большая часть данных основана на искусственных липидных двуслойных, которые не обязательно отражают внутренние свойства биологических мембран, которые являются неоднородными структурами с широким разнообразием фосфолипидов и белков. Здесь, ис...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Научно-исследовательского совета Института перспективных исследований в области фундаментальных наук (IASBS), Занджан, Иран.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2′,7′-Дихлордигидрофлуоресцеина диацетатSigma35845
Сульфат аммонияMerck1012171000
Black 96-луночная пластинаCorning
Black Clear-bottomed 96-луночная пластинаCorning
Bovine инсулинSigmaI6634
Сыворотка крупного рогатого скота Альбумин (БСА)SigmaA2153
BSA без жирных кислотЦентрифуга Sigma
Кристально прозрачная уплотнительная лентаCorning
CuSO4Sigma451657
Мешок для диализа (отрезанный 2 кДа)SigmaD2272
Potter Elvehjem
EDTA SigmaE9884
Считыватель флуоресцентных пластинBioTek
Флуоресцентный спектрофотометрCary Eclipse VARIAN
FolinMerckF9252
ГлицинSigmaG7126
ГильотинаСделано в Иране
HClMerckH1758
Лизоцим белка куриного яйца (HEWL)SigmaL6876
Na2CO3SigmaS7795
NaH2PO4SigmaS7907
NaOHMerckS8045
ОксалоацетатSigmaO4126
PercollGE Healthcare
Фосфатный буфер физиологический раствор (PBS)SigmaCS0030
PMSFSigmaP7626
Тартрат калиянатрия Sigma217255
Кювета кварцеваяSigma
Спектрофотометраналитический jenaSPEKOL 2000 модель
SuccinateSigmaS2378
СахарозаMerck1076871000
термомиксерEppendorph
Тиофлавин TSigmaT3516
Tris-HClMerck1082191000
Triton X-100SigmaT9284
TryptoneQUELAB
Водяная баняMemmert
Дрожжевой экстрактQUELAB
β-NADHSigmaN8129
A6003 Гомогенизатор Dounce

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Merlini, G., Bellotti, V. Molecular mechanisms of amyloidosis. New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).
  2. Berg, I. Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , Linköping University. Linköping Institute of Technology, Department of Physics, Chemistry and Biology (2010).
  3. Kagan, B. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. Uversky, V. N., Fink, A. L. , Springer US. New York. 223-236 (2006).
  4. Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
  5. Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
  6. Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
  7. Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
  8. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
  9. Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
  10. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
  11. Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
  12. Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. Amyloid peptide channels. The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).
  13. Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291(2002).
  14. Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
  15. Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
  16. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).
  17. Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
  18. Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
  19. Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).
  20. Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
  21. Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).
  22. Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
  23. Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
  24. Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
  25. Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
  26. Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
  27. Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
  28. Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
  29. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
  30. Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
  31. Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
  32. Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
  33. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
  34. Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
  35. Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
  36. Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
  37. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
  38. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
  39. Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
  40. Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Amyloid FibrilsBrain MitochondriaMembrane PermeabilizationMitochondrial IsolationDensity GradientMalate DehydrogenaseROS MeasurementAlpha SynucleinBovine InsulinHen Egg White Lysozyme

Related Articles