Method Article

Опухолевая сфера произвлечения и лечения из первичных опухолевых клеток, изолированных от мыши Rhabdomyosarcomas

DOI:

10.3791/59897

⸱

September 13th, 2019

 , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Development, Aging and Regeneration Program, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Sciences, Division of Female Pelvic Medicine and Reconstructive Surgery, University California San Diego

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает воспроизводимый метод для изоляции мышей рабдомиосаркомы первичных клеток, формирования опухолевой сферы и лечения, и аллотрансплантата трансплантации, начиная с опухолевых культур.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рабдомиосаркома (RMS) является наиболее распространенной саркомой мягких тканей у детей. Хотя значительные усилия позволили выявить общие мутации, связанные с RMS и позволили дискриминации различных подтипов RMS, основные проблемы по-прежнему существуют для разработки новых методов лечения для дальнейшего улучшения прогноза. Хотя определены выражения миогенных маркеров, по-прежнему значительные споры по поводу того, RMS имеет миогенное или немиогенное происхождение, как клетка происхождения по-прежнему плохо понимается. В настоящем исследовании, надежный метод предусмотрен для опухолевого исследования для мыши RMS. Ассеи основан на функциональных свойствах опухолевых клеток и позволяет выявлять редкие популяции в опухоли с опухолевыми функциями. Также описаны процедуры тестирования рекомбинантных белков, интеграция протоколов трансфекции с анализом опухолевой сферы и оценка генов-кандидатов, участвующих в развитии и росте опухоли. Описано далее процедура для аллотрансплантата трансплантации опухолевых сфер в реципиентных мышей для проверки опухолевой функции in vivo. В целом, описанный метод позволяет надежно идентифицировать и тестировать редкие опухолевые популяции RMS, которые могут быть применены к RMS, возникающим в различных контекстах. Наконец, протокол может быть использован в качестве платформы для скрининга лекарственных средств и дальнейшего развития терапии.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рак является неоднородным заболеванием; кроме того, один и тот же тип опухоли может представлять различные генетические мутации у разных пациентов, и в пределах пациента опухоль состоит из нескольких популяций клеток1. Гетерогения представляет собой проблему в выявлении клеток, ответственных за инициацию и распространение рака, но их характеристика имеет важное значение для развития эффективных методов лечения. Понятие опухолевых клеток( размножающихся (TPC), редкая популяция клеток, которые способствуют развитию опухоли, ранее широко рассмотрены2. Несмотря на то, что ТЦ характеризовались несколькими видами рака, выявление маркеров для их надежной изоляции остается проблемой для нескольких типов опухолей3,4,5,6 , 7 (г. , 8 , 9. Таким образом, метод, который не опирается на молекулярные маркеры, а скорее на функциональные свойства TPC (высокое самообновление и способность расти в условиях низкой привязанности), известный как анализ формирования опухолевой сферы, может быть широко применен для идентификация ТЦ от большинства опухолей. Важно отметить, что этот анализ также может быть использован для расширения ТЦ и, таким образом, непосредственно применяется к скринингу рака наркотиков и исследований по устойчивости к раку1,10.

Рабдомиосаркома (RMS) является редкой формой саркомы мягких тканей, наиболее распространенной у маленьких детей11. Althoug RMS может быть гистологически определены путем оценки экспрессии миогенных маркеров, RMS ячейки происхождения не была однозначно характеризуется из-за нескольких подтипов опухоли и высокой неоднородности стимулов развития опухоли. Действительно, недавние исследования вызвали значительную научную дискуссию о том, RMS имеет миогенное или немиогенное происхождение, предполагая, что RMS может вытекать из различных типов клеток в зависимости от контекста12,13, 14 Год , 15 лет , 16 Год , 17. Многочисленные исследования на линиях клетки RMS были выполнены используя ассецию образования tumorsphere для идентификации путей, участвующих в развитии опухоли и характеристики маркеров, связанных с высоко самообновляющимися популяциями 18 лет , 19 лет , 20 , 21.

Однако, несмотря на потенциал формирования опухолевой сферы для выявления RMS-клеток происхождения, надежный метод, который может быть использован на первичных клетках RMS еще не описан. В этом контексте, недавнее исследование от нашей группы использовали оптимизированные опухолевые формирования исследования для идентификации RMS клеток происхождения в мышечной дистрофии Дюшенна (DMD) мыши модели22. Несколько типов предопухолевых клеток, изолированных от мышечных тканей, проверяются на их способность расти в условиях низкой привязанности, что позволяет идентифицировать мышечные стволовые клетки как клетки происхождения для RMS в дистрофических контекстах. Описанный здесь воспроизводимый и надежный протокол для оценки формирования опухоли(рисунок 1),который был успешно использован для идентификации крайне редких популяций клеток, которые отвечают за развитие мыши RMS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Корпус, лечение и жертвоприношение мышей были выполнены в соответствии с утвержденным протоколом IACUC Института медицинского открытия Сэнфорда Бёрнхема.

1. Подготовка реагента

  1. Подготовка 100 мл клеточной изоляции средств: F10 среды дополнены 10% лошади сыворотки (HS).
  2. Приготовьте 50 мл раствора коллагеназа ii типа: растворите 1 г порошка коллагеназа ii типа в 50 мл клеточных изоляционных носителей (обратите внимание на единицы фермента на 1 мл носителя, так как количество единиц меняется в зависимости от лота). Aliquot раствор и хранить в морозильной камере -20 градусов до готовности к использованию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый лот коллагеназы должны быть проверены перед использованием, так как активность фермента может меняться по разным партиям.
  3. Подготовка 10 мл на образец второго раствора пищеварения: клетки изоляции средств с 100 единиц / мл коллагеназа типа II раствора и 2 единиц /мл диспазы II свежевзвешенный. Приготовьтесь непосредственно перед использованием.
  4. Подготовка 500 мл опухолевых клеток средств: DMEM с высоким содержанием глюкозы дополнены 20% FBS и 1% перо / стрептококк.
  5. Подготовка 500 мл буфера FACS: 1x PBS дополнен2,5% v/v нормальной сыворотки коз и 1 мМ EDTA.
  6. Подготовка 500 мл опухолевых носителей: DMEM/F12 дополнен 1% перо / стрептококк. Непосредственно перед использованием, добавить следующие факторы роста: 1% N2 дополнения, 10 нг /мл EGF, и 10 нг /мл-FGF.

2. Изоляция и культура клеток

  1. Подготовьте 10-сантиметровую пластину, содержащую 5 мл клеточных изоляционных носителей (одна пластина на образец опухоли) и поместите ее в инкубатор при 37 градусах Цельсия до готовности к сбору опухолевой ткани.
  2. RMS, как сообщается, спонтанно развиваться в мужских и женских моделей мыши для мышечной дистрофии Дюшенна, таких как B10 mdx мышей в возрасте около 18 месяцев и в B6 mdx/mTR мышей на 9 месяцев22,23. Анестезия мыши, которая развивает сяртовую опухоль RMS с помощью изофруран, и жертвовать животным через вывих шейки матки или в соответствии с руководящими принципами IACUC учреждения. С ножницами, сделать разрез на коже в области, где опухоль локализована, и (с помощью пинцета) вытащить кожу от области интереса. Используя лезвие бритвы, вырезают опухоль от животного.
  3. Взвесьте 500–1000 мг опухолевой ткани и поместите его в тарелку, подготовленную в шаге 2.1(Рисунок 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большее количество ткани негативно влияет на шаги пищеварения и снижение общей урожайности. Если собранная опухоль больше 1000 мг, разделите ее на части и образец случайным образом, пока не будет достигнут желаемый вес. Случайная выборка необходима для оценки неоднородности тканей.
  4. Поместите пластину, содержащую ткани опухоли, в капюшон культуры стерильных клеток и фарш его лезвием бритвы. Опухолевые ткани из RMS неоднородны; таким образом, различные области могут представлять различное сопротивление сокращениям. Убедитесь, что размеры полученных кусочков фарша являются однородными, чтобы обеспечить оптимальное пищеварение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: RMS существует как смеси различных типов тканей (в основном фиброзных, васкуляризированных и жировых тканей), которые могут быть определены в каждой опухоли. К 1) изолировать неоднородную популяцию клеток, точно переопределяя состав исходной опухоли и 2) не смещение процедуры изоляции, выполнять случайную выборку собранной ткани. Клетки из различных областей опухоли должны быть усваиваются и тестироваться параллельно in vitro в анализе, описанном в разделе 3.
  5. Переместите измельченные ткани и средства изоляции клеток в центрифугу мощностью 15 мл, вымойте пластину 4 мл клеточных средств и поместите ее в трубку.
  6. Добавьте 700 единиц/мл раствора коллагеназа, чтобы переварить ткани и инкубировать в трясущейся водяной бане при 37 градусах по Цельсию на 1,5 ч.
  7. После инкубации, спина вниз ткани на 300 х г в течение 5 мин на RT. Аспирировать супернатант, не нарушая гранулы, resuspend гранулы в 10 мл второго раствора пищеварения (диспаз), и инкубировать в тряске водяной бане при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут.
  8. Как только второе пищеварение завершено, pipet вверх и вниз и пройти подвески клетки через 70 мкм нейлоновый фильтр на 50 мл центрифуги трубки. Затем добавьте 10 мл клеточных средств изоляции, чтобы промыть фильтр и разбавить раствор пищеварения, и вращать вниз ткани на 300 х г и RT в течение 5 мин.
  9. Аспирируйте супернатант и resuspend гранулы в 20 мл опухолевых клеток средств. Затем перенесите суспензию клетки в 15-сантиметровую пластину культуры клеток. Поместите клетки в инкубатор на ночь при 37 градусах Цельсия. Эта пластина будет идентифицирована как P0.
  10. На следующий день после изоляции, изменить средства массовой информации. Этот шаг необходим для обеспечения удаления мусора и мертвых клеток, которые могут негативно повлиять на выживание клеток.
  11. Оцените слоечность клеток после изменения носителя, которая колеблется от 30%-60% в зависимости от количества исходного материала и размера ячейки. Оставьте клетки, растущие в инкубаторе, пока они не достигнут 90% выпуклости. Мониторинг ячеек каждый день и изменения средств массовой информации каждые 2 дня. Время, необходимое опухолевым клеткам, варьируется в зависимости от нескольких параметров: агрессивность опухоли, генотип опухоли, возраст мыши, неоднородность ткани.
  12. Для пропуска ячеек сделайте следующее:
    1. Предварительно разогреть раствор отслоения клеток и опухолевые клетки, которые мультики в водяной бане при 37 градусах Цельсия.
    2. Вымойте клетки с 1x стерильной PBS и инкубировать их при 37 кв С в 10 мл теплого раствора отслоения клеток в течение 5-10 мин.
    3. Когда все клетки отделяются от пластины, добавьте 10 мл теплых опухолевых клеток, переместите раствор в 50 мл центрифуги и спираль клетки вниз при 300 х г в течение 5 мин на РТ.
    4. Resuspend клетки в 5-10 мл опухолевых клеток средств массовой информации, в зависимости от размера гранул, и рассчитывать живые клетки с помощью Трипан синий (1:5 разбавления), чтобы исключить мертвых клеток.
    5. Плита 105 клеток в 10 см пластин или 3 х 105 клеток в 15 см пластин. Время удвоения клеток варьируется в зависимости от факторов, описанных в шаге 2.10.

3. Произвобливание опухолевой сферы

  1. Используйте опухолевые клетки при прохождении P1 или P2, чтобы избежать выбора клеток через несколько проходов(рисунок 1B). Чтобы отделить клетки от тарелки, сначала вымойте блюдо 1x PBS, не нарушая клетки, затем накройте их с помощью раствора отслоения клеток (5 мл для 10 см пластины или 10 мл для 15 см пластины) и поместите их в инкубатор в течение 5-10 мин.
  2. Подтвердите, что клетки отделяются, глядя на пластину под ярким полем микроскопа, добавить 1:1 объем опухолевых клеток средств (решение клеточного отслоения: опухолевые клетки сми), место клеточной подвески в центрифуге трубки и спина клеток вниз на 300 х г в течение 5 Мин на RT.
  3. Resuspend клетки в буфере FACS (раздел 3.4) или tumorspheres media (раздел 3.5), в соответствии с методом, используемым для покрытия.
  4. Покрытие клеток через цитометр потока
    1. Resuspend ячеек в буфере FACS (сумма зависит от размера гранул) и вручную подсчитываете живые ячейки с помощью синего исключения Trypan. Убедитесь, что конечная концентрация клеток составляет 107 ячеек/мл (100 л буфера FACS на 106 ячеек). Добавьте 1 Зл фиолетового пятна fx Cycle на 106 клеток, чтобы различать живые клетки из мертвых клеток во время сортировки клеток. Подготовьте неокрашенный контроль, в котором фиолетовое пятно Fx Cycle не добавляется в клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация оптимизирована для эффективного окрашивания и скорости во время сортировки. Более низкая концентрация клеток приведет к более длительному времени сортировки, в то время как более высокая концентрация повлияет на окрашивание.
    2. Используя неокрашенный контроль, установите ворота FACS, отделяющиеся живыми (Fx Cycle Violet- )из мертвых (Fx Cycle Violet)ячеек. Затем используйте флуоресцентную сортировку клеток (с пропуском фильтра 450/50) для разделения и подсчета живых/мертвых клеток и для покрытия нужного количества живых клеток в каждой скважине из 96 хорошо вложенных пластин. Каждый колодец пластины должен быть заполнен 200 Л опухолевых носителей перед началом сортировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что TPCs являются редкой субпопуляции в пределах всей опухоли, оптимизировать протокол путем покрытия 100 клеток / хорошо от мыши RMS наблюдать образование опухолевых сфер в культуре подвески. Номер клетки на скважину должен быть скорректирован для конкретной опухоли испытания.
    3. Поместите клетки в инкубатор до конца эксперимента. Старайтесь не беспокоить пластины, если это необходимо. Для 30-дневного эксперимента каждая скважина должна пополняться средствами массовой информации и соответствующей долей факторов роста каждую неделю (медиа, как правило, испаряются, а факторы роста не эффективны через 1 неделю).
    4. После завершения эксперимента вручную экранируют пластины под ярким полевым микроскопом для выявления опухолевых сфер (см. шаг 3.6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время 30 дней был оптимизирован, чтобы легко обнаружить мышь RMS опухолей размеров, начиная от 50-300 мкм диаметра. Временная точка должна быть скорректирована в зависимости от агрессивности протестированной опухоли и ее пролиферативной скорости.
  5. Покрытие ячеек вручную
    1. Resuspend клетки в опухолевой среде (количество зависит от гранул) и вручную рассчитывать живые клетки с помощью трипан синий (1:10 разбавления). Рассчитайте концентрацию клеток в трубке и пластины надлежащее количество клеток в 96 хорошо низкой пластины крепления. Поместите клетки в инкубатор до конца эксперимента. Старайтесь не беспокоить пластину, если это необходимо для пополнения средств массовой информации и факторов роста, как описано в шаге 3.4.3.
    2. После завершения эксперимента, экран пластин ы вручную под ярким полем микроскоп для выявления опухолевых сфер или с помощью программного обеспечения Celigo, как ранее описано в Kessel et al.24 См. Шаг 3.6 ниже.
  6. Обратите внимание, что в результате этого исследования можно оценить два отдельных считывания: количество и размер сформированных опухолей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда более чем одна клетка покрыта в колодце, либо опухоли или клеточные кластеры могут образовываться(рисунок 1C,третья и четвертая панели). Клеточные кластеры представляют собой небольшие клеточные агрегаты, которые образуюткультуру подвески, которые повышают выживаемость клеток и характеризуются неправильной формой. Опухоли большие и имеют более компактную структуру с сфероидной формой. Они происходят из одной клетки, которая имеет возможность выжить в якорной независимой манере и размножаться с высокой скоростью25. Покрытие клеток через цитометр потока или вручную может быть использовано взаимозаменяемо, в зависимости от возможностей, имеющихся в лаборатории. Кроме того, использование низкоприкреплящих пластин размером, отличающихся от 96 пластин скважин, возможно и зависит от требуемого результата. Действительно, оценка частоты опухолевой сферы должна быть сделана с использованием 96 хорошо низких пластин крепления, в то время как первоначальный скрининг для оценки опухолевого потенциала клеток даст более быстрые и надежные результаты на 6 хорошо низкоприкосновенных пластин.

4. Лечение опухолевой сферы рекомбинантными белками

  1. Повторите шаги 3.1 и 3.2.
  2. При настройке лечения рекомбинантными белками сначала определите наилучшую концентрацию для использования следующего раздела 4.3, или если оптимальная концентрация была ранее определена, перейдите в раздел 4.4.
  3. Определите концентрацию рекомбинантного белка.
    1. Resuspend клетки в опухолевой среде (объем зависит от размера гранул) и вручную рассчитывать живые клетки с помощью Trypan синий исключение. Рассчитайте концентрацию клеток в трубке и пластине 100 000 клеток в 6 хорошо низкой пластине крепления. Плита две скважины на каждую проверенную концентрацию и две скважины для необработанного управления(рисунок 2). Концентрации протеина, которые будут проверены, основаны на поиске литературы.
    2. Лечить каждый колодец клеток подвески с различной концентрацией белка и поместить клетки в инкубатор в течение 48 ч (время, необходимое, чтобы иметь возможность оценить влияние лечения как на жизнеспособность клеток и на выражение вниз по течению целевых генов). Затем оцените следующие параметры:
      1. Выживание клеток: использование ярко-полевого микроскопа, а также сравнение с необработанным управлением, проверка морфологии клеток. Здоровые клетки появляются яркие и отражающие под микроскопом, в то время как чрезмерная гибель клеток вызовет накопление мусора в средствах массовой информации. Для количественного определения смерти клеток, Трипан синий исключение, кристаллно-фиолетовый окрашивания, MTT, или TUNEL асссс может быть использован (в этом случае, добавить один хорошо к первоначальному покрытию).
      2. Влияние рекомбинантных белков на пути вниз по течению: выполнить поиск литературы с помощью PubMed для идентификации нисходящего генов, как известно, пострадавших от испытания белка. Дизайн qRT-PCR праймеры для целевых генов, и выполнить qRT-PCR анализ на РНК изолированы от обработанных клеток(Рисунок 2).
  4. Лечить с рекомбинантным белком.
    1. Resuspend клетки в опухолевой среде (объем зависит от размера гранул) и вручную рассчитывать живые клетки с помощью Trypan синий исключение. Определите общее количество клеток, необходимых для желаемого эксперимента (100 клеток на каждую скважину из 96 хорошо низкой пластины крепления) и разбавьте их в соответствующем томе мультимедиа опухоли. При выполнении более одного лечения, подготовить отдельные клеточные трубки.
    2. Лечить каждую трубку с соответствующей концентрацией рекомбинантного белка и пластины клетки в отдельном колодце 96 хорошо низкой пластины. Лечение будет повторяться на каждом колодце в зависимости от периодов полураспада рекомбинантного белка до 30-дневной конечной точки эксперимента.
    3. В конце эксперимента выполните шаги 3.4.4 и 3.6 для анализа данных.

5. Лечение опухолевой сферы с помощью плазмидов переэкспрессии

  1. Повторите шаги 3.1 и 3.2.
  2. Если настройка лечения на новый тип опухоли, сначала определить лучшую концентрацию плазмида для использования следующих раздел 5.3, или если оптимальная концентрация ДНК была ранее определена, перейти к разделу 5.4.
  3. Определить оптимальную концентрацию плазмида.
    1. Resuspend клетки в средствах клетки тумора (объем зависит на размере гранул) и вручную подсчитывают живые клетки используя исключение Trypan голубое. Плита подсчитанных клеток для достижения спущения от 70%-90% (число клеток сильно зависит в размере клеток и морфологии). GFP-плазмид будет использоваться для проверки эффективности трансфекции после протокола производителя трансфекционного реагента для клеток адептов. Параллельно, также проверить необработанный контроль(Рисунок 3A). Выполните тест эффективности в 24 хорошо пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приверженные клетки используются для повышения эффективности трансфекции, так как трансфекция, выполняемая на клетках подвески, не эффективна и негативно влияет на жизнеспособность клеток.
    2. 48 ч после трансфекции оценить клетки по следующим параметрам:
      1. Выживание клеток: с помощью ярко-поляного микроскопа, сравните количество клеток, присутствующих в каждом колодце, и сравните его с необработанными клетками.
      2. Выражение GFP: подсчитайте процент ячеек, которые являются Положительными GFP по сравнению с общим числом ячеек в каждой скважине(рисунок 3B).
  4. Чрезмерное плазмида лечение
    1. Resuspend клетки в носителях опухолевых клеток (объем зависит от размера гранул) и вручную рассчитывать живые клетки с помощью Трипан синий исключение. Плита 200,000 клеток на скважину из 6 хорошо пластины. Каждая скважина будет использоваться для независимого трансфекционного мероприятия. Каждая скважина будет трансфицироваться с помощью настройки, разработанной для конкретного типа опухоли(рисунок 3A).
    2. 24 ч после трансфекции, мыть каждый хорошо с 1x PBS и инкубировать клетки в теплом растворе отслоения клеток (достаточно, чтобы покрыть хорошо). Поместите пластину в инкубатор на 37 градусов по Цельсию в течение 5-10 мин, в зависимости от факторов, описанных в разделе 2.15.
    3. Когда клетки отделены, подсчитайте клетки, полученные из каждого колодца, независимо, используя исключение Trypan blue. Поместите 100 000 клеток на скважину из 6 хорошо низкой пластины крепления, убедившись, что не смешивать клетки, полученные из различных скважин. Поместите тарелку в инкубатор при 37 градусах Цельсия и оставьте спокойно в течение недели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность этого асссея составляет 7 дней, достаточное время, чтобы образование опухоли, предотвращая слияние опухолевой сферы. Слияние опухолей является явлением, которое становится очевидным, когда 100000 или более клеток покрывают вместе в подвеске в течение 1 недели, что может смещения оценки способности формирования опухоли. В случае, если эксперимент требует более длительного времени инкубации, плотность клеток должна быть скорректирована или полимерные леса, используемые, чтобы избежать слияния опухоли26.
    4. В конце эксперимента выполните шаги 3.5.2 и 3.6 для анализа данных.

6. Подготовка опухолевой сферы для трансплантации аллотрансплантата

  1. Поместите на лед внеклеточный матричные (ECM) растворы (50 л на аллотрансплантат) и соцдем опухолевых клеток (50 л л. на аллотрансплантат).
  2. Опухоли могут быть использованы для аллотрансплантата трансплантации. Соберите все опухоли, полученные из определенного типа клеток или лечения в трубку 15 мл или 50 мл (в зависимости от общего объема носителей)(рисунок 1D). Спин опухоли вниз на 300 х г в течение 5 мин на RT. Удалить супернатант над tumorspheres и мыть их с 10 мл стерильных 1x PBS.
  3. Спин опухоли вниз снова на 300 х г в течение 5 минут на RT, аспирировать 1x PBS, и добавить 500 КЛ до 1 мл раствора клеточного отслоения в верхней части клеточной гранулы, которая начинает процесс диссоциации. Инкубировать опухоли в пищеварительном растворе в тряску водяной бане при 37 градусах Цельсия и проверять прогрессирование пищеварения каждые 10 минут. Чтобы помочь опухолевых сфер диссоциации в одноклеточный раствор, pipette клеток вверх и вниз для механических нарушений. Процесс пищеварения может занять до 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что время инкубации значительно варьируется, когда опухоли являются производными от различных первичных клеток RMS, значительное снижение жизнеспособности клеток в связи со временем пищеварения никогда не наблюдалось.
  4. Когда одноклеточный раствор получен, добавить объем опухолевых клеток средств (1:1, решение отслоения клеток: опухолевые клетки сми) и спина его вниз на 300 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого времени, все шаги должны быть выполнены на льду. После вращения, опухоли не образуют стабильный гранулы, как одноклеточные решения делать. Чтобы не выбить и не выбить опухолевые сферы, используйте 1 мл пипетку и аккуратно аспирируйте жидкость. Перейдите к пипетке с 200 л, когда остается только 1 мл.
  5. Resuspend клетки в холодных опухолевых клеток средств (объем будет зависеть от размера гранул), место клетки на льду и рассчитывать живые клетки с помощью Trypan синий исключение. После определения надлежащего количества клеток для использования для аллотрансплантата, resuspend их в общей сумме 50 зл холодных опухолевых клеток средств. Охладите кончик пипетки в холодных опухолевых клетках. Когда кончик холодный, используйте его, чтобы взять 50 зл eCM раствора и добавить его в трубку, содержащую клетки. Во время этого процесса не снимайте трубки со льда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток, которые можно использовать для трансплантации, должно определяться в соответствии с проверенной опухолью и экспериментальной целью: большее количество пересаженных клеток уменьшит время развития опухоли (20 000 клеток из опухолевых опухолей мыши RMS перерастают в опухоль через 6 недель после инъекции). Чтобы иметь возможность сравнить различные клеточные линии или различные методы лечения, важно начать с того же количества клеток.
  6. Поскольку клетки теперь готовы к трансплантации, поддерживать на льду до инъекции. Поместите ограниченный 0,5 мл инсулина шприц с 29 G иглы на льду, чтобы предотвратить клеточный раствор становится твердым при устремлении.
  7. Включите поток опрокидный прибор до 200 мл/мин кислорода и изофлуранового испарителя до 2,5%. Анестезия 2-месячный мужчина NOD / SCID мыши, поместив его в индукционной камере. Подождите 2–3 мин, пока мышь не заснет и разведение не замедлится. Перед началом процедуры, сначала подтвердить через ногу щепотку, что мышь спит, а затем применить ветеринар мазь на глазах. Бритье правой стороне животного, аспирировать клеточный раствор в предварительно охлажденном шприц, и вводить их подкожно в бритую область. Видимый удар под кожей будет образовываться, если инъекция выполняется правильно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сотовые аллотрансплантаты могут быть выполнены в том же штамммыши, что и пересаженные клетки. Например, если клетки RMS были первоначально изолированы от мыши C57BL/6, аллотрансплантат может быть выполнен у мышей C57BL/6. Если штамм отличается, то иммунодефицитных мышей-реципиентов должны быть использованы, чтобы избежать отторжения. Возраст мышей-реципиентов также может быть скорректирован в зависимости от экспериментальной цели.
  8. Мониторинг мышей для формирования опухоли один раз в неделю.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки идентичности опухоли, полученной от аллотрансплантата трансплантации, следует сравнить с оригинальной опухоли, из которой клетки были изолированы. С этой целью может быть проведен гистологический анализ морфологических особенностей и экспрессии миогенных маркеров, а также более полный РНК.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обнаружение опухолевых сфер
Клеточная изоляция была оптимизирована для получения максимальной неоднородности клеточных популяций, присутствующих в опухолевой ткани. Во-первых, так как изолированные ткани представлены морфологически непохожих областей, для повышения шансов изоляции равномерной редких клеточных популяций, выборка была проведена из нескольких областей опухоли(Рисунок 1A, первая панель слева). Во-вторых, механическая диссоциац...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для изоляции и характеристики ТЦ из опухолевых неоднородных клеточных популяций применялись многочисленные методы: клоногенные анализы опухолей, изоляция FACS и анализ формирования опухолевой сферы. Клоногенный ассеия опухоли была впервые описана в 1971 году, используется для исследования стволовых клеток, и только впоследствии применяется к биологии рака29,30. Этот метод основан на раковых стволовых клеток внутреннее свойство расширить без ограничений в мягких г...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Эллисон Медицинский фонд грант AG-NS-0843-11, и NIH Пилот грант в рамках NCI онкологический центр Поддержка Грант P30CA030199 в А.С.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Реагент для диссоциации аккутазных клетокGibcoA1110501Отсоединяйте адгезивные клетки и диссоциируйте опухолевые сферы
CeligoNexcelomCeligoMicrowell на основе планшета с изображением цитометра для адгезивных и суспензионных клеток
Коллагеназа, Type IILife Technologies17101015фермент для расщепления тканей
Dispase II, протеазаLife Technologies17105041Фермент тканевого расщепления
DMEM высокоглюкозная средаGibco11965092Компонент опухолевых клеток медиа
DMEM/F12 МедиаGibco11320033Компонент тумосферной среды
ЭДТАThermoFisherS312500Компонент буфера
FACS EGF рекомбинантный мышиный белокGibcoPMG8041Компонент тумосферных сред
FACSAria II Проточная цитометрияBD Biosciences650033Сортировщик флуоресцентных активированных клеток
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаOmega ScientificFB-11Компонент опухолевых клеток среды
Флуризо (Изофторнае) АнестетикMWI Vet Supply502017Обезболивающий реагент для животных
FxCycle Violet StainLife TechnologiesF10347Дискриминация живых и мертвых клеток
Goat SerumLife Technologies16210072Компонент буфера FACS
Ham's F10 MediaLife Technologies11550043Компонент буфера FACS
Horse SerumLife Technologies16050114Компонент среды для изоляции клеток
Реагент для трансфекции Lipofectamine 3000ThermoFisherL3000015Реагент
для трансфекцииМатригель мембранный матриксCorningCB40234Обеспечивает поддержку трансплантированных клеток
N-2 Supplemtns (100X)Gibco17502048Компонент тумосферных сред
Неомицин-Полимиксин В Сульфаты-Бацитрацин Цинк Офтальмологическая мазьMWI Vet Supply701008Глаз Мазь
PBSGibco10010023Компонент буфера FACS и используется для промывания клеток
pEGFP-C1Addgene6084-1GFP плазмида
Пенициллин - СтрептомиоцинLife Technologies15140163Компонент тумосферы и опухолевых клеток среды
Рекомбинантный человеческий &бета; FGF-basicPeprotech10018BКомпонент тумосферной среды
Рекомбинантный мышиный Flt-3 Лиганд БелокR& D Systems427-FL-005Рекомбинантный белок
трипановый синийThermoFisher15250061Различать живые и мертвые клетки

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
  2. Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift. Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).
  3. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  4. Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
  5. Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129(2013).
  6. Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
  7. Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
  8. Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
  9. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  10. Lee, C. -H., Yu, C. -C., Wang, B. -Y., Chang, W. -W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
  11. Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
  12. Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
  13. Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
  14. Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
  15. Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
  16. Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
  17. Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
  18. Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
  19. Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
  20. Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
  21. Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
  22. Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
  23. Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
  24. Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
  25. Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
  26. Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
  27. Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
  28. Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
  29. Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).
  30. Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
  31. Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
  32. Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
  33. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  34. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
  35. Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tumorsphere FormationTumor Cell IsolationTissue DigestionCollagenase SolutionLow Attachment PlateTrypan Blue CountingAllograft TransplantationTumorsphere MediaGFP Reporter PlasmidDrug Screening

Related Articles