Анализ тик гемолимфа представляет собой важный источник информации о том, как некоторые возбудители вызывают болезни и как клещей иммунологически реагировать на эту инфекцию. Настоящее исследование демонстрирует, как прививать грибковые пропагаты и собирать гемолимфы из Рипицефалии МикроПлюс самок.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Раскрытие гемолимфы сбор и прививка Metarhizium блапопоры в Рипикцефалия Microplus клещей по направлению к патологии беспозвоночных исследований
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Клещи являются облигатными гематофазных эктопаразитов и Рипикцефалия microplus имеет большое значение в ветеринарной медицине, потому что это вызывает анемию, потеря веса, обесценение кожи животных, а также может выступать в качестве вектора нескольких патогенов. Из-за непомерных затрат на управление этими паразитами, повреждение окружающей среды, вызванное ненадлежащим использованием химических акарицидов, и усиление резистентности к традиционным паразитам, альтернативный контроль клещей, путем использования Энтомопатогенные грибы, например, считается интересным подходом. Тем не менее, несколько исследований показали, как иммунная система клеща действует для борьбы с этими энтомопатогенами. Таким образом, этот протокол демонстрирует два метода, используемых для энтомопатогена инокуляции в наполненный женщин и двух методов, используемых для гемолимфы сбора и гемоцитов сбора. Прививка патогенных микроорганизмов при вставке ноги в клещевого женского тела позволяет оценить биологические параметры самок в отличие от прививки между потертой и капителями, которые часто повреждает орган Генэ. Спинной гемолимфы коллекции дали более высокий объем восстановления, чем сбор через ноги. Некоторые ограничения на галочку гемолимфы сбора и обработки включают i) высокий уровень нарушения гепатоцитов, II) гемолимфы загрязнения с нарушениями мидгут, и III) низкий уровень гемолимфы восстановления. Когда гемолимфа собирается через ногу резки, гемолимфы требуется время, чтобы накопить на ногу открытия, в пользу свертывания процесса. Кроме того, меньшее количество гемоцитов получают в сборе через ногу по сравнению с спинной коллекции, хотя первый метод считается легче выполнять. Понимание иммунного ответа в клещах, опосредованных энтомопатогенными агентами, помогает раскрыть их патогенез и развить новые цели для контроля клещей. Описанные здесь процессы вакцинации требуют очень низких технологических ресурсов и могут быть использованы не только для выявления клещей до патогенных микроорганизмов. Аналогичным образом, сбор клещей гемолимфы может представлять собой первый шаг для многих физиологических исследований.
Введение
Скотин тик, рипицефалия microplus, является гематофазного эктопаразит с огромным негативным воздействием на скот в тропических районах. Этот Тик является вектором патогенных агентов, таких как баезия Bovis, баезия бигемина, и Анаплазма маргинал , что, в сочетании с прямым повреждением гемокормления, может уменьшить производство молока и мяса, вызвать анемию и в конечном итоге смерть. Убытки, вызванные этой эктопаразит были оценены в 3 240 000 000 долларов в год в Бразилии1. Требуются устойчивые методы, а использование энтомопатогенных агентов считается перспективной альтернативой для сокращения использования в качестве аакацидов,2,3,4.
Энтомопатогенные грибы, такие как Metarhizium СПМ, являются естественными врагами членистоногих в том числе клещей, и некоторые изоляты могут быть использованы в качестве биоконтроллеров. Эти патогены активно заражают хост через кутикулы и колонизировать их тела2,5,6. Как инфекция развивается, клеточных и гуморального ответы опосредовано тик иммунной системы. Анализ тик гемолимф сообщается в качестве полезного инструмента для оценки иммунных реакций после сложной с патогенами7,8.
Иммунный ответ членистоногих делится на гуморальный и клеточных реакций. Гуморальный ответ включает процессы гемагглютинации и выработку противомикробных белков/пептидов, в то время как клеточный иммунный ответ выполняется через гемоциты. Эти клетки присутствуют в гемолимфы от всех членистоногих и, как сообщается, развивать выразительную роль в исследованиях с участием врожденного иммунного ответа9, как это непосредственно связано с фагоцитоз и инкапсуляции процессов. Соответственно, исследования гемоцитов могут помочь исследовать путь смерти и понять процессы, такие как аутофагия, апоптоз и некроза. В некоторых беспозвоночных, как двустворчатые, геоцитов ' коллекция сталкивается с ограничениями, как разрушение клеток, низкий уровень гемолимфы получены, и низкая концентрация восстановленные клетки10. Очень часто, в зависимости от применяемых методик, получается уменьшенная концентрация клеток, воздействуя непосредственно на квантификация и анализ клеток.
Количество гематоцитов, циркулирующих в гемолимфы является переменной среди различных членистоногих и это может измениться в том же виде из-за различных физиологических этапов, таких как пол, возраст, и членистоногих стадии развития11. Гемоциты также могут быть найдены привязаны к некоторым органам и быть освобождены в обращение сразу после процесса заражения11. Тем не менее, большинство исследований сообщили использования насекомых, в то время как клещи остаются менее изучены в отношении их физиологии и патологии. Несмотря на прививку патогена и гемолимфы сбора в клещах менее используемые методы, установление стандартных методов помогает развитию более точных исследований.
Цель настоящего исследования заключалась в том, чтобы сравнить наиболее используемые методы для получения гемолимфы и инокуляции патогенов в R. microplus клещей, оценивая эффективность в приобретении гемолимфы и концентрации гемоцитов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Клещи, используемые в настоящем исследовании, были получены из искусственных колоний, манавешенных в федеральном сельском университете Рио-де-Жанейро, какие методы были одобрены Комитетом по этике для использования позвоночных животных (ЦЕУА-IV/UFRРЖ #037/2014).
1. Тик нагруженный женщин
- После тик сбора, мыть наполненный женщин, использующих водопроводную воду и погрузить их в 0,5% (v/v) раствор гипохлорита натрия для 3 мин в 500 мл стеклянный стакан получателя, кутикулы гигиены (рис. 1), то сухие все женщины с использованием стерильных бумажных полотенец (Рисунок 2).
- Разделите самок в однородных взвешенных группах (по 20 самок каждая): одна группа без какого-либо лечения, одна контрольная группа, прививка с 5 мкл 0,1% полйоксесилене сорбитской моноолеатной раствор (v/v), и одна инфицированная группа с 5 мкл при 1,0 x 10 7 блапопоры мл-1.
Примечание: только необработанные клещи были использованы для объема и концентрации гемоцитов. Было выполнено три реплицирует каждой группы.
2. патогены прививка между потертом и капитулум
Примечание: в настоящем исследовании в качестве примера использовались Энтомопатогенные грибковые суспензии.
- Приостановить грибковые блапопоры в 1 мл 0,1% полйоксесилене сорбитской моноолеат раствора (v/v) и приспособиться к окончательной концентрации 1,0 х 107 Блапопоры мл-1. Добавьте Алиготе 5 мкл Metarhizium блапопоры (рис.3) суспензию на поверхность пластикового парафиновых пленки.
Примечание: суспензия Metarhizium блапопоры была скорректирована с помощью камеры Нойбауэр. Чтобы ускорить процесс прививки, можно добавить несколько пузырьков на поверхность пластикового парафина, каждый пузырь, соответствующий 5 мкл. - Используйте 1 мл ультра-тонкий инсулин шприц и 0,3 мм иглы тянуть подвески и прививать его в тик. Не забудьте взять весь воздух из шприца перед его использованием.
- Прививать 5 мкл грибковых суспензии в галочку женщин между потертом и капитель. Инокуляции самок из контрольной группы с 5 мкл 0,1% полйоксесилене сорбиан моноолеат раствор (v/v) без грибка.
Примечание: небольшой объем гемолимфы могут присутствовать на forаминь после вставки иглы. Будьте осторожны, чтобы не прививать воздух.
3. прививка энтомопатогенных грибов между ножкой бедра и клещевого женского тела
- Инокуляции самок с грибковой суспензии (5 мкл на 1,0 х 107 бластопоры мл-1) между ног Tigh и женского тела, используя 1 мл ультра-тонкий инсулиновый шприц в сочетании с 0,3 мм иглы. Прививать самок из контрольной группы с 5 мкл 0,1% полйоксесилене сорбитан моноолеатного раствора (v/v).
Примечание: когда проводится прививка от Metarhizium бластопоры между ног Tigh и клеща женского тела, небольшой объем гемолимфы могут присутствовать на Tigh после вставки иглы. Будьте осторожны, чтобы не прививать воздух.
4. спинной гемолимфой коллекции
- Используйте резиновую часть крылатого набора настоя, трубку для капилляров диаметром 0,3 мм и отфильтрованный наконечник для выполнения коллекции гемолимфы.
- Сорвать женский спинной кутикулы использованием 0,3 мм иглы.
- После перерыва Нанесите мягкое давление на переднюю часть тела клеща. Наблюдайте за почти прозрачной жидкостью, вырытой из места разрушения. Соберите гемолимфы, высасывая жидкость через фильтр наконечник, связанный с резиновой части крылатый набор настоя, и 0,3 мм капилляра трубки.
Примечание: не нажимайте на тело клеща вряд ли во время его иммобилизации, поскольку это может нарушить мидгут и загрязнять гемолимфы. Подождите, пока мягкое давление может изгнать жидкость без загрязнения.
5. гемолимфа сбора от клеща ногу
- Обездвижить тик, вырезать часть передней ноги с ножницами.
Примечание: один или несколько ног могут быть сокращены, а также, одну и ту же ногу можно вырезать более одного раза. - Нанесите мягкое давление на заднюю часть клещевого тела. Наблюдайте прозрачный жидкий пузырь, который появляется на месте разреза и собирает его с трубкой капилляра, как описано в шаге 4,3.
Примечание: не нажимайте на тело клеща вряд ли во время его иммобилизации, поскольку это может нарушить мидгут и загрязнять гемолимфы. Подождите, пока мягкое давление может изгнать жидкость без загрязнения.
6. обработка гемолимфы
- После сбора гемолимфы, внесите его в микротрубки 1,5 мл, предварительно заполненные 30 мкл протеазы коктейля и 82 мкл солевой буфер. Храните микротрубки на льду во всей коллекции гемолимфы.
- Образцы центрифуг (500 x g для 3 мин при температуре 4 °c). После центрифугирования гемолимфы образуется мягкая грануляция гемоцитов.
Примечание: для определения гемолимфы квантифицировать объем гемолимфы, полученный путем подсчета общего объема внутри микротрубки и дисконтирования объема коктейля протеазы и солевого буфера. - Аккуратно удалите супернатант (безклеточный гемолимф). Мягко ресуспензируем клетки, например, в культуру Лейбовиц L-15, скорректированной на рН 7-7,2. Количественное определение гемоцитов путем размещения 10 мкл ресуспендирован гемоцитов в камере Нойбауэр.
7. при подготовке к отбору проб гемоцитов
- Отрежьте переднюю ногу клеща ножницами.
- Нанесите мягкое давление на заднюю часть клещевого тела. Соблюдайте прозрачный жидкий пузырь, который появляется на месте разреза.
- Нанесите капли гемолимфы непосредственно на чистые слайды микроскопа, после этого используйте присвоены методы, чтобы испачкать клетки.
- Для окрашивания гемоцитов с использованием Giemsa, воздушно-сухой гемолимфы на слайде в течение 30 мин, зафиксировать его при комнатной температуре с метанолом в течение 3 мин, и пятно в Giemsa раствора (1:9 соотношение буферного раствора Соренсена, рН 7,2) в течение 30 минут при комнатной температуре. Вымойте слайды с проточной водой, чтобы удалить избыток красителя, воздушно-сухой слайд и оценить клетки на 400x в оптический микроскоп.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Эта статья подходы прививки и гемолимфы методы сбора применительно к клещей. После прививки между ног бедра и клеща женского тела, некоторые жидкости (гемолимфы) могут быть секретируются во время процесса; Однако, важно заметить что когда прививка закончена, никакая жидкость или ткани не присутствовали в подсказке иглы или на месте прививки, обеспечивающ что грибковая суспензия вполне была вакцинина. Когда процесс прививки был правильно выполнен, вставка иглы не стала причиной смерти клещ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Инокуляции патогенов полезно, когда исследование направлено на изучение в естественных условиях действия микроорганизмов в экспериментальных членистоногих моделей, поскольку он уверяет, что патоген находится внутри хозяина. Этот метод также может быть применен к прививать молекулы, такие как РНК-интерференции (RNAi). Прививка между скудум и капитель считается легче выполнять, но часто повреждает орган gené's, нарушая жизнеспособность яиц12,13. Орган генэ анатомич...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Это исследование было частично профинансировано Коорденакао-де-Аперфечоаменту де Пессоаль де Нивель (МЫСАМИ) из Бразилии, финансируемым кодексом 001. МЫСЫ условии кандидат стипендии для А.Ф. Марчиано. Мы благодарим Национальный совет по научно-техническому развитию (CNPq) Бразилии за предоставление учености стипендии для J. Фиоротти. Это исследование было также поддержано грантами фонда Карлоса Шагаса Фильхо для исследования штата Рио-де-Жанейро (FAPERJ) и CNPq. В.Р.Е.П. Bittencourt является исследователем CNPq.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Раствор щелочного гипохлорита | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-глюкоза | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 16000036 | |
| Гибкая резина | BD | ||
| Giemsa морилка | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Стеклянный капиллярный | CTechGlass | CT95-02 | |
| Инсулиновый шприц (игла) | BD | Артикул: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Питательная среда L-15 Лейбовица | Gibco | 11415-064 | |
| Метанол | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R Предметные | |
| стекла для микроскопа | Kasvi | K5-7105 | |
| МАРКА | Z336769-1PAK | ||
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Камера Нойбауэра | Kasvi | K5-0111 | |
| Пенициллин | Gibco | 15140163 | |
| коктейль ингибиторов протеазы | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
Ссылки
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Schrank, A., Vainstein, M. H. Metarhizium anisopliae enzymes and toxins. Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).
- Camargo, M. G., et al. Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions. Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).
- Perinotto, W. M. S., et al. In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus. Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).
- Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4 (3), 357-374 (2013).
- Angelo, I. C., et al. Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi. Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).
- De Paulo, J. F., et al. Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection. Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).
- Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. Regulators and signalling in insect haemocyte immunity. Cell Signal. 21, 186-195 (2009).
- Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves. Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).
- Nation, J. L. Insect Physiology and Biochemistry. , University of Florida. Gainesville, FL. (2016).
- Gene, J. Mémoires de l'Académie royale des sciences. Torino. 9, 751(1848).
- Lees, A. D., Beament, J. W. L. An organ waxing in ticks. The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).
- Sonenshine, D. E., Roe, R. M. Biology of ticks. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2014).
- Tan, J., et al. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori. Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).
- Bowden, T. J. The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus). Fish Research. 186, 367-371 (2017).
- Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks. Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).
- Tsakas, S., Marmaras, V. Insect immunity and its signaling: an overview. Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).
- Burgdorfer, W. Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).
- Patton, T. G., et al. Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. 60, e3894(2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
