В vitro Анализ для изучения опухоли макрофаг взаимодействия

Макрофаги являются иммунными клетками с высокой фенотипической и функциональной неоднородностью^1. Они играют важную роль в системах защиты хозяина, ремонт тканей, развитие и прогрессирование опухоли¹. TAMs являются макрофагами в микросреде твердых опухолей. Некоторые TAMs может способствовать росту опухоли путем ингибирования Т-клеточной цитотоксичной активности, модулируя микросреду опухоли (TME), способствуя ангиогенез, вторжение и метастазы^{2,3,4, 5}. TAMs являются одними из наиболее распространенных типов клеток в TME и большее количество TAMs обычно коррелирует с хуже выживания пациента во многих типах твердых опухолей⁶. Различные генетические подписи опухолевых клеток влияют на их способность набирать макрофаги. В GBM, агрессивная опухоль мозга без лечения, макрофаги могут представлять до половины массы опухоли⁷. Совместное усиление рецептора эпидермального фактора роста(EGFR)и его усечения мутанта EGFRvIII часто наблюдается в ГБМ, что дает преимущества роста опухоли⁸. Клетки, совместно выражающие EGFR и EGFRvIII, привлекают больше макрофагов посравнению с клетками, выражающими EGFR или EGFRvIII singly 7.

Chemokines представляют собой семейство небольших цитокинов, которые играют значительную роль в регулировании иммунного состава в TME^6,9. Клетки человека выражают более 50 цитокинов^10. Иммунная инфильтрация в опухолях в значительной степени реализуется путем взаимодействия между цитокинов и цитокиновых рецепторов¹¹. Каждый тип иммунных клеток выражает различные рецепторы хемокина /хемокины и могут быть завербованы клетками, выделяющими специфические хемокины/хемокиновых рецепторы^12. Раковые клетки могут увеличить экспрессию некоторых хемокины для вербовки иммунных клеток, таких какTAMs, регулятивные Т-клетки и миелоидные супрессорные клетки (MDSCs) 6. Блокада специфического хемокина, выделяемого опухолями, может быть многообещающим способом ингибирования проникновения иммунных клеток в опухольную массу.

Здесь мы описываем протокол, который позволяет в пробирке оценки взаимодействия опухолево-макрофагов, используя условные средства из опухолевых клеток, содержащих хемокины и макрофаг клеточные линии.

1. Средняя подготовка

1. Приготовление среды стволовых клеток, свободных от сыворотки,
   1. Оттепель 50x B27 дополнения, эпидермальный фактор роста (EGF, 20 мкг/мл в 10 мм уксусной кислоты с 0,1% BSA), и фактор роста фибробластов (FGF, 20 мкг/мл в 10 мм уксусной кислоты с 0,1% BSA).
   2. Добавьте 500 л EGF (окончательная концентрация 20 нг/мл), 500 л FGF (окончательная концентрация 20 нг/мл), 10 мл 50x B27 до 500 мл л. модифицированной орла Dulbecco Средний /Питательный Mixture F-12 (DMEM/F12) и 5 мл 100x пенициллина/стрептомицина (Pen/Strep). Перевернуть бутылку 4-6 раз, чтобы перемешать, фильтр стерилизовать через 500 мл 0,1 мкм фильтрации чашки. Отметьте бутылку и храните при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда хороша для использования в течение месяца при 4 градусах Цельсия.
2. Подготовка MV-4-11 культуры среды: Добавить 50 мл сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) до 500 мл Исковва модифицированных Dulbecco в среднем (IMDM). Перевернуть бутылку 4-6 раз, чтобы перемешать, фильтр стерилизовать через 500 мл 0,1 мкм фильтрации чашки. Отметьте бутылку и храните при 4 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среда хороша для использования в течение месяца при 4 градусах Цельсия.
3. Подготовка среды обслуживания опухолевых клеток: Добавить 50 мл FBS до 500 мл модифицированного орла среднего Dulbecco (DMEM). Перевернуть бутылку 4-6 раз, чтобы перемешать, фильтр стерилизовать через 500 мл 0,1 мкм фильтрации чашки. Отметьте бутылку и храните при 4 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среда хороша для использования в течение месяца при 4 градусах Цельсия.

2. Подготовка клеток

День 1:

1. Таяние опухолевых клеток
2. Разогрейте среду обслуживания опухолевых клеток (как описано в шаге 1.3) на водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
3. Возьмем замороженные u87, U87:EGFR, U87:EGFRvIII и U87:EGFR-EGFRvIII из резервуара с жидким азотом. Оттепель клетки на 37 градусов воды в течение 2 минут.
   ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны при взятии клеток из резервуара с жидким азотом. Носите перчатки с тепловой защитой и защитными очками по мере необходимости.
4. Спрей ткани культуры капота поверхности с 70% этанола и стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами.
5. Спрей криогенные флаконы, содержащие клетки и средняя бутылка с 70% этанола, стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами, и принести их в ткани культуры капот.
6. Pipette 5 mL поддержания опухолевых клеток среднего в 15 мл стерильной центрифуги трубки. Перевернуть трубку, содержащую опухолевые клетки 4-6 раз, чтобы смешать. Пипетка все клетки в 15 мл центрифуги трубки. Перевернуть центрифугу трубки 4-6 раз, чтобы перемешать.
7. Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин при 4 кв. C. Аспирируй супернатанта.
8. Вымойте клетки 10 мл фосфатного буферного солья (PBS). Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин при 4 кв. C. Аспирируй супернатанта.
9. Resuspend клетки в 12 мл среднего обслуживания опухолевых клеток (как описано в шаге 1.3). Пипетка вверх и вниз 3-5 раз, чтобы смешать. Перенесите клетки в колбу культуры Т75.
10. Выращивайте клетки в инкубаторе 37 градусов с 5% CO_2. Положите средний уровень обслуживания опухолевых клеток обратно в холодильник 4 градусов по Цельсию.

День 2:

2. Проверьте клетки под микроскопом. При необходимости измените среду. Клетки должны расти в монослой в культуре.

День 3:

3. Таяние MV-4-11 клеток
   1. Разогрейте культурную среду MV-4-11 (как описано в шаге 1.2) на водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: MV-4-11 может быть изменен на первичные макрофаги или другие линии клеток макрофагов, в зависимости от необходимости конкретного исследования.
   2. Возьмите замороженные MV-4-11 клетки из резервуара с жидким азотом. Оттепель клетки на водяной бане 37 градусов в течение 2 мин.
      ПРЕДЕКТО: Будьте осторожны при взятии клеток из резервуара с жидким азотом. Носите перчатки с тепловой защитой и защитными очками по мере необходимости.
   3. Спрей ткани культуры капота поверхности с 70% этанола и стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами.
   4. Спрей криогенные флаконы, содержащие клетки и средняя бутылка с 70% этанола, стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами, и принести их в ткани культуры капот.
   5. Пипетка 5 мл культуры MV-4-11 (как описано в шаге 1.2) в стерильной центрифуге 15 мл. Перевернуть трубку, содержащую опухолевые клетки 4-6 раз, чтобы смешать. Пипетка все клетки в 15 мл центрифуги трубки. Перевернуть центрифугу трубки 4-6 раз, чтобы перемешать.
   6. Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин при 4 кв. C. Аспирируй супернатанта.
   7. Вымойте клетки в 10 мл PBS и центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 минут при 4 c. Аспирируй супернатанта.
   8. Повторное действие клеток в 12 мл культуры MV-4-11 среды (как описано в шаге 1.2). Аккуратно пипетка вверх и вниз 3-5 раз, чтобы смешать. Перенесите клетки в колбу культуры Т75.
   9. Выращивайте клетки в инкубаторе 37 градусов с 5% CO_2.
4. Разделение опухолевых клеток
   1. Разогрейте среду стволовых клеток, свободных от сыворотки (как описано в шаге 1.1) на водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
   2. Спрей ткани культуры капота поверхности с 70% этанола и стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами. Возьмите раствор отслоения клетки из холодильника. Спрей среднего и клеточного отслоения раствор бутылки с 70% этанола, стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами и принести их в ткани культуры капот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не разогревайте раствор аккутазы.
   3. Перенос культуры опухолевых клеток из инкубатора в капюшон культуры тканей. Прибавьте среду, добавьте 2 мл раствора отслоения клеток в колбу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промыть pbS перед добавлением аккутазы является необязательным здесь.
   4. Установите колбу в капюшоне. Проверьте, каждую минуту опухолевые клетки округляются. Как только опухолевые клетки округляются, осторожно коснитесь стороны колбы, чтобы помочь клеткам отделиться от колбы.
   5. Пипетка 8 мл сыворотки свободной стволовых клеток среды в колбу, пипетка вверх и вниз 3 раза, чтобы смешать, и передать клетки в 15 мл стерильной центрифуги трубки. Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин при 4 кв. C. Аспирируй супернатанта.
   6. Вымойте клетки в 10 мл PBS. Пипетка вверх и вниз 3-5 раз, чтобы смешать. Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин при 4 кв. C. Аспирируй супернатанта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является обязательным.
   7. Приостанавливайте действие клеток в 10 мл среды стволовых клеток, свободных от сыворотки (как описано в шаге 1.1). Пипетка вверх и вниз 3-5 раз, чтобы смешать. Возьмите 10 л клеток и смешайте с 10 злитровых раствора Trypan Blue. Пипетка 10 л смеси в счетслайд, количественно живой номер ячейки с помощью автоматического счетчика клеток.
   8. Отрегулируйте плотность клеток до 2,5 х 10⁵ клеток/мл со средой стволовых клеток, свободных от сыворотки (как описано в шаге 1.1), и семенами 2 мл клеток в каждую скважину 6-хорошей пластины клеточной культуры. Для каждого типа клеток, семян 3 скважины (тройной образец). В то же время, подготовить 6 скважин с 2 мл сыворотки свободной стволовых клеток среды только (без клеток).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти образцы будут использоваться: 1) в качестве отрицательного контроля и 2) для регулировки условного среднего объема на основе номеров клеток.
   9. Положите 6-колодец пластин в инкубатор 37 градусов с 5% CO₂. Разрешить клетки расти в течение 24 ч.

3. В пробирке Макрофаг Привлечение Анализ

1. Подготовка условных носителей
   1. Разогрейте среду обслуживания опухолевых клеток (как описано в шаге 1.3) на водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
   2. Спрей ткани культуры капота поверхности с 70% этанола и стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами. Возьмите раствор отслоения клетки из холодильника. Спрей бутылки среды и раствор отслоения клеток с 70% этанола, стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами и принести их в ткани культуры капот.
   3. Вынизвините из инкубатора 6-колодливые пластины. Тщательно пипетка кондиционированных носителей в 15 мл стерильных центрифуг труб. Поставьте трубки на лед. Pipette средств в «средствах только» наилучшим образом в отдельно пробку центрифуги 15 mL стерильной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед этим шагом, убедитесь, что проверить под микроскопом, чтобы увидеть, если клетки прикрепляются. Если нет, можно использовать покрытые пластины на шаг 2.4.8, чтобы лучше вложения или включить плавающие ячейки в шаге подсчета.
   4. Добавьте 0,5 мл раствора отслоения клеток в каждую скважину 6-колодца. Проверьте, каждую минуту опухолевые клетки округляются. После того, как опухолевые клетки округлить вверх, осторожно нажмите сторону пластины, чтобы помочь клеткам отделиться.
   5. Пипетка 2,5 мл поддержания опухолевых клеток среднего в колодец, пипетка вверх и вниз 3 раза, чтобы смешать и передать клетки в 15 мл стерильной центрифуги трубки. Возьмите 10 л клеток и смешайте с 10 злитровых раствора Trypan Blue. Пипетка 10 л смеси в счетслайд и количественно количество живых клеток с помощью автоматического счетчика клеток.
   6. Отрегулируйте громкость условных носителей в соответствии с номером клетки с помощью среды стволовых клеток, свободной от сыворотки (37 градусов по Цельсию на ночь). Например, если Well A имеет в 3 раза больше живых клеток, а также скважину с наименьшим количеством клеток, разбавьте его условные носители 1:3. Этот шаг используется для контроля разницы, вызванной скоростью пролиферации клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Причина использовать сыворотку свободной среде стволовых клеток с 37 КК инкубации в одночасье заключается в том, чтобы контролировать возможные изменения в средствах массовой информации с длительным 37 кС воздействия.
   7. Фильтр условных носителей через 0,45 мкм фильтры. Положите условные носители на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг удаляет клетки и мусор клеток в условных носителях.
2. Приготовление клеток MV-4-11
   1. Разогрейте среду IMDM (без FBS) на водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
   2. Спрей ткани культуры капота поверхности с 70% этанола и стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами. Спрей средней бутылки с 70% этанола, стереть 70% этанола на поверхности с бумажными полотенцами и принести их в ткани культуры капот.
   3. Возьмите колбу MV-4-11 клеток в капюшон культуры ткани. Пипетка 10 мл клеток в стерильной центрифуге 15 мл. Возьмите 10 л клеток и смешайте с 10 злитровым раствором Trypan Blue. Пипетка 10 л смеси в счетслайд и количественно количество живых клеток с помощью автоматического счетчика клеток. Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин при 4 c. Аспирируй супернатанта.
   4. Вымойте клетки с 10 мл PBS и центрифуга клетки на 200 х г в течение 5 минут при 4 c. Аспирируй супернатанта.
   5. Приостанавливайте действие клеток в среде IMDM (без FBS) для конечной плотности клеток 1x10⁶ ячеек/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток макрофагов, используемых здесь, может быть скорректировано.
3. Трансуэлл ассе
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага используйте набор асссов для проведения исследований миграции клеток или купите реагенты и вставьте отдельно. Для ячеек MV-4-11 выберите вставки Transwell с размером поры 5 мкм. Чтобы обнаружить миграцию макрофагов, непосредственно количественно количество макрофагов в нижней камере или использовать колористетриметрические /фторметрические методы. Здесь мы демонстрируем анализ с помощью колориметрического метода.
   1. Доведите 24-колоднюю пластину, вставку и реагенты до комнатной температуры.
   2. Добавьте 250 кЛ ячеек MV-4-11, подготовленных выше, в каждую вставку.
   3. Добавьте 400 кл кв.м. кондиционированной средней/средней только (с ночной инкубации при 37 градусах Цельсия, эти образцы служат отрицательным контролем) в нижние камеры 24-хорошей пластины. Для каждой линии опухоли или контроля, используйте тройные образцы. Избегайте пузырьков между вставкой и кондиционированной средой. Пузыри будут препятствовать макрофагам от миграции в нижние колодцы.
   4. Инкубировать пластины в инкубаторе 37 градусов с 5% CO₂ на 4 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации можно скорректировать. Клетки, мигрирующие в нижние камеры, можно увидеть под микроскопом.
   5. Аккуратно коснитесь вставки на внутренней стене того же колодца и отбросьте вставку. Поскольку клетки MV-4-11 растут в суспензии, раствор отслоения клеток или лечение трипсина здесь не требуется.
   6. Аккуратно пипетка клетки в колодцах вверх и вниз 3 раза, чтобы смешать. Передача 225 л клеточной подвески на черностенную 96-хорошую пластину, подходящую для флуоресцентных измерений.
   7. Разбавить краситель Cyquant 1:75 с 4x лисис буфера. Vortex кратко и спина вниз решение. Добавьте 75 л раствора к каждой скважине из 96-хорошо пластины. Инкубировать 15 мин при комнатной температуре.
   8. Читайте флуоресценцию, используя фильтр 480/520 нм с флуоресценцией.
   9. Проанализируйте данные, вычитая пробел и нормализации в линии контрольной опухолевой клетки.

Результаты обычно показываются с помощью графиков баров (пример показано на рисунке 1). Образцы с высокими значениями 480/520 показывают, что условные носители обладает высокой емкостью для набора макрофагов. В зависимости от экспериментальной потребности могут быть включены дополнительные элементы управления. Например, можно использовать нейтрализующие антитела для лечения условных носителей, чтобы отменить макрофаг химиотаксис, и выполнить тот же анализ. Можно также добавить дополнительные хемокины (т.е. CCL2) в условные носители, которые служат положительным контролем.

Рисунок 1: Условные носители из u87 клеток, совместно выражающих EGFR и EGFRvIII, привлекают больше макрофагов, чем клетки U87, выражающие вектор контроля, или EGFR/EGFRvIII по-разному. Эта цифра была изменена с An, и др.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Уильям А. Вайс является соучредителем StemSynergy Therapeutics. Чжэньи Ан не имеет ничего раскрывать.