Цель этого протокола состоит в том, чтобы показать, как использовать латетную световую микроскопию для четырехмерной визуализации динамики поверхностных рецепторов в живых клетках. Здесь показаны Т-клеточные рецепторы на CD4и первичных Т-клетках.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация поверхности T-клеточного рецептора динамики четыре-Dimensionally использование решетки светлист микроскопии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сигнализация и функция клетки диктуются динамическими структурами и взаимодействиями ее поверхностных рецепторов. Чтобы по-настоящему понять структурно-функциональную связь этих рецепторов на месте, нам нужно визуализировать и отслеживать их на поверхности живой клетки с достаточным пространственно-временное разрешение. Здесь мы покажем, как использовать недавно разработанную решетку светолистной микроскопии (LLSM) для изображения Т-клеточных рецепторов (TCRs) четырехмерно (4D, пространство и время) на мембране живых клеток. Т-клетки являются одним из основных эффекторов клеток адаптивной иммунной системы, и здесь мы использовали Т-клетки в качестве примера, чтобы показать, что сигнализация и функция этих клеток обусловлены динамикой и взаимодействия ТКК. LLSM позволяет 4D-изображения с беспрецедентным пространственно-временное разрешение. Этот метод микроскопии поэтому может быть обычно применяется к широкому спектру поверхностных или внутриклеточных молекул различных клеток в биологии.
Введение
Точная динамика торговли молекулами и распространения на трехмерной поверхности клеток в режиме реального времени была загадкой для решения. Микроскопия всегда была балансом скорости, чувствительности и разрешения; если один или два максимизированы, третий сводится к минимуму. Поэтому из-за небольшого размера и огромной скорости, с которой движутся поверхностные рецепторы, отслеживание их динамики остается серьезной технологической проблемой в области клеточной биологии. Например, многие исследования были проведены с использованием общей внутренней флуоресценции (TIRF) микроскопии1,2 ,3,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
5С. C7 TCR-трансгенных RAG2 нокаут мышей в B10. Справочная информация была использована в этом исследовании в соответствии с протоколом, утвержденным институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Чикагского университета.
1. Урожай и активация Т-клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола основана на предыдущих протоколах. Подробнее о цитатах можно узнать20,21.
- Euthanize 10-12 недель 5C. C7 трансгенной мыши любого пола (20-25 г) в соответствии с утвержденным протоколом IACUC (т.е. CO2 камеры следуют вывихшей шейки матки)....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Здесь мы описываем изоляцию, подготовку и визуализацию первичной мыши 5C. C7 T-клетки с помощью решетчатого светового листового микроскопа. Во время раздела 3, необходимо выровнять микроскоп правильно, и собрать PSF ежедневно, с которым deconvolve данные после сбора. На рисунке 2мы показываем правильные изображения выравнивания, которые будут видны при выравнивании микроскопа. Рисунок 2А и рисунок 2B
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Представленный протокол был оптимизирован для использования CD4и Т-клеток, изолированных от 5C. C7 трансгенных мышей на используемом инструменте LLSM, и поэтому другие клеточные системы и LLSMs, возможно, должны быть оптимизированы по-разному. Тем не менее, этот протокол показывает силу 4D-изображения, так как он может быть использован для количественной оценки динамики поверхностного рецептора на всей клетке с наименьшим искажением в физиологических условиях. Таким образом, Есть много возможных будущих примен.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы отметить советы и рекомендации доктора Витаса Биндокаса из Чикагского университета. Мы благодарим комплексную световую микроскопию ВШЭ в Чикагском университете за поддержку и поддержание латисового светового листового микроскопа. Эта работа была поддержана NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 и NSF Career Award 1653782 (To J.H.). J.R. поддерживается Программой стипендий для аспирантов NSF.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 мл шприца | BD | 309659 | Для сбора Т-клеток |
| 2-меркаптоэтанол | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | Для культуры Т-клеток |
| 5 мм круглые покровные стекла | World Precision Instruments | 502040 | Для визуализации |
| 70 мкм Стерильный клеточный фильтр | Corning | 7201431 | Для сбора Т-клеток |
| Alexa Fluor 488 антимышиный TCR и бета-цепь антитела | BioLegend | 109215 | для визуализации |
| фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) | X& Культура Y-клеток | FBS-500 | Для культуры Т-клеток |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Реагент Денистый градиент для забора Т-клеток |
| Флуоресцеин натриевая соль | Sigma-Aldrich | F6377 | Для юстировки микроскопа |
| FluoSpheres Карбоксилат-модифицированные микросферы | Thermo Fisher Scientific | F8810 | Для юстировки микроскопа |
| Imaris | Bitplane | Программное обеспечение для н/д | слежения; Другие варианты программного обеспечения для отслеживания включают Amira или Trackmate (Фиджи). |
| Решетчатый световой листовой микроскоп | 3i | Н/А | Микроскоп Использован |
| Среда L-15 Лейбовица, без фенола красного | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | Для визуализации |
| L-глютамина | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | Для культуры Т-клеток |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy использовался по лицензии Медицинского института Говарда Хьюза, исследовательского кампуса Джанелии. Свяжитесь с innovation@janelia.hhmi.org для доступа. Другие методы деконволюции и расшивки доступны в программах обработки изображений, таких как Fiji, Slidebook, Amira и других. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/Moth |
| Цитохром C (MCC), последовательность ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | Для культуры Т-клеток |
| Poly-L-лизин | Phenix Research Products | P8920-100ML | Для визуализации |
| для лизиса эритроцитов | eBioscience | 00-4300-54 | Для сбора Т-клеток |
| Рекомбинантная мышь IL-2 | Sigma-Aldrich | i0523 | Для культуры Т-клеток |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | Для культуры Т-клеток |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM программное обеспечение для визуализации |
| Хирургические инструменты | для диссекцииNova-Tech International | DSET10 | Для сбора Т-клеток |
| Т-25 Колбы | Eppendorf | 2231710126 | Для культуры Т-клеток |
| Thermo Scientific Pierce Fab Наборы для микропрепаратов | Thermo Fisher Scientific | 44685 | Для приготовления Fab |
Ссылки
- Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
