Методическая статья

Оценка состояния оплодотворения путем отслеживания ядерной морфологии спермы в арабидопсис двойное оплодотворение

DOI:

10.3791/59916

⸱

29 августа 2019 г.

 , 
1Graduate School of Horticulture, Chiba University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы демонстрируем метод определения успешного или неудачного оплодотворения на основе сперматозоиды ядерной морфологии в арабидопсисдвойном двойном оплодотворении с помощью эпифлюоресцентного микроскопа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цветущие растения имеют уникальную систему полового воспроизводства, называемую «двойное оплодотворение», в которой каждая из сперматозоидов точно сливается с яйцеклеткой или центральной клеткой. Таким образом, два независимых события оплодотворения происходят почти одновременно. Оплодотворенная яйцеклетка и центральная клетка развиваются в зиготе и эндосперме, соответственно. Поэтому для последующего развития семян необходим точный контроль за двойным оплодотворением. Двойное оплодотворение происходит в женском гаметофите (эмбрио-мешок), который глубоко скрыт и покрыт толстыми тканями яйчи и яичников. Эта конструкция пестильной ткани затрудняет наблюдение и анализ двойного оплодотворения и создает нынешнюю ситуацию, в которой многие вопросы, касающиеся механизма двойного оплодотворения, остаются без ответа. Для функциональной оценки потенциального кандидата на оплодотворение важен фенотипический анализ оплодотворения. Для того чтобы судить завершение оплодотворения в Arabidopsis thaliana,формы сигналов флуоресценции маркируя ядра спермы использованы как индикаторы. Клетка спермы которая не усваивает показана сжатым сигналом флуоресценции вне женского gametes, тогда как клетка спермы которая успешно оплодотворяет показана decondensed сигналом из-за karyogamy с женским ядром gametes. Описанный здесь метод предоставляет инструмент для определения успешного или неудачного оплодотворения в условиях in vivo.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цветущие растения производят семена путем двойного оплодотворения, процесс, который непосредственно контролируется взаимодействия миноносов, локализованных на гамете плазменной мембраны1,2. Цветущее растение самцов гамет, пара сперматозоидов, развивается в пыльце. Пыльца трубки, которая растет после опыления поставляет пару сперматозоидов для женщин гамет, яйцеклетки и центральной клетки, которые развиваются в эмбриона мешок. После того, как встречаются самцы и женщины- гаметы, белки на поверхности гамет способствуют распознаванию, привязанности и синтезу для полного двойного оплодотворения. В предыдущих исследованиях, мужские гаметовые мембранные белки GENERATIVE CELLSPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2) 3,4 и GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 были определены как регуляторы оплодотворения, участвующие в синтезе гамет и вложения, соответственно. Недавно мы определили мужской гамет-специфический мембранный белок, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), как регулятор оплодотворения, участвующий в взаимодействии гамет. Мы обнаружили, что уменьшение экспрессии DMP9 приводит к значительному ингибированию оплодотворения яйцеклеток во время двойного оплодотворения в A. thaliana6.

Как двойное оплодотворение происходит в эмбриона мешок, который встроен в яйлю, которая дополнительно обернутые с яичников ткани, трудно наблюдать и анализировать состояния двойных процессов оплодотворения. По этой причине до сих пор существует много неясных моментов, которые препятствуют полному пониманию всего механизма контроля за двойным оплодотворением. Создание методов наблюдения для отслеживания поведения гамет во время двойного оплодотворения в условиях in vivo необходимо для функционального анализа потенциальных кандидатов на органы оплодотворения. Недавние исследования дали маркерные линии, где гамет субклеточные структуры помечены флуоресцентными белками. В этой статье мы демонстрируем простой и быстрый протокол для наблюдения за двойным оплодотворением, которое произошло в эмбриональном мешке, полученном из искусственно опыляемых пестики. Использование сперматозоидов ядро маркера линии HTR10-mRFP7, состояние оплодотворения каждой женщины гаметы могут быть дискриминированы на основе спермы ядерной морфологии сигнала. Наш протокол, посвященный такому морфологическому изменению ядер спермы при оплодотворении, может эффективно получить достаточное количество данных для статистического подтверждения. DMP9-нокдаун линии с HTR10-mRFP фон (DMP9KD/HTR10-mRFP) был использован в качестве мужских растений, чтобы показать одну модель оплодотворения. Протокол также подходит для функционального анализа других регуляторов оплодотворения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Искусственное опыление

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом процесса требуется пара щипков No 5.

  1. Выращивайте A. thaliana (Col-0) при 22 градусах Цельсия при 16-h светлом/8-h темном цикле в камере роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вырезать и удалить первый развитый цветок стебель с ножницами для содействия развитию подмышечных почек. Активно растущие растения (через 2-3 недели после разрезания первого стебля; рост растений около 25 см) подходят для анализа.
  2. Чтобы выхозовать, удалить sepal(Рисунок 1B), лепесток (рисунок1C), и тычинки (Рисунок1D) цветочных почек на стадии 118 (Рисунок1A) с помощью No 5 щипцы. Бад с кусочками лепестков видели в верхней лучше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте подходящую женскую линию маркера гамета. В этом протоколе мы использовали растение дикого типа в качестве женского родителя.
  3. Пятнадцать до восемнадцати часов после выхозывания, возьмите тычинки DMP9KD/ HTR10-mRFP цветок на стадии 13 8, щипать нить с щипцы.
  4. Чтобы опылить, осторожно погладить клеймо выхолощенного pistil несколько раз с дехисточаемым пыльцой.

2. Подготовка Овуле для наблюдения

ПРИМЕЧАНИЕ: Требуются следующие элементы: слайд-стекло с двусторонним лентой, щиптем No 5, инъекционной иглой 27 G и рассекающим микроскопом.

  1. 7 до 8 ч после опыления (HAP), соберите пестик и поместите его на двусторонню ленту, затем нажмите осторожно с щипцы, чтобы исправить пестик на ленте (Рисунок 2A,A ').
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство овулей в пестике получают по крайней мере одну пыльцу трубки 10 HAP9. Если обе или любой из сперматозоидов из первой пыльцы трубки не удобрять, вторая пыльца трубки будут привлечены яйчий из-за системы восстановления оплодотворения10. Для анализа морфологии ядер спермы из первой пыльцы трубки, рекомендуется завершить подготовку яйцеклеток на 10 HAP самое позднее.
  2. Отрежьте верхний и нижний концы яичника с помощью инъекционной иглы под рассекающим микроскопом(рисунок 2B,B').
  3. Прорезаните стенку яичников вдоль обеих сторон ремума(рисунок 2C,C') путем перемещения кончика иглы инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вставьте инъекционную иглу неглубоко, чтобы предотвратить отделение яйчи от перегородки.
  4. Эверт стенки яичников с помощью инъекционной иглы(Рисунок 2D,D').
  5. Pinch основание перегородки, к которой связаны яймы, и поднимите его осторожно с щипками(рисунок 2E).
  6. Перенесите овули в каплю воды на слайд-стекле и аккуратно накройте крышкой для наблюдения под флуоресценционным микроскопом(рисунок 2E,E').

3. Микроскопия

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мы использовали эпифлюоресцентный микроскоп, оснащенный кубиком флуоресценционного фильтра (см. ТаблицаМатериалов), цифровой камерой и сопутствующим программным обеспечением.

  1. Приобретайте изображения ядер спермы, содержащих ядра спермы, помеченные mRFP с помощью объектива 20x или 40x объективной и оборудованной цифровой камеры.
  2. Подтвердите количество ядер спермы с маркировкой mRFP в эмбрионном мешке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Овулы, содержащие два mRFP-маркированных ядрах спермы, могут быть включены в численность населения для статистического анализа.
  3. Подтвердите форму и положение каждого ядра спермы с маркировкой mRFP в эмбрионном мешке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сразу же после освобождения из пыльцы трубки, пара конденсированных mRFP помечены ядра спермы локализуются между яйцом и центральной клеткой. Одеконденсированное ядро спермы mRFP, обнаруженное на стороне конца чалазал, указывает, например, на оплодотворение центральных клеток. С помощью подходящей женской гаметом мембранной маркерной линии, как показано на дополнительной рисунке 1, независимо от того, проходит ли сперматозоидная клетка плазмогамия (после мембранного синтеза, но до карйогими) можно четко контролировать.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Овулы из пестика, опыляемые DMP9KD/HTR10-mRFP, были собраны при 7-8 HAP и соблюдены.

Большинство овулей содержали два деконденсированных mRFP-маркированных ядер спермы в яйцеклетки (микропилярной стороне) и центральной клетке (charazal конце стороны) ядра позиции, соответственно (Рисунок 3A), что свидетельствует об успешном двойном оплодотворении. Кроме того, были замечены яйцек...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HTR10-mRFP этикетки отцовского хроматина (т.е. визуализирует ядра сперматозоидов), и динамика в двойном оплодотворении были зарегистрированы7. Сразу же после выпуска из пыльцы трубки, HTR10-mRFP помечены ядра спермы по-прежнему конденсируются. Тем не менее, каждый из ядер спермы decondensed при слиянии с оплодотворенной женской гаметов ядро в karyogamy три-четыре часа после гамет мембраны слияния7. Неоплодотворенные сперматозоиды остаются конденсированными, как показано в э...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Японским обществом содействия науке KAKENHI грант (JP17H05832 т. И.) и за счет финансирования из стратегического приоритетного программы содействия исследованиям по фитохимическим растениям молекулярных наук, Университет Тиба (Япония).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BX51Эпифлуоресцентный микроскопOlympus
Защитное стеклоСтекло Мацунами C018181
DMP9KD/HTR10-mRFPArabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background
Takahashi et al. (2018)6
Двусторонний скотчNichibanNW-15Sширина 15 мм
DP72OlympusDegital
Camera ЩипцыVigorДоступны любые щипцы No 5
Ростовая камераNihonikaLPH-411PFQDT-SP
em>emHTR10-mRFPArabidopsis thaliana, экотип Columbia-0 (Col-0) background
Ingouff et al. ( 2007)7
Игла для инъекцийTerumoNN-2719S27 G
СтеклоСтекло МацунамиS9443
SZX9Olympusмикроскоп
U-MRFPHQOlympusФлуоресцентный фильтр Cube (Возбуждение: BP535-555, Излучение: BA570-625, Дихроматическое зеркало: DM565)
UPlanFL N 40xOlympusОбъектив (NA 1.3), масляно-погружной
UPlanSApo 20xOlympusLens (NA 0.75), сухой
< Препарирующий объектив

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
  2. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
  3. Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
  4. von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
  5. Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
  6. Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076(2018).
  7. Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
  8. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
  9. Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690(2013).
  10. Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
  11. Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
  12. Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Arabidopsis thalianaHTR10 mRFP

Похожие статьи