Методическая статья

Оценка состояния оплодотворения путем отслеживания ядерной морфологии спермы в арабидопсис двойное оплодотворение

DOI:

10.3791/59916

⸱

29 августа 2019 г.

 , 
1Graduate School of Horticulture, Chiba University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы демонстрируем метод определения успешного или неудачного оплодотворения на основе сперматозоиды ядерной морфологии в арабидопсисдвойном двойном оплодотворении с помощью эпифлюоресцентного микроскопа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цветущие растения имеют уникальную систему полового воспроизводства, называемую «двойное оплодотворение», в которой каждая из сперматозоидов точно сливается с яйцеклеткой или центральной клеткой. Таким образом, два независимых события оплодотворения происходят почти одновременно. Оплодотворенная яйцеклетка и центральная клетка развиваются в зиготе и эндосперме, соответственно. Поэтому для последующего развития семян необходим точный контроль за двойным оплодотворением. Двойное оплодотворение происходит в женском гаметофите (эмбрио-мешок), который глубоко скрыт и покрыт толстыми тканями яйчи и яичников. Эта конструкция пестильной ткани затрудняет наблюдение и анализ двойного оплодотворения и создает нынешнюю ситуацию, в которой многие вопросы, касающиеся механизма двойного оплодотворения, остаются без ответа. Для функциональной оценки потенциального кандидата на оплодотворение важен фенотипический анализ оплодотворения. Для того чтобы судить завершение оплодотворения в Arabidopsis thaliana,формы сигналов флуоресценции маркируя ядра спермы использованы как индикаторы. Клетка спермы которая не усваивает показана сжатым сигналом флуоресценции вне женского gametes, тогда как клетка спермы которая успешно оплодотворяет показана decondensed сигналом из-за karyogamy с женским ядром gametes. Описанный здесь метод предоставляет инструмент для определения успешного или неудачного оплодотворения в условиях in vivo.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цветущие растения производят семена путем двойного оплодотворения, процесс, который непосредственно контролируется взаимодействия миноносов, локализованных на гамете плазменной мембраны1,2. Цветущее растение самцов гамет, пара сперматозоидов, развивается в пыльце. Пыльца трубки, которая растет после опыления поставляет пару сперматозоидов для женщин гамет, яйцеклетки и центральной клетки, которые развиваются в эмбриона мешок. После того, как встречаются самцы и женщины- гаметы, белки на поверхности гамет способствуют распознаванию, привязанности и синтезу для полного двойного оплодотворения. В предыдущих иссле....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Искусственное опыление

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом процесса требуется пара щипков No 5.

  1. Выращивайте A. thaliana (Col-0) при 22 градусах Цельсия при 16-h светлом/8-h темном цикле в камере роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вырезать и удалить первый развитый цветок стебель с ножницами для содействия развитию подмышечных почек. Активно растущие растения (через 2-3 недели после разрезания первого стебля; рост растений около 25 см) подходят для анализа.
  2. Чтобы выхозовать, удалить sepal(Рисунок 1B), лепесток (рисунок1C), и тычинки (Рисуно....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Овулы из пестика, опыляемые DMP9KD/HTR10-mRFP, были собраны при 7-8 HAP и соблюдены.

Большинство овулей содержали два деконденсированных mRFP-маркированных ядер спермы в яйцеклетки (микропилярной стороне) и центральной клетке (charazal конце стороны) ядра позиции, соответственно (Рисунок 3A), что свидетельствует об успешном двойном оплодотворении. Кроме того, были замечены яйцек.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HTR10-mRFP этикетки отцовского хроматина (т.е. визуализирует ядра сперматозоидов), и динамика в двойном оплодотворении были зарегистрированы7. Сразу же после выпуска из пыльцы трубки, HTR10-mRFP помечены ядра спермы по-прежнему конденсируются. Тем не менее, каждый из ядер спермы decondensed при слиянии с оплодотворенной женской гаметов ядро в karyogamy три-четыре часа после гамет мембраны слияния7. Неоплодотворенные сперматозоиды остаются конденсированными, как показано в э.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Японским обществом содействия науке KAKENHI грант (JP17H05832 т. И.) и за счет финансирования из стратегического приоритетного программы содействия исследованиям по фитохимическим растениям молекулярных наук, Университет Тиба (Япония).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BX51Эпифлуоресцентный микроскопOlympus
Защитное стеклоСтекло Мацунами C018181
DMP9KD/HTR10-mRFPArabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background
Takahashi et al. (2018)6
Двусторонний скотчNichibanNW-15Sширина 15 мм
DP72OlympusDegital
Camera ЩипцыVigorДоступны любые щипцы No 5
Ростовая камераNihonikaLPH-411PFQDT-SP
em>emHTR10-mRFPArabidopsis thaliana, экотип Columbia-0 (Col-0) background
Ingouff et al. ( 2007)7
Игла для инъекцийTerumoNN-2719S27 G
СтеклоСтекло МацунамиS9443
SZX9Olympusмикроскоп
U-MRFPHQOlympusФлуоресцентный фильтр Cube (Возбуждение: BP535-555, Излучение: BA570-625, Дихроматическое зеркало: DM565)
UPlanFL N 40xOlympusОбъектив (NA 1.3), масляно-погружной
UPlanSApo 20xOlympusLens (NA 0.75), сухой
< Препарирующий объектив

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
  2. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
  3. Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuro....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Arabidopsis thalianaHTR10 mRFP

Похожие статьи