Методическая статья

Измерение взаимодействия между флуоресцентными зондами и лигнином в секциях растений sFLIM на основе автофлюоресценции коренных народов

DOI:

10.3791/59925

⸱

2 января 2020 г.

 ,  ,  , 
1PICT Platform, Université de Reims Champagne-Ardenne, 2Fractionation of AgroResources and Environment (FARE) Laboratory, INRA, Université de Reims Champagne-Ardenne, 3Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, Université de Lille

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает оригинальную установку, сочетающую спектральные и флуоресцентные измерения продолжительности жизни для оценки реж. Фюрстерской рецензии на передачу энергии (ФРЭТ) между флуоресцентными зондами на основе родамина и лигнином-полимером непосредственно в толстых участках растений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В лигноцеллюлозной биомассе (ЛБ) активность ферментов ограничена появлением неспецифических взаимодействий с лигнином в процессе гидролизного изокиса, который поддерживает ферменты вдали от их субстрата. Таким образом, характеристика этих сложных взаимодействий является сложной задачей в сложных субстратах, таких как LB. Метод здесь измеряет молекулярные взаимодействия между флюорофором помеченных молекул и родной аутофлуоресцентный лигнин, который будет выявлен Фюрстер резонансной передачи энергии (FRET). Вопреки измерениям ФРЕТ в живых клетках с использованием двух экзогенных флюорофоров, измерения ФРЕТ в растениях с использованием лигнина не являются тривиальными из-за его сложной аутофлуоресценции. Мы разработали оригинальный конвейер приобретения и анализа с коррелированным наблюдением двух взаимодополняющих свойств флуоресценции: флуоресценции и срока службы. sFLIM (спектральная и флуоресцентная микроскопия изображений в течение жизни) обеспечивает количественную оценку этих взаимодействий с высокой чувствительностью, выявляя различные уровни взаимодействия между биомолекулами и лигнином.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гидролизуя лигноцеллюлоза в мономерные сахара, такие как глюкоза требует ферментов. Их деятельность, как известно, сдерживается созданием неспецифических взаимодействий между ферментами и лигнином1,2, последний является гидрофобным полимером и основным компонентом лигноцеллюлозы3. Таким образом, количественное измерение таких взаимодействий непосредственно в клеточном масштабе является проблемой, которая должна быть решена для оптимизации фермента каталитическая активность и lignocellulose предварительной обработки4.

Фюрстер (или флуоресценция) резонансная передача энергии (FRET) измерения является методом выбора осла биомолекул взаимодействия на месте. Эта не радиационная передача энергии может произойти между донором и принимающим фторфором, если они выполняют различные условия. Спектр донорских выбросов должен перекрывать, по крайней мере частично, спектр возбуждения. Таким образом, выбор фторофоров имеет решающее значение для таких экспериментов. Затем эффективность передачи снижается с шестой силой их расстояния5 и происходит только в том случае, если обе молекулы находятся в непосредственной близости (обычно в диапазоне нанометров). Другие непредвиденные обстоятельства могут изменить эффективность передачи, такие как дипольные наклонности, но смягчаются, если флюорофоры обладают гибкостью.

FRET можно измерить различными методами и подробные описания можно найти в литературе6,7. Короче говоря, основные методы опираются на: i) сенсибилизированные выбросы, при которых обеспечивается вариация флуоресценции допустимого эмиссии и обеспечивает в основном качественные результаты; ii) приемование фотоотбелечения, при котором флуоресценция донорских эмиссий измеряется до и после того, как принимает сятворщик фотоотбеление (в этом случае более точные оценки ФРЕТ могут быть получены, но требуют сильной лазерной энергии, применяемой к фиксированным образцам); и iii) измерение продолжительности жизни, которое уменьшается для донора в присутствии принимающего. Этот метод требует конкретных инструментов и позволяет точные и чувствительные измерения взаимодействия между фторфорами. Учитывая измерения FRET между флуоресцентными зондами и лигноцеллюлоза, основная трудность заключается в том, что lignocellulose не является одним хорошо характеризуется флюророфор: он имеет сильный родной и спектрально-широкий автофлуоресценции, в основном происходящих из лигнина, и зависит от вида биомассы8,9.

В настоящем документе мы предлагаем новую и оригинальную процедуру, адаптированную к участкам образцов древесины/растений. Этот метод на основе sFLIM открывает путь к количественным измерениям ФРЕТ между флуоресцентными зондами и лигнином в образцах лигноцеллюлозы.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка образца

ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательные шаги по подготовке образцов описаны на рисунке 1.

  1. Подготовка образцов растений
    1. Из деревянных стволов или фрагментов вырезать образцы длиной 1 см с лезвиями бритвы, не повреждая их структуру.
    2. Встраивай образец ы в полиэтиленовый гликоль (PEG) среды, путем погружения их в последовательных растворов увеличения концентрации PEG разбавленной в воде до достижения 100% PEG.
      1. Поместите образец под вакуум, чтобы удалить воду.
      2. Аккуратно перемешайте образцы в 30% v/v PEG на 24 ч.
      3. Аккуратно перемешайте образцы в 50% v/v PEG на 24 ч.
      4. Аккуратно перемешайте образцы в 100% ПЭГ на 24 ч при температуре 70 градусов по Цельсию (чистый ПЭГ твердый при комнатной температуре).
    3. Поместите образцы в капсулы при температуре 70 градусов по Цельсию (на горячей тарелке) и постепенно снижаем температуру до достижения комнатной температуры.
    4. Тщательно подготовьте 30-60 мкм толщиной плоские разделы из этих блоков PEG с помощью микротома и одноразовых лезвий.
    5. Соберите и смойте секции в трех последовательных ванн с водой в течение 5 минут, чтобы удалить ПЭГ из разделов.
  2. Подготовка флуоресцентного зонда
    1. Приготовьте буферный раствор фосфата 30 мМ при рН 6.0.
    2. Взвесить PEG rhand dextran родамин зонд порошок.
    3. Растворите порошок зонда в буфер с непрерывным перемешиванием в стеклянном флаконе на 1 ч в темноте при конечной концентрации 0,1 г/л.
  3. Окрашивание образцов растений
    1. Инкубировать секции с 500 л/с флуоресцентного зонда (см. 1.2.3) для 72 ч (без перемешивания) в пластиковой трубке (не более 3 секций на трубку) в темноте.
    2. Пикап раздел с кистью, адсорб буфер с чистым листом (избежать сушки раздела), а затем смонтировать инкубированные разделы между крышкой стекла и #1,5H крышкой.

2. Флуоресценция жизни и спектральной калибровки системы измерения

ПРИМЕЧАНИЕ: Полный рабочий процесс для измерения sFLIM представлен на рисунке 2.

  1. Определите ширину спектрального окна детектора sFLIM.
    1. Положите кристаллы мочевины в коробку культуры с 0.17 мкм стеклянного дна.
    2. Поместите коробку культуры на держатель образца микроскопа и выберите цель 20x.
    3. Выберите лазер Ti:Sa с длиной волны 900 нм и мощностью 2% и включите сканирование.
    4. Соберите второй гармонический сигнал на детекторе sFLIM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Второй гармонический сигнал излучается ровно на половину длины волн возбуждения 450 нм; в то время как мгновенно, эта мера также обеспечивает инструментальную функцию реагирования системы.
    5. Постепенно отрегулируйте длину волны лазерного возбуждения от 900 до 980 нм до тех пор, пока второй гармонический сигнал не будет собран во втором спектральном канале (462,5 нм).
    6. Определите длину спектрального окна (12,5 нм).
    7. Если спектральный диапазон отличается от ожидаемого, устранение неполадок, делая следующее.
      1. Отрегулируйте лазер до 910 нм.
      2. Переместите положение решетки с помощью колеса прокрутки для измерения второго гармонического сигнала только на первом канале (граница первого канала).
      3. Отрегулируйте лазер до 935 нм.
      4. Переместите положение решетки с помощью колеса прокрутки для измерения второго гармонического сигнала только на первом канале (граница второго канала).
  2. Калибровка общих спектрометрных каналов
    1. Вставьте зеркало на сцену микроскопа.
    2. Выберите видимый непрерывный лазер (458 нм, 1% мощности).
    3. Соберите сигнал отражения на детекторе sFLIM и проверьте, измеряются ли фотоны в соответствующем спектральном канале.
    4. Повторите шаг 2.2.2 и 2.2.3 со всеми доступными непрерывными лазерами (514 нм, 561 нм и 633 нм).
    5. Если спектральный канал отличается от ожидаемого, переместите положение решетки с помощью колеса прокрутки и повторите шаги 2.1 и 2.2.

3. Пример флуоресценции характеристики

  1. В спектрофторетре, оснащенном аксессуаром для держателей пленки (например, прибор jasco FP-8500), поместите образец секции растений (не инкубированный флуоресцентным зондом).
  2. Измерьте излучение флуоресценции обычно на диапазоне 300-600 нм, в то время как захватывающий образец обычно на диапазоне 250-550 нм.
  3. Участок флуоресценции интенсивности против возбуждения и длины волн выбросов, чтобы нарисовать 3D флуоресценции карте.
  4. Определите максимальную площадь возбуждения/выброса от участка.

4. Спектральное измерение ФРЕТ

  1. Автофлюоресценция калибровки
    1. Выберите цель 20x (NA: 0.8).
    2. Установите двухфотонное лазерное возбуждение на уровне 750 нм.
    3. Поместите пшеничную солому (WS) только раздел растения между слайдом и крышкой.
    4. Примените следующие параметры в программном обеспечении. Переключитесь в режим лямбды. Выберите спектральный детектор ChS с разрешением 9,7 нм. Выберите спектральный диапазон между 420 до 722 нм.
    5. Приобретите изображение.
    6. Определите пик выбросов донора (470 нм с этой установкой).
  2. Калибровка актора
    1. Поместите фюрересцентные зонды на основе родамина в коробку культуры со стеклянным дном 0,17 мкм.
    2. Приобретите изображение с той же настройкой.
    3. Определите пик эмиссии (570 нм с этой установкой).
  3. Определите спектральный диапазон с максимальным сигналом "WS alone" и не сигнал омнитель в качестве донора только выброс для sFLIM измерений (460-490 нм с этой установкой).
  4. Измерение образцов
    1. Поместите окрашенные раздел завода между слайдом и крышкой.
    2. Приобретите изображение с той же настройкой.
    3. Сохранить файл lsm.
    4. Качественно ассоциировать сильное событие FRET с уменьшением пика выбросов доноров по сравнению с "WS только выборка" и увеличение пика выбросов принимает по сравнению с образцом родамина.

5. измерения sFLIM

ПРИМЕЧАНИЕ: Для установки sFLIM, используемая система является настройкой домена sFLIM времени, как описано ранее10. Можно использовать вертикально-скопный микроскоп и разное время, коррелируемые одиночные картотеки с одним и конфокальный микроскоп, и протокол должен быть соответствующим образом адаптирован.

  1. Переключите систему в режим sFLIM.
    1. Установите конфокальный микроскоп, описанный в 4.1.1 и 4.1.2.
    2. Переключитесь в режим Non-Descanned в программном обеспечении для отправки флуоресцентных фотонов на детектор sFLIM.
    3. Установите приобретение sFLIM в режим Enable, чтобы позволить фотону рассчитывать на SPC150.
    4. Выберите коллекцию времени 30 s на SPC150.
    5. Убедитесь, что CFD находится между 1 х 105 и 1 х 106.
      ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что количество фотонов, измеренных на карте TCSPC, всегда меньше 1% от частоты лазерного возбуждения (в этой установке частота лазерного возбуждения составляет 80 МГц, а скорость обнаружения не может превышать 800 кГц в любом пикселе, чтобы избежать эффекта скопления11).
  2. Поместите раздел растения "WS alone" между слайдом и крышкой.
    1. Установите программное обеспечение в непрерывном режиме, чтобы лазерное сканирование.
    2. Выберите область измерения на образце.
    3. Нажмите Кнопка Начало на SPC150.
    4. Сохранить файл sdt.
    5. Повторите процесс, по крайней мере 10 образцов на условие.
  3. Поместите окрашенные раздел завода между слайдом и крышкой.
    1. Повторите шаги 5.2.1 - 5.2.5.

6. анализ sFLIM

  1. Выберите данные sFLIM, полученные в файле "WS alone" и импортируйте их в программное обеспечение SPCImage с помощью файла Импорт.
  2. Выберите параметры подгонки.
    1. Из варианта Модель, выберите Неполные мультиэкспоненциалы: 12,5 нс.
    2. Из варианта Предпочтения, выберите Вычислить инструментальный ответ автоматически.
    3. Из правильного меню основной панели выберите модель 2 экспоненциального соответствия:
      figure-protocol-1
  3. Для каждого канала нанесите примерочную модель и сохраните параметры подгонки на электронную таблицу(1,t,t1,t2).
  4. Для сравнения между каналами и экспериментами вычислите среднее время жизни флуоресценции в электронной таблице (Tm):
    figure-protocol-2
  5. Рассчитайте средний срок службы для всех образцов (не менее 10) во всех каналах.
    1. Проанализируйте Тм на донорских каналах (от 1 канала до 3: 460-490 нм) и определите выделенный канал (канал 2, соответствующий 467,5 - 480 нм), который показывает наивысший фотон-номер и соответствует максимальному выбросу лигнина. Значения из канала 2 должны использоваться в шаге 6.7.
  6. Выберите данные sFLIM, полученные на окрашенных WS, и импортируйте их в программное обеспечение SPCImage.
    1. Повторите шаги 6.1-6.4.
  7. Рассчитайте эффективность FRET EFRET для донора в предыдущем выбранном канале WS Alone (TmD) и из витражей образца растений (TmDA):
    figure-protocol-3
  8. Сравните значения sFLIM и EFRET между WS и образцом.
    1. Рассмотрим положительное EFRET, связанное с однородным снижением продолжительности жизни между WS и выборкой, который будет проанализирован как событие FRET (см. репрезентативные результаты и работы Spriet et al.12 и Terryn et al.10 для получения подробной информации).
    2. Рассмотрим пожизненное снижение распределены по-разному, чтобы быть связано с сочетанием уровня уплотнения ФРЕт и лигнин и не интерпретировать как молекулярные взаимодействия.
    3. Рассматривайте отсутствие пожизненных изменений как отсутствие измеримого сигнала FRET, но не как отсутствие взаимодействия с лигнином

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы продемонстрировать способность sFLIM вскрывать молекулярные взаимодействия между лигнином и флуоресцентно помеченными молекулами, мы сначала использовали три различных образца(рисунок 3):родная пшеничная солома (WS), родная пшеничная солома, инкубированная PEG с тегами родамина (PR10), и родная пшеничная солома с экстран с родамином (DR10). PR10, как известно, взаимодействуют с лигнином в то время как DR10 должен быть инертным13,14,15. кривые sFLIM(рисунок 3, верхняя часть) показывают некоторые изменения, которые могут быть достигнуты между эталонной выборкой (WS) и двумя случаями взаимодействия (DR10 и PR10). Действительно, можно сначала легко заметить увеличение флуоресценции в спектральных регионах, соответствующих диапазону выбросов родамина. Тщательное наблюдение за тремя кривыми распада фотона первого канала также показывает более сильный перегиб для DR10, чем для PR10. После установки кривых распада фотонов и расчета каждого канала означает продолжительность жизни флуоресценции, подпись FRET становится более очевидной(рисунок 3,внизу). Действительно, в то время как продолжительность жизни флуоресценции в качестве альтернативы увеличивается и уменьшается вдоль спектра флуоресценции для образца WS, четкая подпись ФРЕТ наблюдается как для PR10, так и для DR10 с: 1) постоянное значение продолжительности жизни в канале выбросов только для доноров (3 первых канала, в синем); и 2) увеличение продолжительности жизни флуоресценции в спектральном канале, что соответствует увеличению вклада высокой жизни донорского фторофора.

После того, как однозначный FRET был определен, сравнение лигнина флуоресценции жизни (канал 2) позволяет количественное уменьшение продолжительности жизни между WS (0,47 нс), DR10 (0,42 нс) и PR10 (0,36 нч) и, таким образом, показывает молекулярные взаимодействия между лигнином и как PR10, так и DR10 с более сильным сродством к PR10.

Чтобы проиллюстрировать актуальность этого метода для количественной оценки различных уровней взаимодействия, мы выбираем три других образца, имитирующих доступность ферментов на обработанных образцах растений: обработанный кислотой WS (AWS), в сочетании с PR двух контрастных молекулярных весов 5 kDa и 20 kDa (PR5 и PR20). После тщательного осмотра подписей sFLIM, лигнин флуоресценции жизни извлекается(рисунок 4). Как указывалось ранее, срок службы лигнина флуоресценции может быть изменен его окружающей среды16,17. После кислотной обработки показатели продолжительности жизни флуоресценции в AWS (0,28 нс) становятся ниже, чем ранее измеренные для WS (0,47 нс), что подтверждает требование процедуры sFLIM для однозначного толкования снижения продолжительности жизни и необходимость отрицательного контроля для каждого проверенного состояния. Как и ожидалось, при добавлении PR в AWS наблюдается сильное снижение продолжительности жизни, в то время как он взаимодействует с лигнином. Кроме того, взаимодействие сильнее с PR5 (0,14 нс) по сравнению с PR20 (0,16 нс), что согласуется с их гидродинамическим радиусом измерения (2,3 нм и 4,8 нм для PR5 и PR20, соответственно), вызывая различные стериотические ограничения и, следовательно, более высокую доступность PR5 к лигнину.

Оба эксперимента демонстрируют релевантность этого метода для тонкой оценки взаимодействия лигнина с ферментами, в зависимости от их размера и образцов растений перед обработкой.

figure-results-1
Рисунок 1: Различные этапы подготовки образцов. Пшеничная солома (WS) (A) сначала уменьшается в размерах (B), которые будут внедрены в среду PEG(C). Блок разрезается с помощью микротома, оснащенного одноразовыми лезвиями(D). После мытья, в результате разделы (E) помещаются для инкубации в PEG или dextran помечены-родамин раствор (F). Маркированные секции устанавливаются для измерений sFLIM(G). Шкала баров 2 см(A), 1 см (B и C), 200 мкм (E и G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Полный рабочий процесс спектральных измерений взаимодействия на основе ФРЕТ. На рисунке представлена установка, сочетающая интенсивность спектральной флуоресценции и измерения продолжительности жизни. Спектральные флуоресценции изображения приобретаются с помощью конфокального микроскопа, и последовательно флуоресценции жизни для каждого спектрального диапазона измеряются с детектором sFLIM. Анализ кривых распада фотонов позволяет точно определить взаимодействия между образцом и молекулами, представляющими интерес. Калибровки должны быть обработаны, чтобы избежать артефактов. Во-первых, детектор sFLIM должен быть откалиброван в спектре, и его инструментальная функция реагирования должна быть проверена. Во-вторых, сложный аутофлуоресценционный сигнал должен быть точно откалиброван для каждого образца, чтобы определить срок службы флуоресценции в каждом канале перед добавлением молекулы-приемника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Представитель sFLIM измерений. sFLIM кривые (верхняя панель) были приобретены на родной пшеничной соломы (WS), WS инкубировали с PEG помечены родамина (WS-PEG) и родной пшеничной соломы с декекроном помечены родамина (WS-DEX). Для каждого образца кривые sFLIM были оснащены двухэкспоненциальной моделью распада, и средний срок службы флуоресценции был рассчитан для каждого канала (нижняя панель). Образцы WS-PEG и WS-DEX представляют собой снижение срока службы флуоресценции в канале, соответствующем только автофлуоресценции (три первых бара), связанные с увеличением продолжительности жизни канала, соответствующего смешанному излучению автофлюоресценции и родамина. Такое поведение характерно для события FRET между лигнином и родамином помечены молекул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Анализ продолжительности жизни флуоресценции канала, соответствующий аутуфлуоресценции лигнина. После проверки события FRET, основанного на подписи sFLIM, средний срок службы флуоресценции измерялся на кислой WS (AWS), в сочетании с PR5 или PR20 (5 kDa и 20 kDa, соответственно). В то время как оба PR-образца представляют собой пожизненное снижение, меньше е-менее характеризуется более сильным сокращением продолжительности жизни, что свидетельствует о более сильном молекулярном взаимодействии с лигнином. Таким образом, метод достаточно чувствителен, чтобы различать оба (средняя стоимость и стандартная ошибка представлены, n'gt;10 на условие). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Коррелирование измерений флуоресценции и спектра выбросов позволяет сочетать преимущества обоих методов. Действительно, спектральные измерения сами по себе не имеют чувствительности и остаются качественными. С другой стороны, срок службы флуоресценции является методом выбора для традиционных количественных измерений FRET, но было продемонстрировано, что лигнин аутфлуоресценции может варьироваться в зависимости от состава лигнина и окружающей среды16. Таким образом, взаимодействия лигнина с принимающим или лигнином структурных изменений не могут быть дискриминированы, поскольку они оба приводят к пожизненному снижению. Как показано, разработанный метод обеспечивает недвусмысленное, чувствительное и количественное измерение взаимодействий между молекулами лигнина и принимая в растительных секциях. Даже если различные этапы метода были тщательно оптимизированы, следует проявлять осторожность в следующих моментах.

Что касается образцов, то качество секции растений имеет решающее значение для обеспечения вфокусайсъемки. Следует строго соблюдать различные шаги для встраивания ПЭГ. Окончательный шаг стирки имеет важное значение для обеспечения не вмешательства от ПЭГ, оставшихся в образцах. Кроме того, концентрация буфера и рН должны быть строго идентичны для всех измерений, так как любое изменение может оказать сильное влияние на свойства флуоресценции.

Измерение продолжительности жизни также может быть деликатным. Флуоресценция жизни донора может быть нестабильной, например, из-за высокого возбуждения. В таком случае, настройка лазерной мощности и зум может исправить эту проблему. Другим известным источником артефактов в измерениях TCSPC является накопление фотона пульса. Действительно, TCSPC не может измерить скорость двух фотонов, испускаемых между теми же двумя лазерными импульсами. В то время как образцы растений очень структурированы, флуоресценция не однородна и может привести к скрытому эффекту свайного импульса. В то время как количество фотонов в секунду остается ниже 1% предела возбуждения, оно может быть выше в некоторых областях выборки. Для того чтобы не быть экспериментами pileup, измерять продолжительность жизни флуоресценции дарителя на по-разному потоке фотона можно рассматривать. Если продолжительность жизни увеличивается, в то время как поток уменьшается, эффект скопирования изменяет измерения. Оптимальный поток фотона достигается при стабильности жизни донора.

Что касается анализа кривой распада sFLIM, мы рекомендуем полагаться на каждую индивидуальную кривую, чтобы убедиться, что модель точно описывает измерения. Если это не так, сначала убедитесь, что ни один из ранее упомянутых артефактов не повредил данные. Затем, шаг 2.1.4 обеспечивает инструментальную функцию реагирования (IRF) системы. Если IRF представляет некоторые аномалии, оптимизировать оптический путь, чтобы свести их к минимуму. Также можно использовать измеренный IRF для установки во время этапа 6.2. Наконец, степень свободы подходящей модели может быть увеличена до трехэкспоненциального распада в шаге 6.2. Тем не менее, количество фотонов, необходимых для индивидуальной жизни и пропорции определения высока, и поэтому рекомендуется только использовать их для достижения более стабильной средней жизни от шага 6.4. Более исчерпывающая информация о FLIM, его характеристика18, sFLIM и его применение12 в частности лигнин10, можно найти в литературе.

Хотя это и сложно, измерения FRET в тканях растений с использованием родной автофлуоресценции показывает некоторые преимущества. По сравнению с измерениями FRET, проведенными на живых тканях, в которых исследования взаимодействия между биомолекулами часто требуют генной инженерии, чтобы выразить внутренние флуоресцентные маркеры, лигнифицированные ткани растений, как те, которые представлены здесь, предлагают естественные автофлюоресценции, и натримы партнера флуоресцентные зонды могут быть легко добавлены, экономя много времени. Однако, в зависимости от проанализированных видов растений и от возможных предварительных процедур, аутофлуоресценции, вероятно, будет изменен, так что она должна быть тщательно охарактеризована и фторофора, используемого в качестве зондов, возможно, потребуется адаптировать.

Метод sFLIM должен применяться к флуоресцентным зондам, не имеющим каталитической активности (PEG и dextran). В рамках гидролизового лигноцеллюлозы растений могут быть выполнены взаимодействия ферментов в различных образцах биомассы, что, возможно, приведет к определению влияния локализации (клеток и тканей) на силу взаимодействия. Следующим шагом оптимизации станет автоматизация шага анализа. Действительно, при достаточном количестве проанализированных данных можно было бы развернуть процедуру анализа на основе машинного обучения для автоматизированного анализа фенотипа, что повысило бы его удобство для быстрого скрининга эффективности фермента биомассы. Кроме того, sFLIM не требует фиксации образца и может быть легко применен к динамическим исследованиям взаимодействия фермента-лигнина. Такой уникальный метод, вероятно, будет направлять стратегию ферментостроения и предобработку биомассы для оптимизации валоордизации лигноцеллюлозы.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фанни Лоран (FARE) тепло поблагодарила за подготовку фигур. Федерация исследований FRABio (Лилльский университет, CNRS) признана за обеспечение технической среды, способствующей достижению этой работы. Финансирование было получено от Национального исследовательского агентства Франции (проект LIGNOPROG ANR-14-CE05-0026).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Конфокальный микроскопZEISSLSM 710 NLOдля конфокальной визуализации
тонкая щеткадля сбора срезов
стеклянные флаконыдля инкубации
высокоточные микроскопы чехлы 170+/-5&микро; m n° 1,5#Marienfeld0107032saled by Dutscher s.a во
Франции Инфракрасный импульсный лазерCOHERENTCHAMELEON VISIONДля возбуждения образцов
Micropipette Research Plus monochannel 20-200µ LEppendorfс соответствующими наконечниками
Micropipette Research Plus monocanal 2-20µ LEppendorfс соответствующими наконечниками
предметные стекла микроскопа ок. 76 x 26 мм шлифованные края матового концаThermo Fisher ScientificLR45D
микротомные лезвия одноразовые (упаковка 50 шт)Agar ScientificT5024saled by Oxford Instruments во Франции
mPEG-Rhodamine, 10 кДаCreative Peg WorksPSB-2263
mPEG-Rhodamine, 20 кДаCreative Peg WorksPSB-22642
mPEG-Rhodamine, 5 кДаCreative Peg WorksPSB-2264
лакдля ногтей для монтажа
pH-метра пять easy плюсMettler toledoFEP20с электродом
поли (этиленгликоль) средний моль wt 1450Merck (sigma-Aldrich)P5402-1кгдля закладки образца
лезвия бритвы, лезвия с одной кромкой, нержавеющая сталь, коробка 100Agar ScientificT586для приготовления фрагментов от Oxford Instruments во Франции
ротационный микротомMicrom MicrotechHM 360
sFLim детекторBECKER-HICKLSPC 150для пожизненного сбора
дигидрофосфата натрия дигидрат NaH2PO4, 2H2OMerck (sigma-Aldrich)71500для буферный раствор
натрия фосфат диосновной дигидрат Na2HPO4,2H2OMerck (sigma-Aldrich)30435-1кгдля буферного раствора, старый ссылочный, новый 71643-1кг
тетраметилромамин изотиоцианат-декстран 10 к DaMerck (sigma-Aldrich)R8881-100мг

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Inouye, H., et al. Multiscale deconstruction of molecular architecture in corn stover. Scientific Reports. 4, 3756(2014).
  2. Li, X., Zheng, Y. Lignin-enzyme interaction: Mechanism, mitigation approach, modeling, and research prospects. Biotechnology Advances. 35 (4), 466-489 (2017).
  3. Vogel, J. Unique aspects of the grass cell wall. Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 301-307 (2008).
  4. Lynd, L. R. The grand challenge of cellulosic biofuels. Nature Biotechnology. 35, 912(2017).
  5. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6, 103-110 (1995).
  6. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  7. Pietraszewska-Bogiel, A., Gadella, T. W. J. FRET microscopy: from principle to routine technology in cell biology. Journal of Microscopy. 241 (2), 111-118 (2011).
  8. Herbaut, M., et al. Multimodal analysis of pretreated biomass species highlights generic markers of lignocellulose recalcitrance. Biotechnology for Biofuels. 11, 52(2018).
  9. Chabbert, B., et al. Fluorescence techniques can reveal cell wall organization and predict saccharification in pretreated wood biomass. Industrial Crops and Products. 123, 84-92 (2018).
  10. Terryn, C., Paës, G., Spriet, C. FRET-SLiM on native autofluorescence: a fast and reliable method to study interactions between fluorescent probes and lignin in plant cell wall. Plant Methods. 14 (1), 74(2018).
  11. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Cell Structure and Function by Microspectrofluorometry. Kohen, E. , Academic Press. 99-117 (1989).
  12. Spriet, C., et al. Correlated fluorescence lifetime and spectral measurements in living cells. Microscopy Research and Technique. 70 (2), 85-94 (2007).
  13. Donaldson, L. A., Newman, R. H., Vaidya, A. Nanoscale interactions of polyethylene glycol with thermo-mechanically pre-treated Pinus radiata biofuel substrate. Biotechnology and Bioengineering. 111 (4), 719-725 (2014).
  14. Herbaut, M., Zoghlami, A., Paës, G. Dynamical assessment of fluorescent probes mobility in poplar cell walls reveals nanopores govern saccharification. Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 271(2018).
  15. Paës, G., Chabbert, B. Characterization of arabinoxylan / cellulose nanocrystals gels to investigate fluorescent probes mobility in bio-inspired models of plant secondary cell wall. Biomacromolecules. 13, 206-214 (2012).
  16. Donaldson, L. A., Radotic, K. Fluorescence lifetime imaging of lignin autofluorescence in normal and compression wood. Journal of Microscopy. 251 (2), 178-187 (2013).
  17. Auxenfans, T., Terryn, C., Paës, G. Seeing biomass recalcitrance through fluorescence. Scientific Reports. 7, 8838(2017).
  18. Waharte, F., Spriet, C., Héliot, L. Setup and characterization of a multiphoton FLIM instrument for protein-protein interaction measurements in living cells. Cytometry A. 4, 299-306 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

sFLIMFRET

Похожие статьи