Для выявления и характеристики ингибиторов двух нуклеозидных ферментов рибогидролазы на основе ЯМР были разработаны анализы активности на основе ЯМР. Протоколы предусмотрены для первоначальных анализов соединения на 500 мкм и 250 мкм, дозы ответ ные анализы для определения значения IC50, моющее средство счетчик аспогеанализции экрана, скачок разбавления счетчик анализы экрана, и анализы в E. coli целые клетки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
ЯМР-анализ ы активности для определения ингибирования соединения, IC50 Значения, Артефактная активность, и цельноклеточной активности нуклеозидных рибогидроласов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Спектроскопия ЯМР часто используется для идентификации и характеристики ингибиторов ферментов при обнаружении лекарств, особенно в контексте фрагментного скрининга. Анализы активности на основе ЯМР идеально подходят для работы при более высоких концентрациях испытательных соединений, необходимых для обнаружения этих более слабых ингибиторов. Динамический диапазон и дисперсия химических сдвигов в эксперименте NMR могут легко разрешить резонансы от субстрата, продукта и испытательных соединений. Это контрастирует со спектрофотометрическими анализами, в которых проблемы считывания интерференции часто возникают из соединений с перекрывающимися УФ-вис абсорбционными профилями. Кроме того, поскольку им не хватает региней репортера, одноэнзимные анализы ЯМР не склонны к сочетанию с ложными срабатываниями. Этот атрибут делает их полезными в качестве ортогоналовых анализов, дополняя традиционные анализы скрининга высокой пропускной их связи и анализы сортировки скамейки. Подробные протоколы предусмотрены для первоначальных анализов соединения на 500 мкм и 250 мкм, дозы-ответ анализы для определения значения IC50, моющее средство счетчик проверки экрана, скачок-разбавления счетчик анализы экрана, и анализы в E. coli целые клетки. Методы демонстрируются с использованием двух нуклеозидных ферментов рибогидролазы. Использование 1H IMR показано для пурина-специфического фермента, в то время как 19F NMR показано для пиримидина-специфического фермента. Протоколы, как правило, применимы к любому ферменту, где субстрат и резонанс продукта могут наблюдаться и отличаться спектроскопией ЯМР. Чтобы быть наиболее полезным в контексте открытия препарата, конечная концентрация субстрата должна быть не более 2-3x его Kм значение. Выбор эксперимента ЯМР зависит от ферментной реакции и доступных субстратов, а также от доступных приборов NMR.
Введение
Ядерная магнитно-резонансная (НМР) спектроскопия хорошозарекомендовала себя для характеристики и мониторинга ферментных реакций 1,2. Различия в химических сдвигов и связывая моделей используются для различения субстрата и резонансов продукта, а относительная интенсивность резонанса используется для количественной оценки процента реакции. Как потребление субстрата, так и создание продукта непосредственно наблюдаются в спектре ЯМР. Это контрастирует со спектрофотометрией или флуоресценцией спектроскопии, в которой время реакции указывается на изменение абсорбции, связанные с некоторыми химическими видами потребл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Первоначальные тестовые анализы на уровне 500 мкм и 250 мкм
- Подготовка субстрата и испытания соединения для реакций.
- Подготовьте запасные растворы субстрата (аденозин или 5-фтороридин) в воде и испытательном комплексе 50 мМ в дейтерном диметилсулькидоксиде (ДМСО). Обратитесь к разделу введения для концентрации субстратного раствора для использования.
- Добавьте 12 кл. субстрата (аденозин или 5-фтороридин) к каждой из четырех микрофуговных трубок мощностью 1,5 мл, 1-4.
- Добавьте 6 зЛ deuterated DMSO к трубам 1 (0 мин управления) и 4 (30 мин управления). Добавьте 6 зл испытательного соединения в трубку 2. Добавьте 3 Зл испытательн....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 2 показаны результаты тестирования двух соединений против AGNH с использованием 1H NMR следующих разделов 1. Реакция фермента наиболее легко наблюдается и количественно исчезновение аденозин синглет и дублет резонансов на 8,48 промилле и 6,09 промилле, соответственно, и появление аденина синглет резонанс на 8,33 промилле, как наблюдается в 30 мин контроля Спектра. При наличии соединения 500 мкм 1, ни один продукт не образуется, о чем свидетельствует отсутствие резонанса.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Описанные протоколы, как правило, применимы ко многим ферментам, при условии, что субстраты и/или продукты имеют разрешимые сигналы в спектре ЯМР. Однако крайне важно, чтобы концентрация субстрата была близка к значению Km и была достаточно высокой, чтобы быть обнаруженной в эксперименте ЯМР в разумные сроки. Концентрация субстрата не выше 2-3x значение Km является оптимальной для обнаружения конкурентоспособных, неконкурентоспособных и неконкурентоспособных ингибиторов
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим д-ра Дина Брауна за предоставление соединений из библиотеки фрагментов АстраЗенека и д-ра Дэвида Паркина за предоставление ферментов AGNH и UNH. Исследование, о которых сообщается в этой публикации, было поддержано Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний Национальных институтов здравоохранения под номером премии R15AI128585 до B. J. S. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно представляют официальные взгляды Национальных институтов Health.Research также поддерживается Гораций Г. Макдонелл Летний научно-исследовательский стипендий присуждается С. Н. М., Ландесберг семьи Стипендия присуждена J. A. G., ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| AGNH | Очищенный на собственном производстве | Н/Д | TVAG_213720 |
| UNH | Очищенный на собственном производстве | Н/Д | TVAG_092730 |
| Аденозин | Sigma | A9251 | |
| 5-фторуридин | Sigma | F5130 | |
| Диметилсульфоксид-D6 | Кембриджские изотопные лаборатории | DLM-10-100 | D, 99,9% |
| Моноосновной фосфат калия | Sigma | P0662 | |
| Двухосновной фосфат | калия Sigma | P3786 | |
| Хлорид калия | Sigma | P9541 | |
| Оксид дейтерия | Cambridge Isotope Labs | DLM-4-100 | D, 99,9% |
| Соляная кислота | Fisher Chemical | A144212 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| 3-(Триметилсилил)пропионовая-2,2,3,3,-d4 кислая натриевая соль (TSP) | Sigma | 269913 | D, 98% |
| 2,2,2-трифторэтанол-1,1-d2 | Sigma | 612197 | D, 99,5% |
| Пипетка | Gilson | F123602 | PIPETMAN Classic P1000 |
| Пипетка | Gilson | F123601 | PIPETMAN Classic P200 |
| Пипетка | Gilson | F123600 | PIPETMAN Classic P20 |
| Микрофуге Пробирки | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Конические пробирки | Corning | 352099 | |
| Микроцентрифуга | Eppendorf | 5418 | |
| Вихревой смеситель | Fisher Scientific | 02215365 | |
| ЯМР трубки | Norell | 502-7 | Или в зависимости от ЯМР |
| ЯМР спектрометр | Bruker | N Программное | AvanceIII500 |
| Prism | GraphPad | N/A | Версия 5.04 |
Ссылки
- Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
- Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
- Dalvit, C., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
