Методическая статья

Измерение распространения сосудистых гладких мышечных клеток с помощью нажмите химии

DOI:

10.3791/59930

⸱

30 октября 2019 г.

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Cell Biology, and Physiology, Wright State University, 2Department of Surgery, Boonshoft School of Medicine, Wright State University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Распространение является важной частью клеточной функции, и общие считывая используется для оценки потенциальной токсичности новых препаратов. Измерение пролиферации, таким образом, часто используется в клеточной биологии. Здесь мы представляем простой, универсальный метод измерения пролиферации, который может быть использован в клетках,приверженных и непридерживаться.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность клетки размножаться является неотъемлемой частью нормальной функции большинства клеток, и дисрегуляция пролиферации лежит в основе многих процессов заболевания. По этим причинам измерение пролиферации является общим инструментом, используемым для оценки функции клеток. Пролиферация клеток может быть измерена просто путем подсчета; однако это косвенное средство измерения распространения. Одним из распространенных средств непосредственного обнаружения клеток, готовящихся к разделению, является включение помеченных нуклеозидных аналогов. К ним относятся радиоактивный нуклеозидный аналог 3H-тимидин плюс нерадиоактивные нуклеозидные аналоги, такие как 5-бромо-2' deoxyuridine (BrdU) и 5-этинил-2 -deoxyuridine (EdU). Включение EdU обнаруживается по щелчку химии, которая имеет ряд преимуществ по сравнению с BrdU. В настоящем докладе мы предусматриваем протокол для измерения распространения путем включения Эду. Этот протокол включает в себя варианты различных считываний, а также преимущества и недостатки каждого из них. Мы также обсуждаем места, где протокол может быть оптимизирован или изменен для удовлетворения конкретных потребностей запланированного эксперимента. Наконец, мы касаемся способов, которыми этот базовый протокол может быть изменен для измерения других метаболитов клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Распространение является важнейшей частью клеточной функции1,2. Контроль распространения влияет на нормальные процессы, такие как развитие, и патологические процессы, такие как рак и сердечно-сосудистые заболевания. Гиперпластический рост сосудистых гладких мышечных клеток, например, считается предшественником атеросклероза3. Изменения в пролиферации клеток также используются для оценки потенциальной токсичности новых препаратов. Учитывая его широкое воздействие, измерение распространения является основой многих лабораторий, основанных на клеточной биологии.

Пролиферация клеток может быть измерена путем простого подсчета клеток, если популяция клеток, представляющих интерес, делится довольно быстро. Для более медленных растущих клеток количество клеток может быть менее чувствительным. Распространение часто измеряется путем включения помеченных нуклеозидных аналогов. Хотя золотой стандарт 3H-тимидин включения, многие лаборатории уходят от этого метода, учитывая наличие новых, нерадиоактивных альтернатив. К ним относятся цитоплазматические флуоресцентные красители, обнаружение связанных с клетками белков и включение нерадиоактивных нуклеозидных аналогов, таких как деоксюридин 5-бромо-2' (BrdU) и 5-этинил-2 --deoxyuridine (EdU)4.

Цитоплазматические красители, такие как carboxyfluorescein диацетат succinimidyl эфир (CFSE), обнаружить пролиферацию, потому что интенсивность красителя половинки каждый раз, когда клетка делит5. Этот метод обычно используется в цитометрии потока для неприсоединения клеток. Он не был использован много для приверженцев клеток, но с новым поколением изображений пластины читателей это может измениться. Обнаружение клеточного цикла связанных белков с помощью антител на основе методов (поток цитометрии, иммуногистохимии и т.д.) часто используется для тканей или неприсоединения клеток. Эти клетки / ткани должны быть исправлены и проницательны до окрашивания. Нуклеозидные аналоги BrdU и EdU похожи по подходу к 3H-тимидину, но без неудобства радиоактивности. Включение BrdU обнаруживается анти-BrdU антител, и поэтому клетки должны быть фиксированными и проницаемыми до окрашивания. Кроме того, клетки должны рассматриваться dNase подвергать эпитоп BrdU.

Включение EdU обнаруживается щелчком химии, в которой алкин и азид групп "нажмите" вместе в присутствии каталитического меди. Любая группа может служить в качестве биосинтетически включены молекулы или обнаружения молекулы4. Коммерчески доступные нуклеозидные аналоги имеют алкин группы прилагается. Таким образом, для анализов пролиферации алкининовый нуклеозидный аналог обнаруживается ацидом азида, спряженный к флуоресцентному красищу или другому маркеру. Включение EdU имеет ряд преимуществ перед BrdU. Во-первых, потому что алкин и азид группы не встречаются в клетках млекопитающих, это взаимодействие является весьма конкретным с низким фоном6. Поскольку обе группы малы, клетки не должны проходить денатурацию ДНК, чтобы разоблачить аналог нуклеозидов, как это требуется для BrdU7. Наконец, нажмите химии является весьма универсальным, и может быть использован для метаболической маркировки ДНК, РНК, белка, жирных кислот и углеводов8,9,10,11. Если метаболически помеченная цель интереса находится на поверхности клетки, живые клетки могут быть помечены12. Кроме того, клетки могут быть дополнительно обработаны для иммунофлуоресцентного окрашивания антителами.

Следующий протокол описывает использование edU включения и нажмите химии для измерения пролиферации в человеческих сосудистых гладких мышечных клеток(рисунок 1). Мы показываем три различных способа включения EdU могут быть измерены, репрезентативные результаты от каждого, и их преимущества и недостатки. Измерение пролиферации с помощью щелчка химии особенно полезно для приверженцев, медленнее растущих клеток. Кроме того, морфология клетки в хорошем состоянии и антитела на основе окрашивания также может быть выполнена.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Обнаружение EdU с использованием флуоресцентной этикетки

  1. Фондовые решения
    1. Подготовьте 5 мМ EdU бульонный раствор, добавив 12,5 мг EdU до 10 мл двойной дистиллированной H2O.
    2. Подготовка компонентов раствора маркировки: 200 мМ три (3-гидроксипропилтриазолметилметил) амина (THPTA) (100 мг в 1,15 мл H2O), 100 мМ CuSO4 (15,95 мг в 1 мл H2O; сделать свежий), 10 мМ Cy3 picolyl-azide (1M L L l L 5 мг В 1 м5 L L L 2 O; сделать свежий), 10 мм Cy3 picolyl-azide (15,9м мг вH5 , хранится в 5 qL aliquots при -20 градусах По Цельсия) и 1 М аскорбате натрия (200 мг в 1 мл Н2О; сделать свежим).
    3. Приготовьте раствор ризазурина в концентрации 0,15 мг/мл. Фильтр стерилизовать и хранить 1 мл aliquots при 4 градусах По Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Picolyl azide доступен спряженный с несколькими различными флюорами, биотином и пероксидазой хрена (HRP).
  2. Этикетка сосудистых гладких мышечных клеток (VSMC) с EdU.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Человек VSMCs были изолированы от подвздошных артерий через рост от explanted куски ткани. При выращивании в сыворотке крови свободных носителей с инсулином, трансферрин, селен эти клетки выражают VSMC маркеры smoothelin, гладкой мышечной миозина тяжелой цепи (SM-MHC) и SMC Зактин13.
    1. Плита сосудистых гладких мышечных клеток на 2 х 104/мл в Dulbecco в модифицированной среде Eagle (DMEM) в 96 хорошо пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки выращиваются при 37 градусах По Цельсия в гладких мышечных клеточных носителях с 2% сыворотки крупного рогатого скота плода.
    2. (Необязательно) Разрешить несколько часов на ночь для присоединения. Добавьте 20 акций resazurin l к каждой скважине. Инкубировать при 37 градусах По цельсии на 3 ч. Прочитайте сигнал флуоресценции в считывателе пластин (560ex,594em). Замените носители свежими DMEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным. Резазурин используется для нормализации числа клеток и учитывает хорошо хорошо изменчивость при покрытии14.
    3. Добавьте фосфатбуферный солен (PBS) или тромбоциты, полученный коэффициент роста (PDGF) 30 нг/мл до 3-6 скважин на обработку в начале культурного периода и инкубировать в течение 72 ч.
    4. Разбавить 5 мМ EdU запас до 1 мМ. Добавьте 2 qL к каждому колодцу (окончательная концентрация 20 мкм) за последние 24 ч периода культуры 72 ч. Не добавляйте EdU в один набор репликаток. Эти скважины будут использоваться для определения фоновой флуоресценции/ люминесценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность культуры и маркировки с EdU оптимизирована для гладких мышечных клеток, но, возможно, должны быть изменены в зависимости от типа клеток.
  3. Исправить клетки в параформальдегиде (PFA).
    1. Удалите носители и добавьте 150 л 4% PFA (в PBS) в колодец в течение 10 минут при комнатной температуре.
    2. Удалить PFA и добавить 150 л 1% полиэтиленгликоль терт-octylphenyl эфир (TX-100) (в воде) в колодец в течение 30 минут при комнатной температуре.
    3. Удалите TX-100, стиря три раза с помощью PBS.
      ВНИМАНИЕ: PFA является токсичным, ручка с осторожностью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Фиксированные ячейки могут храниться в PBS при 4 градусах Цельсия.
  4. Обнаружение включены EdU.
    1. Сделать решение маркировки (10 мл на 96 скважины, используя внутренние 60 скважин) непосредственно перед использованием путем добавления реагентов из стоковых растворов в следующем порядке: THPTA 20 зл, CuSO4 20 л, Cy3 picolyl azide 5 л, Na ascorbate 100 л к PBS для общего объема 10 мл.
    2. Удалить PBS из скважин и добавить 150 злифицирующих раствор для каждой скважины. Инкубировать 30 мин при 37 градусах По Цельсию. Чтобы обнаружить все ядра, добавьте 4",6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) к каждой скважине. Читайте на флуоресценции пластины читателя (Cy3 550ex, 570EM; DAPI 350ex, 470em) или изображение на микроскопе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Фиксированные и окрашенные клетки могут храниться в PBS при 4 градусах Цельсия и изображены на более позднем времени.

2. Обнаружение EdU с использованием люминесценции

  1. Полные разделы 1.1-1.3.
  2. Подготовка Tris-буферный солен с 0,1% полисорбат 20 (TBST).
  3. Блок колодцев.
    1. Добавьте 150 кл блокирующий буфер(Таблица материалов)к каждой скважине и инкубизируете в течение 90 минут при комнатной температуре.
    2. Удалите блокирующий буфер и промойте три раза с 200 Зл PbS.
  4. Обнаружение включены EdU.
    1. Сделать решение маркировки, как указано в шаге 1.4.1, заменив биотин picolyl азид для Cy3 picolyl азид.
    2. Вымойте скважины пять раз с 200 Л Л TBST, с встряхиванием, 3 мин на стирку.
    3. Утоление эндогенных пероксидаз с 150 л 0,3% H2O2 в течение 20 мин при комнатной температуре.
    4. Удалить H2O2 и вымыть пять раз с 200 Зл ТБСТ, с встряхиванием 3 мин на стирку.
    5. Разбавить стрептавидин-хандад пероксидаза (SA-HRP; 1:200) в TBST и добавить 50 л к каждой скважине. Инкубировать 1 ч при комнатной температуре.
    6. Вымойте пять раз с 200 Л TBST, с встряхиванием, 3 мин на стирку.
    7. Добавьте к каждому колодцу 50 кЛ хемилюминесцентного ферменто-связанного иммуносорбента (ELISA).
    8. Читайте сразу в плите читателя, способного обнаруживать люминесценцию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 2мы демонстрируем результаты трех различных экспериментов, измеряя распространение VSMC в ответ на PDGF. После выращивания клеток в средствах массовой информации, разработанных для SMCs, мы провели эксперимент в сыворотке крови бесплатно DMEM, чтобы устранить любые потенциальные последствия сыворотки или факторов роста на пролиферацию. На рисунке 2A мы сравниваем результаты того же эксперимента, используя флуоресцентное против люминесцентного считыван...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Включение EdU является простым, простым способом измерения пролиферации клеток; это особенно полезно для адептов клеток13. Наш протокол использует гладкие мышечные клетки, но он применим к любой клетке адепта (эпителиальная, эндотелиальная и т.д.). Хотя протокол не является сложным, одним из важнейших шагов является создание решения по маркировке – ингредиенты должны быть добавлены в перечисленный порядок. Кроме того, как хемилюминесцентные западные помарки, при использовании люминесценции считыва...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Кэти Кэрролл за техническую помощь. Мы также благодарим д-ра Дэвида Cool и Лаборатории анализа протеомики за обучение и предоставление считывателя пластин цитирования изображений Cytation. Эта работа была поддержана грантом Государственного фонда Райта (L.E.W.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5-этинил-2'-дезоксиуридинкарбосинтNE08701
биотин пиколил азидклик химия инструменты1167-5
CuSO4Fisher ScientificC1297-100G
Cy3 пиколилазидклик химия инструменты1178-1
Считыватель цитационных планшетовBiotek
EVOS МикроскопThermo Fisher Scientific Раствор
перекиси водородаSigma-Aldrich216763
Na аскорбатSigma-Aldrich11140-250G
NucBlue Фиксированные клеточные красители готовые зондыInvitrogenR37606DAPI ядерное окрашивание
Odyssey Блокирующий буфер
Li-Cor 927-40000Услуги параформальдегиднойэлектронной микроскопии15710
PBSFisher ScientificSH3002802
Sodium ChlorideSigma Life ScienceS3014-5kg
Streptavidin Хрен-пероксидаза ConjugateLife TechnologiesS911
Super Signal ELISA FemtoThermo ScientificPI137075ИФА субстрат
Synergy Plate ReaderBiotek
THPTAClick Chemistry Tools1010-100
Трис гидроксиметиламинеметана гидрохлорид (Tris-HCl)Fisher ScientificBP153-500
Triton X 100Bio-Rad1610407
20Fisher ScientificBP337-100

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
  2. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  3. Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
  4. Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
  5. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
  6. Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
  7. Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
  8. Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
  9. Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
  10. Izquierdo, E., Delgado, A. Click chemistry in sphingolipid research. Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).
  11. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  12. Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
  13. Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
  14. Stoddart, M. J. Mammalian cell viability: methods and protocols. , Humana Press. New York, NY. (2011).
  15. Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
  16. Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
  17. Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
  18. Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

EdUTX 100

Похожие статьи