Хлоропласты — это органеллы, определяющие растения1. Наряду со многими другими метаболическими, развивающимися и сигнальными функциями, хлоропласты отвечают за фотосинтез — процесс, при котором солнечная энергия используется для обеспечения клеточной активности жизни. Следовательно, хлоропласты необходимы не только для растений, но и для множества экосистем, зависящих от растений, а также для сельского хозяйства. Хлоропласты состоят из тысяч различных белков, большинство из которых кодируются ядром и импортируются из цитозоля, прежде чем быть внутренне направлены в один из нескольких чётко выраженных внутриорганеллярныхкомпартментов 1. Для более полного понимания развития и его функций, а также для реализации биотехнологических стратегий, связанных с манипуляцией хлоропластами, которые решают глобальные проблемы, связанные с продовольственной безопасностью или биоэнергетикой, необходимо определить таргетирование, локализацию и взаимодействие важных белков хлоропластов. Эта коллекция методов описывает набор критически важных и взаимодополняющих техник, которые могут быть использованы для достижения этих целей. Коллекция в основном сосредоточена на широко используемом модельном растении Arabidopsis thaliana (thale cress), но методы могут быть адаптированы и применены к другим организмам.
Коллекция включает описания двух различных методов анализа импорта белков, закодированных ядром, в хлоропласты через оболочку с двойной мембраной. Статья Линга иДжарвиса 2 описывает метод in vitro, при котором изолированные хлоропласты инкубируются с помощью радиоактивно маркированного прекурсорного белка. Степень, в которой хлоропласты поглощают белок-предшественник, определяется путем мониторинга изменения размера белка, возникающего в результате расщепления транзитного пептида (целенаправленной последовательности лидера), с помощью SDS-PAGE и фосфорной визуализации. Представленный метод является развитием подхода, который используется для изучения импорта белков хлоропластов in vitro на протяжении нескольких десятилетий 3,4 и включает дополнительные этапы, позволяющие оценить отзывчивость импортного оборудования к стрессовым условиям, испытываемымрастением 5. С другой стороны, статья Ли и др.6 описывает метод in vivo, основанный на временной экспрессии химерного прекурсорного белка, несущего флуоресцентный белковый домен, в целостных клетках (протопластах). В этом анализе степень импорта хлоропластных белков можно отслеживать двумя разными способами: путем мониторинга локализации и интенсивности флуоресцентного сигнала с помощью флуоресцентной микроскопии; а также анализ изменения размера белка, возникающие в результате расщепления транзитного пептида с помощью иммуноблоттинга. Эти два метода сильно взаимодополняют друг друга и могут давать убедительные результаты при совместном использовании впараллельной 5.
После того как белок был завезён через оболочку в хлоропласт и его транзитный пептид удалён, он может либо принять окончательную конформацию в строме (главном внутреннем водном отсеке органеллы), либо задействовать один из нескольких внутренних сортирующихпутей 1. Будучи местом расположения высоко обильных фотосинтетических комплексов, тилакоидные мембраны являются основным местом для такого внутреннего сортирования; На самом деле, таргетирование тилакоидных белков включает несколько механистически различных путей. Статья Ашера и др.7 описывает ряд методов in vitro, позволяющих изучать различные пути транслокации тилакоидных белков. Эти методы включают инкубацию изолированных тилакоидов с радиоактивно маркированным белком-предшественником и, в некоторых случаях, концентрированным стромовым экстрактом. Степень поглощения белка тилакоидами отслеживается с помощью расщепления сигнала и защиты белка от экзогенно применённой термолизин-протеазы с помощью SDS-PAGE и фосфорной визуализации. Конечно, тилакоиды — не единственный подкомпонент хлоропласта, и часто желательно иметь возможность оценивать и другие отделения. В этом отношении особенно важна статья Бушнака и др.8 , так как в ней описываются методы субфракционирования хлоропластов для получения высокочистых образцов, соответствующих мембранам оболочки, строме и тилакоидам. После подготовки эти фракции могут быть проанализированы с помощью иммуноблоттинга и/или масс-спектрометрии, чтобы получить обширную информацию о суборганеллярной локализации хлоропластныхбелков 9.
Что касается анализа взаимодействий белок-белок и мультибелковых комплексных сборок, в коллекции описаны две разные методологии. Статья Шанмугабаладжи и др.10 представляет метод аффинной очистки мультипротеиновых комплексов хлоропластов. Этот метод включает анализ трансгенных растений, экспрессирующих компонент интересующего комплекса, который был спроектирован для носителя метки аффинности (так называемый тандемный метка очистки аффинитета, или TAP-метка). Способность этой метки крепко связываться с иначе инертной матрицей используется в рамках стратегии очистки. Представленный метод сосредоточен конкретно на очистке механизма импорта хлоропластов белков (включающий мультибелковые комплексы, называемые TOC и TIC, встроенные в мембраныоболочки 1), но в принципе его можно адаптировать для изучения любых других мультибелковых сборок, присутствующих вхлоропластах 11. Статья Ранталы и др.12 описывает комплементарный подход к комплексной характеристике на основе электрофореза в нативных условиях. Техника, представленная здесь, включает освобождение фотосинтетических комплексов от очищенных тилакоидов с помощью мягких неионных детергентных средств, а затем их разделение с помощью синего нативного (BN)-PAGE. Первичное разрешение комплексов может сопровождаться вторым измерением электрофореза при условиях денатурирования, что позволяет визуализировать отдельные компоненты каждого комплекса, идентифицируемые в первом измерении. Как и метод TAP, этот нативный подход PAGE может быть успешно адаптирован для изучения других белковых комплексов ворганелле 13,14. При любом из этих подходов очищенные комплексы могут анализироваться различными способами, включая иммуноблотирование и масс-спектрометрию.
В совокупности статьи, включённые в этот сборник методов, представляют собой мощный набор взаимодополняющих методов, которые в сочетании с существующимиресурсами 15,16 могут быть использованы для значительного улучшения нашего понимания различных аспектов биогенеза и функции хлоропластов, особенно тех, что тесно связаны с протеомом органелляров. Поскольку хлоропласты отвечают за основную часть первичного фотосинтетического производства на земле, а также играют важную роль в реакции растений на окружающую среду (включая как биотические, так и абиотические стрессы), эти удивительные органеллы неизбежно останутся основным объектом фундаментальных и прикладных исследований по всему миру на долгие годы.