Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Извлечение кортизола из осетровых плавников и челюстных матрис

7.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59961

⸱

10 сентября 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Animal Life Sciences, Kangwon National University, 2Team of An Educational Program for Specialists in Global Animal Science, Brain Korea 21 Plus Project, Konkuk University, 3Persian Gesture, 4Department of Animal Science and Technology, College of Animal Bioscience and Technology, Konkuk University, 5Department of Animal Science, Animal Physiology, AgResearch, 6Faculty of Agriculture, Animal Science Department, Ferdowsi University of Mashhad

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании мы представляем протокол для извлечения кортизола из плавника и челюстной кости видов осетровых. Уровни фин и кортизола челюстной кости были дополнительно изучены путем сравнения двух стиральных растворителей, за которыми следуют анализы ELISA. Это исследование пилотировало осуществимость кортизола челюсти в качестве нового индикатора стресса.

Аннотация

Целью данного исследования было разработать методику извлечения кортизола из осетровых плавников с использованием двух стиральных растворителей (вода и изопропанол) и количественно определить любые различия в уровнях фин кортизола между тремя основными видами осетровых. Фины были собраны из 19 жертвенных осетровых, включая семь белуги(Huso huso),семь сибирских (Acipenser baerii), и пять севруга (A. stellatus). Осетровые были выращены на иранских фермах в течение 2 лет (2017-2018 гг.), а анализ добычи кортизола проводился в Корее (январь-февраль 2019 года). Челюсти из пяти H. huso также использовались для извлечения кортизола. Данные анализировались с помощью общей процедуры линейной модели (GLM) в среде SAS. Коэффициенты вариации внутри- и меж-асса составили соответственно 14,15 и 7,70. Короче говоря, метод извлечения кортизола включал мытье образцов (300 и 10 мг) с 3 мл растворителя (ультрачистая вода и изопропанол) дважды, вращение при 80 об/мин в течение 2,5 мин, высыхание промытых образцов при комнатной температуре (22-28 градусов по Цельсию) в течение 7 дней, дальнейшую сушку образцы с использованием бисера бисера на 50 Гц в течение 32 минут и измельчения их в порошок, применяя 1,5 мл метанола к сушеным порошка (75 х 5 мг), и медленное вращение (40 об/мин) в течение 18 н.ч. при комнатной температуре с непрерывным смешиванием. После извлечения, образцы были центрифугированы (9500 х г в течение 10 мин), и 1 мл супернатанта был перенесен в новую микроцентрифугую трубку (1,5 мл), инкубировали при 38 градусах Цельсия, чтобы испарить метанол, и проанализированы с помощью фермента связанных иммуносорбент анализа (ELISA) . Никаких различий в уровнях кортизола фина среди видов или в плавники и челюстной кости кортизола уровнях между мытья растворителей. Результаты этого исследования показывают, что матрица челюстной кости осетровых является перспективным альтернативным индикатором стресса для твердых матриц.

Введение

Кортизол является надежным индикатором стресса животных. Извлечение кортизола обеспечивает действительную основу для исследователей для мониторинга уровней стресса и общих закономерностей в стрессорах. Например, предыдущие исследования провели методологическую проверку измерений кортизола волос с использованием различных методов у людей1,2, обезьяны 3,4,крупного рогатого скота5,овец6,и золотая рыбка7,8. В видах рыб, кортизол измерения в матрицах, таких как весы, слизь кожи, кала, и кровь9 было показано, чтобы обеспечить информацию о здоровье рыбы. Когда отбор проб крови является проблематичным или весы отсутствуют, альтернативные матрицы для извлечения кортизола необходимы. В рыбе, альтернативные матрицы могут включать челюстную кость, твердую ткань, похожую на человеческий зуб10.

Разработка новых матриц и проверенных методов определения уровня стресса рыбы представляет особый интерес для икры промышленности, где осетр может испытывать длительное воздействие факторов экологического стресса11. Пол осетровых не может быть определен до 2 лет, а у осетровых нет чешуи. Потому что кортизол постепенно накапливается в твердых матриц во время стадии роста2,7,12, долгосрочные данные накопления кортизола из твердых матриц, таких как плавники и челюстные кости могут обеспечить понимание стресса на разных стадиях роста. В отличие от этого, уровни кортизола в крови обеспечивают снимок уровня стресса во время смерти и не может точно представлять стресс во время длительных условий воспитания13,14. С ростом конкуренции на рынке икры все более важной областью исследований становятся новые подходы к улучшению стрессовых условий для производства более здоровых яиц среди видов осетровых при длительном выращивании (8-12 лет и более лет). Из-за высокой стоимости осетровых, собранные образцы являются чрезвычайно дорогостоящими ($ 8000-15000 за взрослую рыбу в зависимости от видов и стадии роста), ограничивающим фактором для научно-исследовательских проектов. Однако разработка соответствующего метода извлечения кортизола из осетровых плавников и челюстных костей может быть с пользой применена как к системам рыбоводства, так и к дикой рыбе для улучшения качества и сбора осетровых яиц как для потребления, так и для потребления Сохранения.

Помимо предоставления надежных результатов6, выбор соответствующего метода извлечения кортизола имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы другие соединения, присутствующие в матрице во время подготовки образца, не смужают выход, что может привести к противоречивые результаты. Не менее важно определить, влияют ли уровень плавника и кортизола челюстной кости уровень гормонов в окружающей воде. Хаймбюрге и др.15 предположили, что ряд факторов может повлиять на уровень кортизола, включая возраст, пол, беременность, сезон, цвет12, и область тела, из которой кортизол извлекается16. Тем не менее, мало информации имеется о влиянии стирки растворителей на добычу кортизола в матрицах тела рыб8, и ни на эти эффекты у осетровых, за исключением осетровых яиц17.

Хотя анализ базовых уровней кортизола из плавников и челюстных костей осетровых требует, чтобы рыба была усыплена, этот подход не влечет за собой инвазивных методов, необходимых для взятия проб крови у живого осетра. Образцы фин и челюстной кости легко собираются, и извлечение из этих тканей может быть выполнено быстро. Аналогичным образом, экстракция гормонов и анализ являются простыми и требуют мало специализированного оборудования.

В этом исследовании мы представляем новую и легко применяемую технику для извлечения, мытья и определения кортизола из рыбных плавников и челюстных костей, с целью определения того, могут ли уровни кортизола, измеренные из этих матриц, надежно использоваться в качестве стресса Показатели. Преимущества этого метода включают простой и неинвазивный подход8, меньше вариации данных, и надежный выход1,6,8,17; этот метод применим к видам рыб без чешуи, такой как осетр. Техника требует забоя рыбы, выбора соответствующих растворителей для мытья2,4,правильной шлифовки образцов3,5,профессионального ферментосвязанного иммуносорбента (ELISA) применение5,7, и обширные знания о включении источников кортизола в твердые матрицы6.

Мы применили два различных растворителя стирки (ультрачистая вода и изопропанол) для получения базального кортизола в плавниках от трех видов осетровых: белуги (Huso huso), Сибирский (Acipenser baerii), и sevruga (A. stellatus ), в стандартных условиях окружающей среды для каждого вида. Челюсти H. huso также использовались для оценки стресса у осетровых. Это первое исследование для измерения уровня кортизола в осетровых челюстных костях. Результаты этого исследования позволят предоставить сравнительные данные кортизола для видов осетровых на ранней стадии роста (1 год) до определения пола.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Следующие экспериментальные процедуры и методы были одобрены Управлением по защите и этике животных Национального университета Канвондо, Чунчхон, Республика Корея.

1. Фин коллекция

  1. Захват осетровых осторожно с помощью сети, чтобы свести к минимуму травмы и стресс.
  2. Тщательно промыть рыбу пресной водой, а затем протрите поверхность тела абсорбирующим полотенцем перед эвтаназии.
  3. Ударить по голове рыбы с помощью пластикового молотка так, чтобы рыба была ошеломлена или потеряла сознание. Снимите голову ножом.
  4. Измерьте массу тела (г) и длину (см).
  5. После эвтаназии соберите образцы плавника, разрезая как можно ближе к телу с помощью стерилизованных хирургических ножниц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Индивидуальные, не переработанные абсорбирующими полотенцами должны быть использованы для каждой рыбы. Описательная статистика по видам, использованным в данном исследовании, была следующей: белуга осетр (H. huso): возраст No 18 и 2,1 месяца, масса тела - 2700 и 300 г, а длина тела - 55 и 5 см; Сибирский осетр(A. baerii): возраст 9,6 и 2,4 месяца, масса тела - 1750 и 250 г, а длина тела - 45 и 5 см; севруга осетр(A. stellatus): возраст No 14 и 1,3 месяца, вес тела - 1000 и 100 г, а длина тела - 65 и 5 см.

2. Подготовка финдля извлечения кортизола

  1. Поместите образцы плавника (один образец на ткань: 3 г) на лабораторную бумагу для взвешивания (107 мм и 210 мм) и высушите при комнатной температуре в течение нескольких дней до высыхания.
  2. Оберните образцы в листы алюминиевой фольги, поместите в маркированные полиэтиленовые пакеты и перенесите в лабораторию.
  3. Храните образцы в холодильнике для дальнейшего использования, включая мойку, извлечение кортизола, сушку и анализ ELISA(рисунок 2).

3. Анализ фин кортизола

  1. Откалибровать цифровую аналитическую шкалу (точность: 0.0001) и взвесить 300 и 10 мг образцов с вешной бумагой на сковороде шкалы.
  2. Вымойте образцы.
    1. Перенесите каждый образец в 15 л конической полипропиленовой трубки. Добавьте 3 мл изопропанола к каждой трубке, используя одноканальный пипетку мощностью 5000 л.
    2. Поверните трубки при 80 об/мин в течение 2,5 мин, чтобы промыть кортизол и удалить любое потенциальное внешнее загрязнение. Повторите эту процедуру дважды.
    3. Воздушно-сухие промытые образцы при комнатной температуре (22-28 градусов по Цельсию) в течение 7 дней.
    4. Повторите процедуру мытья, используя ультрачистую воду в качестве стирального средства.
  3. Извлеките челюстную кость из ткани тела с помощью костяных щипцы. Нанесите шаги 1.5-3.2.4 на образцы челюстной кости.
  4. Взвесьте (75 х 5 мг) сушеные образцы плавника или челюстной кости и измельчите с помощью бисера на 50 Гц в течение 32 мин.
    1. Доставьте 1,5 мл метанола в каждую трубку, содержащую порошковый плавник или челюстную кость с помощью 1000-й пипетки. Поместите образцы на трубчатый ротатор при медленном вращении (40 об/мин) в течение 18 ч при комнатной температуре для извлечения кортизола с непрерывным смешиванием.
  5. После извлечения кортизола, центрифуга образцов на 9500 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. После центрифугации соберите верхний органический слой, содержащий кортизол (1 мл) из каждого образца и поместите его в отдельную микроцентрифугную трубку размером 1,5 мл.
    1. Высушите образцы инкубации при 38 градусах Цельсия, чтобы испарять метанол. Держите извлеченные образцы кортизола под дымом капот на ночь, чтобы метанол рассеяться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кортизол-содержащий слой, как правило, желтоватого цвета.

4. Обнаружение фин кортизола

  1. Отморозка сушеных плавников или образцов челюстной кости при комнатной температуре 1,5 ч до использования комплекта ELISA.
  2. Добавьте 400 л фосфатного буфера, вихря и центрифуги при 1500 х г в течение 15 мин.
  3. Запустите каждый образец (25 л) в дублировать, чтобы улучшить точность и надежность анализов. Удалите любые данные за пределами стандартной кривой в качестве выбросов.
  4. Установите микроплитустого считывателя до 450 нм, затем установите мкг dL-1 и прочитайте оптическую плотность пластины.
    1. Используйте программное обеспечение микроплиты с четырехпарал-нелинейной кривой регрессии. Преобразуйте уровни кортизола в образцах, полученных из программного обеспечения, в pg mg-1 с помощью следующего уравнения:
      F 10,000E (A/B) (C/D),
      где F - окончательное значение уровня кортизола плавника в (pg mg-1), E - объем (мл) буфера асссе, используемого для воссоздания высушенного экстракта, А - концентрация (мкг dL-1),предусмотренная выходом асссе, B - вес (мг) плавника, подвергаемый дополнительному стека, C - объем (мл) метанола, добавленного в порошковый плавник, и D - объем (мЛ) метанола, извлеченного из экстракта и впоследствии высохшего3.

5.Статистический анализ

  1. Разделите каждый образец на два подобразца до процедуры стирки, а затем запустите дубликат во время анализа комплекта ELISA (2 - 2 и 4 наблюдения за образцом) для повышения мощности теста и надежности результатов.
  2. Сравните эффекты двух стиральных растворителей и их взаимодействия, применяя общую линейную модель (GLM) процедуру в среде программного обеспечения SAS к данным измерений18.
  3. Различия в тестах между средствами, использующими тест Tukey, на уровне значимости p qlt; 0.05. Примите 0,05 зл/ р/с; 0,10 как свидетельство тенденции, а не как существенную разницу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представленная методика извлечения кортизола была разработана и подтверждена в данном исследовании с использованием трех видов осетровых. Уровни кортизола, полученные с помощью ультрачистой воды и изопропанола, как стиральные растворители были сопоставлены(рисунок 2). Кортизол из челюстных костей H. huso был исследован, чтобы определить, могут ли осетровые челюстные кости использоваться в качестве альтернативной матрицы плавников. Эффекты стирки раст...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Осетр иногда называют "живой ископаемого", потому что он показал несколько адаптаций на протяжении последних тысячелетий. Осетровый род Acipenser содержит 27 видов, которые производят икру; однако, три вида (белуга, баэрии и севруга) производят большую часть мирового предложения икры. Осетрина уязвимы для чрезмерного рыболовства и вмешательства в их естественную среду обитания и поэтому находятся под угрозой исчезновения, чем любая другая группа видов. Осетрина относится к древнейшей группе живых позвоночных, ко...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.

Благодарности

Эта работа была проведена при поддержке Программы совместных исследований в области сельского хозяйства науки и развития технологий (название проекта: Анализ изменения продуктивности животноводства с изменением климата, Проект No. PJ012771), Управление развития сельских районов, Республика Корея. Кроме того, это исследование было поддержано грантом (Нет. PJ01344604) от команды по питанию и физиологии животных, Национальный институт наук и животных, RDA, Сеул, Республика Корея. Авторы с благодарностью признают персидского жеста генеральный директор Мохаммад Хасан Салманзаде и его команда, которая предоставила рыбу из трех видов осетровых рассмотрены в этом исследовании.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Утилизация латексных хирургических перчатокAnsell63754090
Platform весы-электронные весы весом 100кгBaskoolnikoo101 EM
Серологическая пипетка для доставки до 24 млBecton Dickinson Falcon35-7550
Micro планшетный ридер с длиной волны 450 нм и 490 до 492 нм Реагентные фильтрыBioTek8041000
Резервуары для реагентовBrandTech703459
Пластиковый пакет для хранения на молнии Cleanwrap30 см x 100 м
Изопропиловый спиртДэчжун химикаты и Металлы 5035-4400
Метиловый спиртТэчжун химикаты и Металлы 5558-4100
Вращатель труб - MX-RL-ProDLAB Scientific 824-222217777
Прецизионный дозатор для подачи 1,5 и 10 млEppendorf Research PlusM21518D
  Прецизионный пипетка для подачи 15 и 25 мкм; LEppendorf Research PlusR25623C
Бумага для взвешивания (107 x 210 мм)Fisherbrand09-898-12B
Колотушка для бисера, 50/60 Гц 2AGeneReach Biotechnology Corptp0088
Пластинчатый вращатель с орбитой 500 об/минHangzhou Miu Instrument MU-E30-1044
Одноразовые полипропиленовые трубки объемом не менее 24 млHyundai Micro H20050
Вытяжной шкафKwang Dong IndustrialKD 901-22128175
Микроцентрифуга мощностью 1500 x гLabo Gene  9.900.900.729
Мини вихревой смесительLMSVTX-3000L 
Рулон алюминиевой фольги Lotte Lotte АлюминиевыеB0722X5FK5
цифровые весыMettler Toledo   ME204
Сверхчистая водаMDMMDM-0110
Наконечники для пипетокNeptune ScientificREF 2100.N
Большая сеткадля рыбы Пруд H2OHoz135 
Набор кортизола для слюныSalimetrics1-3002-4
Щипцы для резки костейSankyo26-188A
многоканальная пипетка для доставки 50 мкм; L и 200 μ LVITLAB18A68756
ПолотенцеYuhan Kimberly1707921546
Папиросная бумага (107 × 210)Yuhan Kimberly41117
Прецизионная

Ссылки

  1. Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
  2. Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
  3. Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882(2014).
  4. Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
  5. Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
  6. Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
  7. Brossa, A. C. Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , Faculty of Veterinary Medicine, Universitat Autonoma de Barcelona. Ph.D. dissertation (2018).
  8. Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
  9. Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
  10. Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240(2016).
  11. Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
  12. Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
  13. Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
  14. Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411(2015).
  15. Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
  16. Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
  17. Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
  18. SAS. 1999. SAS. User's Guide (Version 8.01 Edition). , SAS Inst. Inc. Cary, NC, USA. (1999).
  19. Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
  20. Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Извлечение кортизола из осетровых плавников и челюстных матрис
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.