Здесь мы описываем протокол о введении генного нокаута во внеклеточном аматиготе трипаносома крузи, с использованием системы CRISPR/Cas9. За фенотипом роста может последовать либо подсчет клеток агостической культуры аматигота, либо распространение внутриклеточного амастигота после вторжения клеток-хозяев.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Представляя ген нокаут непосредственно в Amastigote Этап trypanosoma cruzi Использование CRISPR / Cas9 системы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Трипаносома крузи является патогенным протозоанским паразитом, который вызывает болезнь Шагаса в основном в Латинской Америке. Для того, чтобы определить новый целевой препарат против T. cruzi, важно проверить существенность гена-митариона в стадии млекопитающих паразита, амастигот. Аматиготы T. cruzi реплицируются внутри клетки-хозяина; таким образом, трудно провести нокаут эксперимент, не проходя через другие этапы развития. Недавно наша группа сообщила о состоянии роста, в котором амастигот может реплицировать аксенически до 10 дней, не теряя своих амастигот-подобных свойств. Используя эту временную апорную культуру амасигота, мы успешно внедрили GРНС непосредственно в Cas9-expressing amastigote, чтобы вызвать генные нокауты и проанализировали их фенотипы исключительно в стадии амасигота. В этом отчете мы описываем подробный протокол для производства in vitro, полученных внеклеточными амазиготами, и для использования опорной культуры в эксперименте по нокауту, опосредованным CRISPR/Cas9. Фенотип роста нокаут амастиготов может быть оценен либо по клеточным подсчетам аксеников, либо путем репликации внутриклеточного аматигота после вторжения клеток-хозяев. Этот метод обходит дифференциацию стадии паразита, обычно участвующую в производстве трансгенного или нокаутирующего аматигота. Использование временной апорической культуры амастигот имеет потенциал для расширения экспериментальной свободы сценических исследований в T. cruzi.
Введение
Трипаносома крузи является возбудимым возбудите болезнь Шагаса, которая распространена в основном в Латинской Америке1. T. cruzi имеет отличительные этапы жизненного цикла, как он путешествует между насекомым вектор и млекопитающих хозяин2. T. cruzi реплицирует сярлица в качестве эпиматигота в середине г. кровососущего триатомина и дифференцируется в инфекционный метациклический трипомэтигот в его заднухе перед тем, как оставить на человека или животного хозяина. Как только trypomastigote попадает в организм хозяина через место укуса или через слизистую оболочку, паразит вторгается в клетку-хоз....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор всего экспериментального потока изображен на рисунке 1.
Рисунок 1: Обзор эксперимента нокаута с использованием EA. Ткань культуры полученных trypomastigotes собираюти и дифференцируются в EA. gRNA трансфицируется в Cas9-выражения амастиготы путем электропорации, и рост фенотипа нокаут амастигот оценивается либо по осяжливой репликации или по внутриклеточной репликации после вторжения клеток-хозяев.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Изоляция трипомастиготов процедурой плавания
Для сбора свежих трипомастиготов от загрязнения старых овеных аув путем плавания- искупаться клетки нужно инкубировать не менее чем на 1 ч. Инкубирование гранул более чем на 2 ч не значительно увеличивает количество заплыва в растворе трипомастиготов ( Рисунок 2B). В данном конкретном эксперименте, процент трипоматигота в первоначальной смеси составил 38%, а процент после плавания был выше 98% в любой м.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы продемонстрировали, что топорная культура T. cruzi amastigotes может быть использована в CRISPR/Cas9-опосредованного гена нокаутом, путем электропорабивания gRNA непосредственно в Cas9-выражения EA. Таким образом, существенность гена-мишени конкретно в стадии amastigote может быть оценена, не проходя через другие стадии развития.
Другим полезным аспектом трансфекции амастигота является удобство тестирования на большое количество генов-мишеней. После того, как совместно-выражение
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана JSPS KAKENHI Грант номер 18K15141 к Y.T.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 20% раствор формалина | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 068-03863 | фиксирующие элементы |
| 25 см2 колба для культуры | AGC Techno Glass | 3100-025 | |
| 75 см2 колба для культуры | AGC Techno Glass | 3110-075 | |
| флуоресцентный микроскоп "все в одном | Keyence | BZ-X710 | |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (для Control) | IDT | специально созданная | целевая последовательность = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (для TcCGM1) | IDT | специально созданная | целевая последовательность = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (для TcPAR1) | IDT | специально созданная | целевая последовательность = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA | IDT | 1072532 | к отжигу с crRNA |
| Amaxa Нуклеофектор аппарат | LONZA | AAN-1001 | электропорация |
| Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | LONZA | VMI-1021 | электропорация |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | компонент среды для in vitro амастигогенез |
| Burker-Turk одноразовый гемоцитометр | Watson | 177-212C | подсчет клеток |
| Coster 12-луночный прозрачный TC-обработанный многолуночный планшет | Corning | 3513 | |
| DMEM | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 044-29765 | питательная среда |
| Фетальная бычья сыворотка, определенный | гиклон | SH30070.03 | термическая инактивация перед использованием |
| раствор сульфата G-418 | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 077-06433 | выбор трансформанта |
| Хемин хлорид | Sigma-Aldrich | H-5533 | компонент среды ЛИТ |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | окрашивание ядер |
| Печеночный инфузионный бульон, Difco | Becton Dickinson | 226920 | компонент среды |
| ЛИТ MES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 349-01623 | компонент среды для in vitro амастигогенеза |
| PBS (–) | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 166-23555 | |
| Пропидиум йодид | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | окрашивание мертвых клеток |
| RPMI 1646 | Sigma-Aldrich | R8758 | среда для метациклогенеза |
Ссылки
- World Health Organization. (WHO) Fact sheet: Chagas disease (American trypanosomiasis). , [updated 2017 Mar; cited 2017 Aug], at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/ (2017).
- Clayton, J. Chagas disease 101. Nature. 465 (n7301_supp), S4-S5 (2010).
- Apt, W.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
