Точный и надежный полимеразы цепной реакции на основе анализ для количественной цитозин-гуанин-гуанин тринуклеотид повторяется в хрупкий X умственной отсталости-1 ген облегчает молекулярную диагностику и скрининг хрупкий X синдром и хрупкие X-связанных расстройства с более коротким временем оборота и инвестициями в оборудование.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Робуст Полимераза Цепная реакция на основе Ассаем для количественной цитозин-гуанин-гуанин тринуклеотид повторяет в хрупкой X умственной отсталости-1 Гена
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Хрупкий X синдром (FXS) и связанные с ним расстройства вызваны расширением цитозин-гуанин-гуанин (CGG) тринуклеотид повторить в 5' непереведенных региона (UTR) хрупкой X умственной отсталости-1 (FMR1) гена промоутер. Условно, анализ фрагмента капиллярного электрофореза на генетическом анализе используется для калибровки CGG повторяет FMR1, но дополнительный анализ южной поточности требуется для точного измерения, когда число повторений выше 200. Здесь мы представляем точный и надежный полимеразной цепной реакции (PCR) на основе метода количественной оценки CGG повторяет FMR1. Первым шагом этого теста является пЧР усиление повторяющихся последовательностей в 5'UTR промоутера FMR1 с использованием хрупких X PCR комплект, а затем очистка продуктов ПЦР и размер фрагментов на микрофлюидных капиллярных электрофореза инструмент, и последующее толкование числа cGG повторяется по ссылкам стандартов с известными повторами с использованием программного обеспечения анализа. Этот анализ на основе ПЦР воспроизводим и способен определить весь спектр CGG повторов промоутеров FMR1, в том числе с повторным числом более 200 (классифицируется как полная мутация), от 55 до 200 (премутация), от 46 до 54 (промежуточные), и от 10 до 45 (нормально). Это экономически эффективный метод, который облегчает классификацию FXS и хрупких X-связанных расстройств с надежностью и быстрым временем отчетности.
Введение
Хрупкий X синдром (FXS) и Хрупкие X связанных расстройств, например, тремор и синдром атаксии (FX-TAS), и первичной недостаточности яичников (FX-POI) в основном вызваны цитозин-гуанин-гуанин (CGG) тринуклеотид повторить расширение в 5 'непереведенных области (UTR) хрупкой X умственной отсталости-1(FMR1) гена на Xq27.31,2. FMR1 закодированный белок (FMRP) является полирибоом связанных РНК-связывающий белок, который функционирует в развитии нейронов и синаптической пластичности путем регулирования альтернативного сплайсинга, стабильности и дендритной транспортировки мРНК или модулирующий синтез....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этические утверждения были предоставлены Объединенным китайским университетом Гонконга и Новых территорий Восточного кластера клинических исследований комитета по этике (Справочный номер: 2013.055)
1. Усиление ПЦР
- Перед началом, удалить ПЦР буферсмесь, образец разбавитель и образцы ДНК (как тест и ссылка ДНК) (см. таблицу материалов) из -20 qC морозильник и держать их при комнатной температуре в течение 20-30 минут, чтобы убедиться, что все реагенты и ДНК полностью разморожены. Вихрь и кратко спина вниз перед использованием.
- Измерьте концентрацию образцов ДНК с помощью спектрофотометра (см. Табли....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Результаты размеров женской эталонной выборки (NA20240, повторные размеры 30 и 80) и полная женская эталонная выборка мутации (NA20239, повторные размеры 20 и 200) показаны на рисунке 1A и Рисунке 1B, соответственно. Как правило, в профиль размера фрагмента включены два маркера пиков (нижний маркер 50 базовых пар «bp» и верхний 10,380 б.п.). Существует, как правило, грунтовый комплекс пик с размером почти 95 bp. Через эталонный образец может быть построена станд.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
FXS является второй наиболее распространенной причиной интеллектуальных нарушений после трисомии 21, на долю которой приходится почти половина X-связанных умственной отсталости30, которые могут затронуть примерно 1 в 4000 мужчин и 1 в 8000 женщин. Что еще более важно, почти 1 из 250-1000 женщин нести премутации, и эта частота составляет 1 в 250-1600 у мужчин26,31,32,33. .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Это исследование было поддержано грантами от NSFC Проект управления чрезвычайными ситуациями (Грант No 81741004), Национальный фонд естественных наук Китая (Грант No 81860272), Главный исследовательский план провинциального научно-технического фонда Гуанси ( Грант Но. AB16380219), Грант Фонда постдокторской науки (Грант No 2018М630993) и Гуанси-Фонд естественных наук (Грант No 2018GXNSFAA281067).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Agilent 2100 Биоанализатор инструмент: 0,2 мл ПЦР пробирки | Axygen | PCR-02D-C | |
| Agilent 2100 Биоанализатор инструмент: 1x TE буфер, pH 8,0, без РНАЗЫ | Ambion | AM9849 | |
| Agilent 2100 Биоанализатор инструмент: 2100 Биоанализатор инструмент | Agilent | G2939AA | |
| Agilent 2100 Биоанализатор инструмент: 96-луночный ПЦР-планшет | Thermo Fisher | AB0800 | |
| Agilent 2100 Биоанализатор прибор: Электродный картридж | Agilent | Оборудование для биоанализатора 2100 | |
| Биоанализатор Agilent 2100 Биоанализатор прибор: вихревой смеситель IKA | Agilent | Оборудование для биоанализатора 2100 | |
| Биоанализатор Agilent 2100 Биоанализатор прибор: Программное обеспечение для определения размеров 2100 Программное обеспечение | эксперта Agilent | Расходное оборудование прибора биоанализатора 2100 | |
| Биоанализатор Agilent 2100 Биоанализатор прибор: Тестовые чипы | Agilent | Расходует оборудование прибора биоанализатора 2100 | |
| Комплект Agilent DNA 7500 | Agilent | 5067-1506 | Для определения размеров фрагментов |
| Agilent DNA 7500 Комплект: DNA 7500 Ladder (желтый колпачок) | Agilent | В комплекте: Agilent DNA 7500 kit (каталожный номер: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (зеленый колпачок) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (каталожный номер: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA chips | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (каталожный номер: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Концентрат красителя DNA (синий колпачок) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (каталожный номер: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Флакон с гелевой матрицей DNA (красный колпачок) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (каталожный номер: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (каталожный номер: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (каталожный номер: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Шприц | Agilent | Поставки комплекта Agilent DNA 7500 (каталожный номер: 5067-1506) | |
| Станция прайминга чипов | Agilent | 5065-4401 | Поставки оборудования биоанализатора 2100 |
| Мини-центрифуга Cubee Мини-центрифуга | GeneReach | aqbd-i | |
| Фильтровальная пластина вакуумного коллектора: MultiScreenHTS Вакуумный коллектор | Merck Millipore | MSVMHTS00 | Вакуумный прибор для вакуумной фильтровальной пластины Коллектор для очистки продукта ПЦР |
| Вакуумный фильтр Коллектор: Силиконовая пробка | Merck Millipore | XX2004718 | Фильтровальная пластина вакуумная Коллектор |
| Фильтровальная пластина вакуумная Коллектор: Вакуумный насос | Merck Millipore | WP6122050 | Фильтровальная пластина Вакуумный коллектор |
| Фильтровальная пластина вакуумный Коллектор: Контейнер для сбора отходов | Merck Millipore | XX1004705 | Фильтрующая пластина вакуумная Коллектор |
| FragilEase Fragile X PCR kit | PerkinElmer | 3101-0010 | Для амплификации ПЦР |
Ссылки
- Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
- Fu, Y. H., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
Количественное определение тринуклеотидных повторов CGGанализ методом полимеразной цепной реакциимикрофлюидный капиллярный электрофорездиагностика синдрома хрупкого X-хромосомыклассификация премутации и полной мутацииочистка продуктов ПЦРанализ размера фрагментовподготовка образцов ДНКопределение размера на генетическом анализаторе
