Методическая статья

Робуст Полимераза Цепная реакция на основе Ассаем для количественной цитозин-гуанин-гуанин тринуклеотид повторяет в хрупкой X умственной отсталости-1 Гена

DOI:

10.3791/59963

⸱

16 сентября 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Точный и надежный полимеразы цепной реакции на основе анализ для количественной цитозин-гуанин-гуанин тринуклеотид повторяется в хрупкий X умственной отсталости-1 ген облегчает молекулярную диагностику и скрининг хрупкий X синдром и хрупкие X-связанных расстройства с более коротким временем оборота и инвестициями в оборудование.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хрупкий X синдром (FXS) и связанные с ним расстройства вызваны расширением цитозин-гуанин-гуанин (CGG) тринуклеотид повторить в 5' непереведенных региона (UTR) хрупкой X умственной отсталости-1 (FMR1) гена промоутер. Условно, анализ фрагмента капиллярного электрофореза на генетическом анализе используется для калибровки CGG повторяет FMR1, но дополнительный анализ южной поточности требуется для точного измерения, когда число повторений выше 200. Здесь мы представляем точный и надежный полимеразной цепной реакции (PCR) на основе метода количественной оценки CGG повторяет FMR1. Первым шагом этого теста является пЧР усиление повторяющихся последовательностей в 5'UTR промоутера FMR1 с использованием хрупких X PCR комплект, а затем очистка продуктов ПЦР и размер фрагментов на микрофлюидных капиллярных электрофореза инструмент, и последующее толкование числа cGG повторяется по ссылкам стандартов с известными повторами с использованием программного обеспечения анализа. Этот анализ на основе ПЦР воспроизводим и способен определить весь спектр CGG повторов промоутеров FMR1, в том числе с повторным числом более 200 (классифицируется как полная мутация), от 55 до 200 (премутация), от 46 до 54 (промежуточные), и от 10 до 45 (нормально). Это экономически эффективный метод, который облегчает классификацию FXS и хрупких X-связанных расстройств с надежностью и быстрым временем отчетности.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хрупкий X синдром (FXS) и Хрупкие X связанных расстройств, например, тремор и синдром атаксии (FX-TAS), и первичной недостаточности яичников (FX-POI) в основном вызваны цитозин-гуанин-гуанин (CGG) тринуклеотид повторить расширение в 5 'непереведенных области (UTR) хрупкой X умственной отсталости-1(FMR1) гена на Xq27.31,2. FMR1 закодированный белок (FMRP) является полирибоом связанных РНК-связывающий белок, который функционирует в развитии нейронов и синаптической пластичности путем регулирования альтернативного сплайсинга, стабильности и дендритной транспортировки мРНК или модулирующий синтез....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этические утверждения были предоставлены Объединенным китайским университетом Гонконга и Новых территорий Восточного кластера клинических исследований комитета по этике (Справочный номер: 2013.055)

1. Усиление ПЦР

  1. Перед началом, удалить ПЦР буферсмесь, образец разбавитель и образцы ДНК (как тест и ссылка ДНК) (см. таблицу материалов) из -20 qC морозильник и держать их при комнатной температуре в течение 20-30 минут, чтобы убедиться, что все реагенты и ДНК полностью разморожены. Вихрь и кратко спина вниз перед использованием.
  2. Измерьте концентрацию образцов ДНК с помощью спектрофотометра (см. Табли....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Результаты размеров женской эталонной выборки (NA20240, повторные размеры 30 и 80) и полная женская эталонная выборка мутации (NA20239, повторные размеры 20 и 200) показаны на рисунке 1A и Рисунке 1B, соответственно. Как правило, в профиль размера фрагмента включены два маркера пиков (нижний маркер 50 базовых пар «bp» и верхний 10,380 б.п.). Существует, как правило, грунтовый комплекс пик с размером почти 95 bp. Через эталонный образец может быть построена станд.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FXS является второй наиболее распространенной причиной интеллектуальных нарушений после трисомии 21, на долю которой приходится почти половина X-связанных умственной отсталости30, которые могут затронуть примерно 1 в 4000 мужчин и 1 в 8000 женщин. Что еще более важно, почти 1 из 250-1000 женщин нести премутации, и эта частота составляет 1 в 250-1600 у мужчин26,31,32,33. .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантами от NSFC Проект управления чрезвычайными ситуациями (Грант No 81741004), Национальный фонд естественных наук Китая (Грант No 81860272), Главный исследовательский план провинциального научно-технического фонда Гуанси ( Грант Но. AB16380219), Грант Фонда постдокторской науки (Грант No 2018М630993) и Гуанси-Фонд естественных наук (Грант No 2018GXNSFAA281067).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Agilent 2100 Биоанализатор инструмент: 0,2 мл ПЦР пробиркиAxygenPCR-02D-C
Agilent 2100 Биоанализатор инструмент: 1x TE буфер, pH 8,0, без РНАЗЫAmbionAM9849
Agilent 2100 Биоанализатор инструмент: 2100 Биоанализатор инструментAgilentG2939AA
Agilent 2100 Биоанализатор инструмент: 96-луночный ПЦР-планшетThermo FisherAB0800
Agilent 2100 Биоанализатор прибор: Электродный картриджAgilentОборудование для биоанализатора 2100
Биоанализатор Agilent 2100 Биоанализатор прибор: вихревой смеситель IKAAgilentОборудование для биоанализатора 2100
Биоанализатор Agilent 2100 Биоанализатор прибор: Программное обеспечение для определения размеров 2100 Программное обеспечениеэксперта AgilentРасходное оборудование прибора биоанализатора 2100
Биоанализатор Agilent 2100 Биоанализатор прибор: Тестовые чипыAgilentРасходует оборудование прибора биоанализатора 2100
Комплект Agilent DNA 7500Agilent5067-1506Для определения размеров фрагментов
Agilent DNA 7500 Комплект: DNA 7500 Ladder (желтый колпачок)AgilentВ комплекте: Agilent DNA 7500 kit (каталожный номер: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (зеленый колпачок)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (каталожный номер: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chipsAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (каталожный номер: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Концентрат красителя DNA (синий колпачок)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (каталожный номер: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Флакон с гелевой матрицей DNA (красный колпачок)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (каталожный номер: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode CleanerAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (каталожный номер: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin FilterAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (каталожный номер: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: ШприцAgilentПоставки комплекта Agilent DNA 7500 (каталожный номер: 5067-1506)
Станция прайминга чиповAgilent5065-4401Поставки оборудования биоанализатора 2100
Мини-центрифуга Cubee Мини-центрифугаGeneReachaqbd-i
Фильтровальная пластина вакуумного коллектора: MultiScreenHTS Вакуумный коллекторMerck MilliporeMSVMHTS00Вакуумный прибор для вакуумной фильтровальной пластины Коллектор для очистки продукта ПЦР
Вакуумный фильтр Коллектор: Силиконовая пробкаMerck MilliporeXX2004718Фильтровальная пластина вакуумная Коллектор
Фильтровальная пластина вакуумная Коллектор: Вакуумный насосMerck MilliporeWP6122050Фильтровальная пластина Вакуумный коллектор
Фильтровальная пластина вакуумный Коллектор: Контейнер для сбора отходовMerck MilliporeXX1004705Фильтрующая пластина вакуумная Коллектор
FragilEase Fragile X PCR kitPerkinElmer3101-0010Для амплификации ПЦР

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Fragile X Mental Retardation 1 GeneCGG Trinucleotide Repeat QuantificationPolymerase Chain Reaction AssayMicrofluidic Capillary ElectrophoresisFragile X Syndrome DiagnosisPremutation Full Mutation ClassificationPCR Product PurificationFragment Size AnalysisDNA Sample PreparationGenetic Analyzer Sizing

Похожие статьи