Выполнение человеческих скелетных мышц ксенотрансплантатов в иммунодефицитных мышей

Было сообщено, что только 13,8% всех программ разработки лекарственных средств, проходящих клинические испытания являются успешными и привести к утвержденным терапии¹. Хотя этот показатель успеха выше, чем 10,4% ранее сообщалось², есть еще значительные возможности для совершенствования. Одним из подходов к повышению успешности клинических испытаний является совершенствование лабораторных моделей, используемых в доклинических исследованиях. Управление по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) требует проведения исследований на животных, чтобы показать эффективность лечения и оценить токсичность до фазы 1 клинических испытаний. Тем не менее, часто ограничено согласование в исходах лечения между исследованиями на животных и клинических испытаний³. Кроме того, необходимость в доклинических исследованиях на животных может быть непреодолимым барьером для терапевтического развития при заболеваниях, в которых отсутствует принятая модель животных, что часто характерно для редких или спорадических заболеваний.

Один из способов моделирования человеческих заболеваний путем трансплантации человеческих тканей в иммунодефицитных мышей для создания ксенотрансплантатов. Есть три ключевых преимущества ксенотрансплантата модели: Во-первых, они могут резюмировать сложные генетические и эпигенетические аномалии, которые существуют в болезни человека, которые никогда не могут быть воспроизводимы в других животных моделей. Во-вторых, ксенотранспланты могут быть использованы для моделирования редких или спорадических заболеваний, если у пациента имеются образцы. В-третьих, ксенотранспланты моделируют болезнь в рамках полной системы in vivo. По этим причинам, мы предполагаем, что эффективность лечения приводит к ксенотрансплантат модели, скорее всего, перевести на испытания у пациентов. Ксенотранспланты опухоли человека уже успешно используются для разработки методов лечения распространенных видов рака, включая множественную миелому, а также персонализированные методы лечения для отдельных пациентов^{4,5,6, 7}.

В последнее время, ксенотранспланты были использованы для разработки модели болезни человеческих мышц⁸. В этой модели, образцы биопсии мышц человека пересаживаются в задние конечности иммунодефицитных мышей NRG для формирования ксенотрансплантатов. Пересаженные человеческие миофибы умирают, но стволовые клетки человеческих мышц, присутствующие в ксенотрансплантате, впоследствии расширяются и дифференцируются в новые человеческие миофибы, которые заселяют привяженную человеческую базальную ламину. Таким образом, регенерированные миофибы в этих ксенотрансплантах полностью человеческие и спонтанно реваскуляризованы и иннерватированы хозяином мыши. Важно отметить, что фасциоскапуглогумеральная мышечная дистрофия (ФСХР) мышечной ткани пациента, пересаженная мышам, перезывает на мышей ключевые особенности болезни человека, а именно выражение фактора транскрипции DUX4 ⁸. FSHD вызвано переэкспрессией DUX4, который эпигенетически заглушается в нормальной мышечной ткани^9,10. В модели FSHD xenograft, лечение с DUX4-специфический морфолино было показано, успешно подавлять DUX4 выражение и функции, и может быть потенциальным терапевтическим вариантом для пациентов FSHD¹¹. Эти результаты показывают, что человеческие мышцы ксенотрансплантатов являются новым подходом к модели человеческой мышечной болезни и проверить потенциальные методы лечения у мышей. Здесь мы подробно описываем хирургический метод создания ксенотрансплантатов скелетных мышц у иммунодефицитных мышей.

Все использование научных образцов из человеческих субъектов было одобрено Советом по институциональному обзору Джона Хопкинса (IRB) для защиты прав и благополучия участников. Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Джонса Хопкинса (IACUC) в соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения (NIH) по уходу и использованию лабораторных животных. Мужские NOD-Rag1^nullIL2r null (NRG) хозяйные мыши (8-12 недель) используются для проведения ксенотрансплантатных экспериментов. Эти мыши размещаются в вентилируемых стеллажах и получают HEPA-фильтрованный, закаленный и увлажненный воздух, а также обратный осмос фильтровангиперкровенной воды. Мышам предоставляется вода и облученные антибиотикдиеты (Таблица материалов) ad libitum, и объект обеспечивает 14 ч света до 10 ч темноты, как контролируется центральным таймером.

1. Подготовка оборудования

1. Приобретите нулевыхМИК-Рэг1 null (NRG) мышей, возраст 8-12 недель.
2. Автоклав хирургическое оборудование: ножницы, щипцы, держатель иглы, хирургический степлер (Таблица материалов), раны клипы, хирургические салфетки (Таблица материалов), и стакан(рисунок 1A).
3. Подготовка 50 мл мышечных носителей (20% сыворотки крупного рогатого скота плода, 2% экстракт эмбриона цыпленка, 1% антибиотик/ антимикотвва в Hams F10 Medium). Храните все химические вещества / наркотики / решения, используемые для хирургии при комнатной температуре, если не указано по-разному в протоколе.
4. Подготовка 1 мл шприц с 26 G иглы, что составляет 3/8 дюймов в длину, содержащий 2 мг / мл анальгетик (Таблица материалов), и место на льду. Анальгетик можно разбавить до надлежащей концентрации с помощью стерильного фосфатного буферного солей (PBS).

2. Хирургическая подготовка

1. Получить биопсии мышц человека в соответствии с IRB утвержденных протокола от пациентов, чьи мышцы отображают силу (ru; 4-/5 на MRC (Медицинский исследовательский совет) шкала¹². Поместите исследовательский образец в тарелку 100 мм x 15 мм Петри, содержащую мышечные носители.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шкала MRC используется в клинической практике в качестве оценки мышечной силы с 0 не показывая сокращения, 5 показаны нормальной мощности, и 4 (4- до 4 ") показаны движения против сопротивления¹². Мы обнаружили, что мышцы с легкой до умеренной слабостью (MRC йgt; 4-/5), как правило, показывают патологию болезни, но не сильно заменить жировой ткани или фиброз, оба из которых препятствуют регенерации ксенотрансплантата. В случае вскрытия ткани, где последние оценки MRC не доступна, качество мышц могут быть доступны через грубое наблюдение. Биопсия мышц, которые бледно-розовый внешний вид или имеют большие участки жировой ткани, вероятно, не ксенотрансплантат успешно.
2. Удалите все оставшиеся фасции или жировой ткани из образца хирургическими ножницами с помощью стерео микроскопа и источника света для визуализации.
3. Рассекать биопсию мышц примерно на 7 мм х 3 мм х 3 мм штук с хирургическими ножницами с помощью стерео микроскопа и источника света. Убедитесь, что волокна расположены продольно в образце.
4. Поместите чашку Петри, содержащую расчлененные мышцы, на льду. В среднем, ксенотранспланты хранятся в средствах массовой информации в течение 4 часов во время операций выполняются. Тем не менее, биопсия хранилась в средствах массовой информации в течение 24 ч до ксенотрансплантации, и эта задержка, как представляется, не негативно влияет на трансплантацию или регенерацию.
5. Поместите синтетические, непоглощаемые швы(Таблица материалов)в 100 мм х 15 мм Петри блюдо, содержащее 70% этанола.
6. Настройка двойной процедуры анестезии цепи: организовать Mapleson E дыхание цепи на стерео микроскоп и поместить индукционной камеры в кабинете биобезопасности(Рисунок 1A,B).
7. Получить вес мыши NRG, поместив в автоклавированный стакан по шкале, и передачи в индукционную камеру. Индуцировать анестезию под 3% изолюран. После того, как соответствующая глубина анестезии достигается, как оценивается путем наблюдения частоты дыхания, мышечной релаксации и отсутствия добровольного движения-уменьшить настройки испарителя до 1,5% на оставшуюся часть операции.
8. Перенесите мышь из индукционной камеры в дыхательную цепь Mapleson E и нанесите офтальмент на глаза.
9. Удалить волосы над передней tibialis (TA) от лодыжки до колена с триммером, а затем 1 мин лечения с лосьоном для удаления волос (Таблица материалов) (Рисунок 2A).
10. Дезинфицировать хирургическое место путем мазка ноги с повидон-йод раствор. Затем смойте оставшийся повидон-йод с 70% этанола.
11. Вводят мышь подкожно с анальгетиком, такимкак как карпрофен, (Таблица Материалов) в дозе 5 мг/кг.

3. Ксенотрансплантат хирургии

1. Лента вниз по ноге и сделать прямой разрез над передней tibilalis (TA) мышцы с ножницами и радужной оболочкой щипцы, происходящие на дистальные сухожилия и прекращения ниже колена (Рисунок 2B).
2. Отделить кожу от мышц с помощью тупого вскрытия хирургическими ножницами.
3. Вырезать через эпимизий мышцы TA с ножницами, начиная с сухожилия и заканчивая коленом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень поверхностный разрез (менее 0,5 мм; Рисунок 2B, черный пунктирной линии), и основной TA не должны быть повреждены в этом процессе, как это сделает удаление более сложным. При правильном выполнении мышечные волокна заметно расслабятся.
4. Вырезать дистального сухожилия TA с ножницами, захватить сухожилие с щипцы радужной оболочки глаза, и потяните TA вверх к колену (Рисунок 2C).
5. Вырежьте дистовое сухожилие разгибателя digitorum longus (EDL) ножницами и потяните EDL к колену(рисунок 2D). После того, как проксимотальное сухожилие мышцы peroneus longus (PL) видно, удалите EDL ножницами(рисунок 2D, зеленая пунктирной линии).
6. Удалите TA с ножницами(Рисунок 2D, синий пунктирной линии) и использовать хирургические протрите смачивают PBS и небольшое давление для достижения гемостаза(Рисунок 2E).
7. Нить шов через проксимальной peroneus longus (PL) сухожилия и отделки, оставляя примерно 1,5 дюйма нити по обе стороны сухожилия (Рисунок 2F).
8. Выполните первую половину двухрукого хирургического квадратного узла, но не затягивайте: это сформирует круг. Поместите ксенотрансплантат в этом круге и затяните петлю, чтобы обеспечить ксенотрансвграф. Заполните другую половину квадратного узла(рисунок 2G,H). Это будет шов ксенотрансплантата на проксимон сухожилия PL.
9. Нить шов через дистального сухожилия PL и повторить квадратный узел техники от шага 3.8, чтобы связать ксенотрансплантат адистального сухожилия (Рисунок 2H,I).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Медиальная tarsal артерия и вена могут лежать близко к или на верхней части дистального сухожилия PL. Не размещайте швы через эти сосуды или вокруг них. Легко сказать, если шов был неправильно помещен, как сосуды будут бланшировать или кровоточить. Если это происходит, удалите шов и поместите в другом месте.
10. Потяните кожу над ксенопригвированными мышцами, запечатайте хирургическим клеем и поместите 2-3 хирургических скобы над разрезом(рисунок 2J).
11. Поместите мышь в чистую клетку на подогревом площадку, чтобы восстановиться. Монитор мыши до полного сознательного и периодически в течение ближайших нескольких дней для признаков местной системной инфекции и обеспечить хирургическое место не вновь открыт.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разовая доза анальгетика, как описано в шаге 2.11, как правило, достаточно для облегчения боли. Тем не менее, мышей также следует контролировать на стойкие боли (например, хромота, взъерошенный слой, сгорбленная осанка), и, при необходимости, повторно дозируется с анальгетиком на 24 ч после операции.

4. Коллекция Ксенотранспланта

ПРИМЕЧАНИЕ: Ксенотрансплантаты, как правило, собираются от 4 до 6 месяцев после операции. Тем не менее, коллекции были выполнены до 12 месяцев после операции.

1. Поместите крытый стакан, содержащий 200 мл 2-метилбутана в коробке, содержащей сухой лед, в течение как минимум 30 минут до сбора ксенографта.
2. Индуцировать анестезию под 3% изолюран в индукционной камере. После того, как соответствующая глубина анестезии достигается, уменьшить настройки испарителя до 1,5% на оставшуюся часть операции.
3. Перенос мыши из индукционной камеры в дыхательную цепь Mapleson E, расположенную на стерео микроскопе.
4. Удалите волосы над передней tibialis от лодыжки до колена с триммером и лосьон для удаления волос. Швы, держащие ксенотрансплантат на месте, можно увидеть через кожу(рисунок 3A).
5. Лента вниз по ноге и использовать ножницы и щипцы радужной оболочки глаза, чтобы открыть кожу над ксенотрансплантат, пока оба шва видны(Рисунок 3B). Кожа над ксенотрансплантат может быть удалена, как показано, чтобы сделать удаление ксенотрансплантата легче.
6. Используйте скальпель, чтобы разрезать между ксенотрансплантатом и голени(Рисунок 3B, стрелка обозначает начальный сайт и направление разреза). Это освободит одну сторону ксенотрансплантата.
7. Используйте скальпель, чтобы сократить между мышцей PL и гастрокнемии мышцы(Рисунок 3C, яncision вдоль эпимисия помечены стрелой). PL будет удален с помощью ксенотранспланта.
8. Вырезать ниже дистальный шов и через дистное сухожилие PL(рисунок 3D, вырезать вдоль пунктирной линии).
9. Удалите ксенотрансплантат и PL, захватив шов с щипцы радужной оболочки глаза и отклоняя его к колену при использовании ножниц, чтобы отрезать его от основной мышцы (Рисунок 3E).
10. Вырезать над проксимальной шов с ножницами, чтобы удалить ксенотрансплантат и PL(Рисунок 3F, вырезать вдоль пунктирной линии в 3E).
11. Поместите образец на небольшой кусочек картона или пластика, и контактный как можно ближе к швам, как это возможно. При закреплении образца, осторожно растянуть мышцы, чтобы убедиться, что волокна ориентации поддерживается во время оснастки процесса замораживания. После булавки надежно на месте, слайд мышцы до булавки, чтобы он лежит чуть выше картона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, один конец ксенотрансплантата может быть установлен в трагаканте на пробке, или он может быть погружен полностью в оптимальной температуре резки (O.C.T.) соединения в криомольде. С осторожностью, мышечная конформация может быть сохранена с помощью обоих методов.
12. Привязать заморозить ксенотрансплант в предварительно охлажденных 2-метилбутан.
13. Хранить ксенотрансплантат при -80 градусах По Цельсию.
14. Сразу же после сбора ксенотрансплантата, эвтаназии мышей в соответствии с Американской ветеринарной медицинской ассоциации руководящих принципов:
    1. Поместите мышей в герметичную камеру с соответствующей системой очистки отработанного газа. Используйте изолюран в концентрации 3-4% для индуцирования анестезии.
    2. После того, как соответствующая глубина анестезии достигается, как оценивается путем наблюдения частоты дыхания, мышечной релаксации, и отсутствие добровольного движения-увеличить настройки испарителя до 5%, чтобы вызвать смерть. Оставьте мышей в камере еще на 2 мин после того, как дыхание прекратилось. Смерть проверяется, наблюдая, что мыши не могут восстановить в течение 10 минут после передозировки изофлуран.
    3. Наконец, выполнить вывих шейки матки на мышах.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В случае двустороннего ксенопригватого мышей, контралатеральный ксенотрансплантат может быть сохранен для более поздней коллекции. Чтобы выполнить коллекцию выживания, откройте кожу над ксенотрансплантатом с одним прямым разрезом хирургическими ножницами, и удалите ксенотрансплантат, как описано в шагах 4,6 до 4,10. Затем закройте кожу над пустым отсеком с помощью хирургического клея и скобы. Лечить мышь с анальгетиком, как описано в шаге 2.11 и поместите мышь в чистую клетку на подогревом площадку, чтобы восстановиться. Мониторинг мыши до полного сознательного и периодически в течение ближайших нескольких дней на наличие признаков местной системной инфекции и обеспечить хирургическое место не будет вновь открыт.

5. Ксенотрансплант Иммуногистохимия

1. Используйте криостат, чтобы сократить от 10 до 12 мкм разделы из собранных ксенотрансплантата на положительно заряженных слайдов (Таблица материалов).
2. Заполните банку окрашивания метанолом и предварительно охладите при -20 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
3. Поместите горки в ледяной метанол в течение 10 минут, чтобы исправить и permeabilize ксенотрансплантат аграрт разделов.
4. Место слайды в окрашивание банку и промыть 3x с фосфатом буферного сольника (PBS) в течение 5 минут.
5. Блок с анти-мышь igG (Таблица материалов) для 2 ч при 4 C.
6. Погредка с первичными антителами, такими как спектрин, ламин A/C, и эмбриональный миозин (Таблица Материалов) в PBS дополнен2% козьей сыворотки на ночь при 4 градусах Цельсия.
7. Поместите слайды в окрашивание банку и промыть 3x с фосфатами буферного сольника (PBS) в течение 5 минут.
8. Погретые с флуоресцентно-красителя конъюгированные вторичные антитела(Таблица материалов) в PBS дополнены 2% сыворотки козы для 1 h при комнатной температуре.
9. Место слайды в окрашивание банку и промыть 3x с фосфатом буферного сольника (PBS) в течение 5 минут.
10. Место монтажа среды (Таблица материалов) над ксенотрансплантатов разделы, место coverslip на вершине, и использовать лак для ногтей для уплотнения coverslip.

Рисунок 2: Ксенотрансплантат хирургии. (A) Волосы удаляются из хирургического сайта. (B) Разрез делается над передней tibialis (TA). Дистальные сухожилия TA и разгибателя digitorum longus (EDL) отмечены стрелками. Черная пунктирная линия указывает, где эпимисий будет сокращен в шаге 3.3. (C) Дисталь сухожилия TA разрезается и мышцы подтягивается до колена. (D) Сухое сухожилие EDL разрезается и EDL подтягивается до колена. Это подвергает проксимального сухожилия peroneus longus (PL), отмеченного стрелой. Dashed линии показывают, где вырезать с ножницами, чтобы удалить EDL (зеленый) и PL (синий). (E) EDL и TA удаляются. (F) Шов помещается через проксимон сухожилия PL. (G) Ксенотрансплантат помещается в пустой отсек косилок и зашивают к проксимальной сухожилия PL с помощью двухсторонного хирургического квадратного узла. (H) Шов помещается через дистального сухожилия PL, отмеченный стрелой, и еще две руки хирургического квадратного узла используется для шва ксенотрансплантата на дистальное сухожилие. (Я) Ксенотрансплантат полностью пересажены и зашивается в PL. (J) Кожа закрыта хирургическим клеем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: 4 месяц Ксенотрансплантат Коллекция. (A) Волосы удаляются из хирургического сайта. Под кожей видны швы. (B) Кожа над ксенотрансвграфом удаляется. Затем ксенотрансплантат схватил исправис щипками на дистальный шов и осторожно вытащил вверх. Начиная с лодыжки, скальпель используется, чтобы сократить вдоль голени и освободить ксенотрансплантат. Стрелка показывает начало разреза вдоль голени. (C) Потянув гастрокнемии мышцы в сторону, слабая белая линия эпимисия, разделяющей peroneus longus (PL) мышцы и гастрокнемия (показано на стрелке) становится видимым. Используйте скальпель, чтобы сократить вдоль этой линии, чтобы отделить PL от других мышц ног. (D) Правая сторона ксенотрансплантата, и PL теперь свободны от других мышц в ноге и готовы к удалению. Пунктирная линия указывает, где вырезать хирургическими ножницами, чтобы начать удаление ксенотрансплантата и PL. (E) После резки ниже дистальный шов, отвлечь ксенотрансплантат к колену. Пунктирная линия указывает, где вырезать хирургическими ножницами, чтобы удалить ксенотрансплантат и PL из отсека. (F) Пустой отсек косилок с ксенотранспланта и PL успешно удалены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Как показал Yuanfan Чжан и др., этот хирургический протокол является простым методом для производства человеческих скелетных мышц ксенотрансплантатов8. Регенерированные ксенотранспланты становятся спонтанно иннерватированными и отображают функциональную контрактность. Кроме того, мышцы ксеноприжированные от пациентов FSHD резюмирует изменения в экспрессии генов наблюдается у пациентов FSHD8.

По нашему опыту, примерно 7 из 8 ксенотрансплантатов, выполненных из контрольных образцов пациента, покажут успешное прививочтой мышцы. Успешный ксенотрансплантат показывает надежную регенерацию человеческих миофизеров, как отождествляется с человеческими специфическими антителами(рисунок 4). Положительное зародышевое окрашивание миосина в пропорции миофилеров указывает на то, что процесс регенерации все еще продолжается. В отличие от этого, плохая хирургическая техника или неадекватный образец может привести к плохой регенерации мышечных волокон(рисунок 4).

Ксенотрансплантаты, выполняемые у пациента с диагнозом идиопатической воспалительной миопатии (IIM) показывают умеренное количество регенерированных человеческих миофиберов на 4- и 6-месячных коллекций, и эмбриональные миозиновые пятна сохраняется на 6 месяцев(Рисунок 5A). Воспалительные клетки присутствуют в ксенотрансплантате, как показано на H и E окрашивания(Рисунок 5A), и были подтверждены с CD3, CD68, и другие иммунологические маркеры (данные не показаны). Кшенотрансплантаты стабильны внутри мыши, и были выполнены до 12-месячных коллекций. Индивидуальный размер миофибра сопоставим между 4- и 6-месячными XIM xenografts и оригинальной биопсией пациента IIM(рисунок 5B). Редкие волокна, показывающие поперечную секционную область (CSA) больше, чем 3500 мкм2 наблюдаются в xenografts, но не в биопсии IIM, что свидетельствует о том, что некоторые myofibers в ксенотранспланты могут регенерировать csA сопоставимы по размеру со здоровыми myofibers (Рисунок 5B ).

Рисунок 1: Хирургическая настройка.
A) Стандартная ориентация стерео микроскопа, кленового E дыхательной цепи, и хирургические инструменты во время ксенотрансплантата хирургии. B) Размещение индукционной камеры в кабинете биобезопасности.

Рисунок 4: Ожидаемые положительные и отрицательные результаты.
Ксенотрансплантаты, собранные 4 месяца после операции, показывающие хорошую или плохую регенерацию, окрашены человеческим ламином A/C (1:50) и антропогенным спектрином (1:20) и эмбриональным миозином (1:10)(Таблица материалов). Области, указанные белыми пунктиры коробки показаны как более высокое увеличение вставки. Шкала бар: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Регенерация представителя Ксенотранспланта.
A) Xenografts (изложенные с пунктирными линиями) выполняется от пациента с диагнозом идиопатической воспалительной миопатии (IIM) окрашенные гематоксилин и эозин (H и E), человека конкретных Lamin A / C, и человека конкретных спектрин, показать образование миофиплав в NRG мышей в 4-х и 6-месячных временных точках. Эмбриональное окрашивание миосина показывает, что регенерация все еще продолжается в обе их временные точки. Шкала бар: 200 мкм. B) Гистограммы с изображением поперечной области (CSA) миофиберов от 4- и 6-месячных ксенотрансвантов и биопсии человека от одного пациента с диагнозом идиопатической воспалительной миопатии (IIM) и один здоровый пациент управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.