Автоматизированная Крыса Одно-Пелле Достижение с 3-мерной реконструкции лапы и Digit траектории

Краткое содержание

Грызун квалифицированных достижения обычно используется для изучения ловких навыков, но требует значительного времени и усилий для реализации задачи и анализа поведения. Мы описываем автоматизированную версию квалифицированного достижения с отслеживанием движения и трехмерной реконструкцией траекторий охвата.

Аннотация

Грызун квалифицированных достижения обычно используется для изучения ловких навыков, но требует значительного времени и усилий для реализации задачи и анализа поведения. Недавно было разработано несколько автоматизированных версий квалифицированного охвата. Здесь мы описываем версию, которая автоматически представляет гранулы крысам при записи видео высокой четкости с разных углов при высокой частоте кадров (300 кадров в секунду). Лапа и отдельные цифры отслеживаются с помощью DeepLabCut, алгоритма машинного обучения для оценки бесмаркерной позы. Эта система также может быть синхронизирована с физиологическими записями или использоваться для запуска физиологических вмешательств (например, электрической или оптической стимуляции).

Введение

Люди сильно зависят от ловкого умения, определяемого как движения, требующие точно скоординированных многосовместных и цифровых движений. На эти навыки влияет целый ряд общих патологий центральной нервной системы, включая структурные поражения (например, инсульт, опухоль, демиелинизирующие поражения), нейродегенеративные заболевания (например, болезнь Паркинсона) и функциональные аномалии двигательных заболеваний схемы (например, дистония). Понимание того, как ловкие навыки изучаются и реализуются центральными автотранспортными схемами, поэтому имеет потенциал для улучшения качества жизни для большого населения. Кроме того, такое понимание, вероятно, улучшит двигательные показатели у здоровых людей за счет оптимизации стратегий обучения и реабилитации.

Вскрытие нейронных цепей, лежащих в основе ловких навыков в организме человека, ограничено технологическими и этическими соображениями, что требует использования моделей животных. Нечеловеческие приматы обычно используются для изучения ловких движений конечностей, учитывая сходство их двигательных систем и поведенческого репертуара с людьми¹. Тем не менее, нечеловеческие приматы стоят дорого с длинным временем генерации, ограничивая количество испытуемых и генетических вмешательств. Кроме того, в то время как нейронаучный инструментарий, применимый к нечеловеческим приматам, больше, чем для людей, многие последние технологические достижения либо недоступны, либо значительно ограничены у приматов.

Родоводский охват является дополнительным подходом к изучению ловкого управления двигателем. Крысы и мыши могут быть обучены, чтобы достичь, понять, и получить сахарные гранулы в стереотипной последовательности движений гомологичным для человека достижения моделей². Из-за их относительно короткого времени генерации и более низких расходов на жилье, а также их способности приобретать квалифицированных достижения в течение нескольких дней до нескольких недель, можно изучать большое количество предметов в течение обучения и навыков консолидации фаз. Использование грызунов, особенно мышей, также облегчает использование мощных современных нейронаучных инструментов (например, оптогенетика, изображения кальция, генетические модели болезни) для изучения ловких навыков.

Грызун квалифицированных достижения была использована в течение десятилетий для изучения нормального управления двигателем и как она зависит от конкретных патологий, как инсульт и болезнь Паркинсона³. Тем не менее, большинство версий этой задачи являются трудоемкими и трудоемкими, смягчая преимущества изучения грызунов. Типичные реализации включают размещение грызунов в камере достижения с полкой перед узким слотом, через который должен попасть грызун. Исследователь вручную помещает сахарные гранулы на полку, ждет, пока животное достигнет, а затем помещает еще один. Достижения забиваются как успехи или неудачи либо в режиме реального времени или видео-обзор⁴. Тем не менее, просто забил достигает, как успехи или неудачи игнорирует богатые кинематические данные, которые могут обеспечить понимание того, как (в отличие от просто ли) достижения нарушается. Эта проблема была решена путем осуществления подробного обзора достижения видео для выявления и полуколичественно оценка достичь submovements⁵. Хотя это добавило некоторые данные относительно достичь кинематики, это также значительно увеличило время и усилия экспериментаторов. Кроме того, высокий уровень вовлеченности экспериментаторов может привести к несоответствиям в методологии и анализе данных, даже в рамках одной лаборатории.

В последнее время было разработано несколько автоматизированных версий квалифицированного охвата. Некоторые прикрепляютсяк домашней клетке 6,^7,устраняя необходимость переноса животных. Это как снижает нагрузку на животных и устраняет необходимость акклиматизации их в специализированной камере достижения. Другие версии позволяют отслеживать лапы, так чтокинематические изменения при конкретных вмешательствах могут быть изучены 8,^9,10,или иметь механизмы, чтобы автоматически определить, если гранулы были сбиты с полки¹¹. Автоматизированные квалифицированные задачи достижения особенно полезны для высокоинтенсивных тренировок, так как может потребоваться для реабилитации после травмы^12. Автоматизированные системы позволяют животным выполнять большое количество достигает в течение длительных периодов времени, не требуя интенсивного участия исследователя. Кроме того, системы, позволяющие отслеживать лапы и автоматизированный подсчет результатов, сокращают время, затрачиваемые исследователем на проведение анализа данных.

Мы разработали автоматизированную систему квалифицированного охвата крыс с несколькими специализированными функциями. Во-первых, с помощью подвижного пьедестала довести гранулы в "достижение позиции" снизу, мы получаем почти беспрепятственный вид передних конечностей. Во-вторых, система зеркал позволяет несколько одновременных видов досягаемости с одной камерой, что позволяет трехмерной (3-D) реконструкции траекторий досягаемости с помощью высокой скорости (300 кадров в секунду) камеры. С недавней разработкой надежных алгоритмов машинного обучения для отслеживания маркеров^{движения 13}, мы теперь отслеживаем не только лапу, но и отдельные костяшки пальцев, чтобы извлечь подробный охват и понять кинематику. В-третьих, захват кадра, выполняющий простую обработку видео, позволяет в режиме реального времени идентифицировать различные фазы достижения. Эта информация используется для запуска видео приобретения (непрерывное приобретение видео не практично из-за размера файла), а также может быть использован для запуска вмешательства (например, оптогенетика) в точные моменты. Наконец, отдельные видеокадры запускаются импульсами транзисторно-транзисторной логики (TTL), что позволяет точно синхронизировать видео с нейронными записями (например, электрофизиологией или фотометрией). Здесь мы описываем, как построить эту систему, обучить крыс выполнять задачу, синхронизировать аппарат с внешними системами и реконструировать трехмерные траектории охвата.

Протокол

Все методы, связанные с использованием животных, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Мичиганского университета.

1. Настройка камеры достижения

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробности и диаграммы аппарата можно узнать над лентой и диаграммами аппарата. Номера частей относятся к рисунку 1.

1. Скрепление прозрачных поликарбонатных панелей с акриловым цементом для построения камеры достижения (15 см в ширину и 40 см в длину и 40 см в высоту) (часть #1). Одна боковая панель (часть #2) имеет навесную дверь (18 см в ширину и 15 см в высоту) с замком. Если крыса будет привязана к кабелю, вырежьте щель (5 см в ширину и 36 см в длину) в камерный потолок, чтобы вместить ее (часть #12). Панель пола имеет 18 отверстий (1.75 cm диаметр) (часть #13) отрезанная в ее и не скреплена к остальноям камеры.
2. Монтировать и выравнивать инфракрасные датчики (часть #3) в боковых панелях на 4,5 см от задней части камеры и 3,8 см от пола. Поведенческое программное обеспечение имеет индикатор ('IR Back'), который является зеленым, когда инфракрасный луч непрерывный и красный, когда луч сломан. После настройки программного обеспечения это может быть использовано для проверки выравнивания датчиков.
3. Установите зеркало (15 см х 5 см, часть #4) на 10 см выше протягивающего слота (часть #14). Угол зеркало так гранулы доставки стержень виден на камеру.
4. Поместите камеру на санируемую опорную коробку (59 см в ширину и 67,3 см в длину и 30,5 см в высоту, часть #5). Камера лежит над отверстием в опорной коробке (12 см в ширину и 25 см в длину), что позволяет мусору падать через отверстия пола (часть #13) и из камеры достижения. Вырежьте второе отверстие (7 см в ширину и 6 см в длину, часть #15) в опорную коробку перед слотом для достижения, что позволяет стержню доставки гранул довести гранулы в достижение слота.
5. Установите два зеркала (8,5 см в ширину х 18,5 см в высоту, часть #6) к полу с магнитами по обе стороны камеры, так что длинный край зеркала касается боковой панели 3 см от передней части коробки достижения. Угол зеркала так, что камера может видеть в поле и области перед достижением слот, где гранулы будут доставлены.
6. Установите камеру высокой четкости (часть #7) 17 см от слота для достижения, обращенной к коробке.
7. Установите черную бумагу (часть #18) по обе стороны от камеры, так что фон в боковых зеркалах темный. Это усиливает контраст для улучшения в режиме реального времени и в автономном режиме обнаружения лап.
8. Смонтировать линейный актуатор (часть #16) на дезинфицирующую раму (25 см в ширину и 55 см в длину и 24 см в высоту, часть #8) винтами. Актуатор устанавливается вверх ногами, чтобы предотвратить накопление гранул ы внутри его позиционно-чувствеонного потенцомера.
9. Вставьте пену O-кольцо в шею резервуара гранул (фуннел) (часть #9), чтобы предотвратить накопление пыли в сборке. Установите воронку ниже отверстия (диаметром 6 см, часть #17) в верхней части рамы, смещая края воронки над тремя винтами, просверленными в нижней части верха рамы. Вставьте направляющий трубку (часть #10) в шею воронки.
10. Прикрепите пластиковый разъем T к концу стального стержня упорного. Вставьте конические конце гранулы доставки стержня в верхней части разъема и cupped конца через направляющей трубки в резервуар гранул.
11. Поместите линейную сборку актуатора под квалифицированную камеру достижения, так что стержень доставки гранул может распространяться через отверстие (часть #15) перед достижением слота.
12. Поместите весь достигающий аппарат в колесный шкаф (121 см х 119 см х 50 см) вентилируемые с компьютерными вентиляторами (интерьер нагревается при хорошо освещенном) и облицован акустической пеной.
13. Постройте пять световых панелей (часть #11) путем прикрепивания светодиодных световых полос окнестей на 20,3 см на 25,4 см вспомогательных панелей. Гора диффузора пленки над световой полосы. Установите одну световую панель на потолок над областью стержня доставки гранул. Установите остальные четыре по бокам шкафов вдоль идущей камеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы осветить область вокруг достижения слот и гранулы доставки стержня для идентификации лапы в режиме реального времени.

2. Настройка компьютера и оборудования

1. Установите FPGA рамку grabber и цифровые карты расширения в инструкции производителя (см. таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем не менее 16 ГБ оперативной памяти и внутренний твердотельный жесткий диск для хранения данных, так как потоковая передача высокоскоростного видео требует значительной буферизации.
2. Установите драйверы для камеры высокой четкости и подключите ее к framegrabber FPGA. Поведенческое программное обеспечение должно работать и пересекаться с камерой, чтобы использовать программное обеспечение, связанное с камерой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Включенный код (см. дополнительные файлы) получает доступ к программируемым регистрам в камере и может быть несовместим с другими брендами. Мы рекомендуем записывать не менее 300 кадров в секунду (fps); на 150 кадров в секунду мы обнаружили, что ключевые изменения в позе лапы часто пропустили.
3. Копируйте включенный код (проект) в "SR Automation-dig-ext-card-64bit" на компьютер.

3. Поведенческая подготовка

1. Подготовьте крыс перед тренировкой.
   1. Дом Лонг-Эванс крыс (мужчины или женщины, в возрасте 10-20 недель) в группах 2-3 в клетку на обратном свет / темный цикл. За три дня до тренировки, место крыс на ограничение пищи для поддержания массы тела 10-20% ниже базового уровня.
   2. Обработка крыс в течение нескольких минут в день, по крайней мере 5 дней. После обработки, место 4-5 гранул сахара на крысу в каждой домашней клетке, чтобы ввести новую пищу.
2. Привычка крысы к камере достижения (1-3 дней)
   1. Включите светодиодные фонари и поместите 3 сахарных гранулы в передней и задней части камеры.
   2. Поместите крысу в камеру и позвольте крысе исследовать в течение 15 мин. Монитор, если она ест гранулы. Повторите эту фазу, пока крыса ест все гранулы от пола.
   3. Очистите камеру этанолом между крысами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните обучение и тестирование во время темной фазы. Поезд крыс в то же время ежедневно.
3. Поезд крысы достичь и соблюдать лапы предпочтения (1-3 дней).
   1. Включите свет и поместите крысу в квалифицированную камеру достижения.
   2. Используя щипцы, держите гранулы через достижение слот в передней части коробки(Рисунок 1, Рисунок 2). Разрешить крысе съесть 3 гранулы из щипц.
   3. В следующий раз, когда крыса попытается съесть гранулы из щипц, потяните гранулы обратно. В конце концов, крыса будет пытаться достичь для гранул с лапой.
   4. Повторите это 11 раз. Лапа, что крыса использует большинство из 11 попыток крысы "лаппредпочтение".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Попытка определяется как лапа, протягивающаяся мимо идущего слота. Крысе не нужно успешно получать и есть гранулы.
4. Поезд крысы, чтобы добраться до гранул ыродка (1-3 дней)
   1. Выровняйте стержень доставки гранул со стороной достижения слот аталоратеральной к предпочтительной лапе крысы (использовать руководство для обеспечения последовательного размещения 1,5 см от передней части камеры достижения). Верхняя часть стержня доставки должна выровняться с нижней частью слота(рисунок 2B). Поместите гранулы на штангу доставки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Позиционирование доставки стержня напротив крысы предпочтительным лапу делает его трудным для крысы, чтобы получить гранулы с его непредпочтительным лапой. У нас не было проблем с крысами, используя их непредпочтительную лапу. Тем не менее, в некоторых моделях (например, инсульт) это все еще может произойти, и ограничение на непредпочтительные достижения конечности могут быть добавлены.
   2. Приманка крыса с гранулами провел с помощью щипцы, но направить крысу к доставке стержня так, что его лапа хитов гранулы на стержня. Если крыса сбивает гранулы с стержня, замените его. Некоторые крысы не могут первоначально выйти достаточно далеко. В этом случае, переместить гранулы доставки стержня ближе к достижению слот, а затем медленно переместить его дальше, как крыса улучшается.
   3. Примерно через 5-15 наживкой достигает крыса начнет тянуться к гранулы на доставку стержня спонтанно. После того, как крыса попыталась 10 достигает доставки стержня без приманки, он может перейти к следующему этапу.
5. Поезд крысы просить гранулы (2-8 дней).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя у нас было 100% успеха подготовки крыс для достижения гранулы, около 10% крыс не в состоянии научиться просить гранулы, перемещаясь в задней части камеры.
   1. Позиция гранул доставки стержня на основе лапы крысы предпочтения и установить его на позицию 2 (Рисунок2A). Установите высотные позиции стержня доставки гранул с помощью пульта дистанционного управления. Удерживая кнопки 1 и 2 одновременно перемещает стержень доставки вверх, удерживая при этом кнопки 3 и 2 перемещает стержень доставки вниз. Когда родосна доставки находится на правильной высоте, удерживайте нужное число до тех пор, пока свет не мигает красным цветом.
   2. Поместите крысу в камеру и приманки крысы к спине с гранулами. Когда крыса движется достаточно далеко к задней части камеры, что она будет нарушать инфракрасный луч, если автоматизированная версия работает, переместить гранулы доставки стержня на позицию 3 (Рисунок 2B).
   3. Подождите, пока крыса, чтобы достичь для гранул, а затем переместить гранулы доставки стержня обратно в положение 2 (Рисунок2A). Поместите новый гранулы на стержень доставки, если он был сбит.
   4. Повторите эти шаги, постепенно травля крысы все меньше и меньше, пока крыса начинает: (i) двигаться к спине, чтобы просить гранулы без приманки, и (ii) сразу же перейти на фронт после запроса гранулы в спину. После того, как крыса сделала это 10 раз, она готова к обучению на автоматизированной задачи.

4. Обучение крыс с использованием автоматизированной системы

1. Настройка автоматизированной системы.
   1. Включите свет в камере и пополнить резервуар гранул ы, если это необходимо.
   2. Позиция гранул доставки стержня в соответствии с лапой крысы предпочтения. Убедитесь, что позиции актуатора установлены правильно (как на рисунке 2A).
   3. Включите компьютер и откройте программу «Квалифицированная охвата» (SR'dig-extension-card)(HOST)-3.vi). Введите идентификационный номер крысы в соответствии с темой и выберите предпочтение лапы из меню выпадения руки. Укажите путь сохранения для видео.
   4. Установите время сеанса и видео Макса (количество видео, на котором можно закончить сеанс). Программа перестанет работать на крайнем уровне, который будет достигнут в первую очередь.
   5. Установите Pellet Lift Duration (длительность времени, что родосвод остается в положении "3" после того, как крыса просит гранулы). Включить или отключить штраф раннего достижения (доставка стержня сбрасывает на положение "1", а затем обратно в "2", если крыса достигает до запроса гранулы).
2. Возьмите калибровочные изображения. Реконструкция трех-D траектории использует набор инструментов компьютерного зрения для определения соответствующих матриц преобразования, что требует определения соответствующих точек в каждом представлении. Для этого используйте небольшой кубик с шаблонами шашкой с каждой стороны(рисунок 3).
   1. Поместите руку помощи внутри камеры достижения и ткнуть клип аллигатора через достижение слот. Держите куб перед слотом достижения с клипом аллигатора.
   2. Расположите куб так, чтобы красная сторона появилась в верхнем зеркале, зеленая сторона в левом зеркале и синяя сторона в правом зеркале. Вся грань каждой из трех сторон должна быть видна в зеркалах(рисунок3).
   3. В поведенческой программе убедитесь, что порог рентабельности инвестиций установлен на очень большое значение (например, 60000). Нажмите кнопку "Бег" (белая стрелка). Как только кнопка инициализированной камеры становится зеленой, нажмите СНВ. Обратите внимание, что видео приобретается.
   4. Нажмите Calрежиме . Затем, возьмите изображение, нажав Take Cal Image. Путь каталога изображений теперь будет отображаться под ".png путь" с .png файловое имя под форматируется как "GridCalibration-YYYMMDD'img.png".
   5. Переместите куб немного, и возьмите другое изображение. Повторите еще раз в общей сложности 3 изображения.
   6. Остановите программу, нажав STOP, а затем кнопку стоп-знака. Снимите руку помощи и куб из коробки.
   7. Будьте осторожны, чтобы не ударить что-нибудь в поведенческой камере после калибровки изображения были приняты в тот день. Если что-то движется, необходимо сделать новые калибровочные изображения.
3. Запустите автоматизированную систему.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Определите настройки "RoI Threshold" (описанные ниже) для каждого зеркала перед запуском крыс для фактического приобретения данных. После того, как эти параметры были определены, заранее установить их перед началом программы и настроить во время приобретения, если это необходимо.
   1. Поместите крысу в квалифицированную камеру достижения. Нажмите на белую стрелку, чтобы запустить программу.
   2. Перед нажатием на СНВ, установите положение рентабельности инвестиций для обнаружения лап путем регулировки x-Offset (x-координация верхнего левого угла прямоугольника ROI), y-Offset (y-координатор верхнего левого угла ROI), ROI Ширина и ROI Высота.
   3. Позиция рентабельности инвестиций в боковое зеркало, которое показывает стропту лапы, прямо перед слотом достижения(рисунок 2C). Убедитесь, что стержень доставки гранул не входит в рентабельность инвестиций и что рентабельность инвестиций не распространяется в поле, чтобы предотвратить гранулы или мех крысы от запуска видео, когда крыса не достигает.
   4. Нажмите НА START, чтобы начать программу.
   5. Отрегулируйте значение "Низкий порог рентабельности инвестиций" до тех пор, пока "Значение триггера live ROI" не колеблется между "0" и "1" (когда крыса не достигает). Это значение — количество пикселей в пределах рентабельности инвестиций со значениями интенсивности в пороговом диапазоне.
   6. Установите порог рентабельности инвестиций. Обратите внимание на Live ROI Триггер Значение, когда крыса тычет носом в рентабельность инвестиций и когда крыса тянется к гранулы. Установите порог рентабельности инвестиций, чтобы быть значительно больше, чем "Live ROI Триггер Значение" во время носа тыкает и ниже, чем "Live ROI Триггер Значение", когда крыса достигает. Отрегулируйте до тех пор, пока видео постоянно срабатывает, когда крыса достигает, но не тогда, когда она тычет носом через слот
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это предполагает, что лапа светлее, чем нос; корректировки будут отменены, если лапа темнее носа.
   7. Мониторинг первых нескольких испытаний, чтобы убедиться, что все работает правильно. Когда крыса достигает, прежде чем запрашивать гранулы (род доставки в положении "2"), "Ранние достижения" число увеличивается. Когда крыса достигает после запроса гранулы (род доставки в положении "3"), число "Видео" увеличивается, и видео сохраняется в виде файла .bin с именем "RXXXX-YYYMMDD"HH-MM-SS'trial".
      ПРИМЕЧАНИЕ: По умолчанию для видео, чтобы содержать 300 кадров (т.е., 1 с) до и 1000 кадров после триггера события (это настраивается в программном обеспечении), который достаточно долго, чтобы содержать весь охват к захвату движения, включая опровержение лапы.
   8. После достижения времени сеанса или максимального видео программа останавливается. Нажмите кнопку знака стоп.
   9. Очистите камеру с этанолом и повторить с другой крысы, или, если сделать в течение дня приступить к преобразованию видео.
4. Преобразование файлов .bin в файлы .avi.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сжатие видео во время приобретения вызывает падение кадров, поэтому двоичные файлы передаются на диск во время приобретения (использовать твердотельный диск из-за высоких скоростей передачи данных). Эти двоичные файлы должны быть сжаты в автономном режиме или требования к хранению непомерно велики.
   1. Откройте программу "bin2avi-color"1473R-nocode.vi.
   2. В "File Path Control" нажмите кнопку папки, чтобы выбрать сеанс (например, R0235-20180119a), который вы хотите преобразовать. Повторите для каждого сеанса (до шести).
   3. Нажмите на белую стрелку (запуск), а затем "START", чтобы начать. Мониторинг видеосжатия можно в "Общий прогресс (%) Бар. Пусть программа работает в одночасье.
   4. Перед тем, как начать обучение животных на следующий день, убедитесь, что видео были преобразованы и удалить файлы .bin так что есть достаточно места для приобретения новых видео.

5. Анализ видео с DeepLabCut

ПРИМЕЧАНИЕ: Различные сети обучены для каждого лапового предпочтения (правая лапа и левая лапа) и для каждого вида (прямой вид и левое зеркало зрения для правых лапкрыс, прямой вид и правое зеркало зрения для левой лапы крыс). Вид верхнего зеркала не используется для 3D-реконструкции – просто для того, чтобы обнаружить, когда нос входит в слот, что может быть полезно для запуска вмешательств (например, оптогенетики). Каждая сеть затем используется для анализа набора видео обрезается для соответствующей лапы и просмотра.

1. Обучите сети DeepLabCut (подробные инструкции приведены в документации DeepLabCut по https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut).
   1. Создайте и назначьте новый проект в DeepLabCut, алгоритм машинного обучения для оценки бесмаркерной позы^13.
   2. Используйте программу для извлечения кадров из квалифицированных видеозаписей и изображений сельскохозяйственных культур, чтобы включить (прямое или зеркальное представление) в интерфейс программы. Урожай кадры достаточно большой, так что крыса и обе передние лапы видны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сети обычно требуют 100-150 тренировочных кадров. Дополнительные учебные рамы необходимы, когда лапа внутри по сравнению с внешней камерой из-за освещения. Более жесткое обрезка сокращает время обработки, но будьте осторожны, что обрезанные регионы достаточно велики, чтобы обнаружить полную траекторию лапы для каждой крысы. Она должна быть достаточно широкой, чтобы все тело крысы вписывалось в раму (прямой вид), и чтобы увидеть как можно больше назад в камеру и перед дочкой доставки (зеркальный вид).
   3. Используйте графический интерфейс программы для обозначения частей тела. Этикетка 16 точек в каждом кадре: 4 метакарпофаланга (MCP) суставов, 4 проксимальных межфаланговых (PIP) суставов, 4 цифры советы, dorsum достижения лапы, нос, сница неохватывая лапа, и гранулы (Рисунок 4).
   4. Следуйте инструкциям DeepLabCut (сокращенно DLC отныне) для создания набора обучаемых данных, обучения сети и оценки подготовленной сети.
2. Проанализируйте видео и уточните сеть.
   1. Прежде чем анализировать все видео с помощью недавно обученной сети, проанализируйте 10 видео, чтобы оценить производительность сети. При наличии последовательных ошибок в определенных позах извлекайте дополнительные тренировочные кадры, содержащие эти позы, и переучивайте сеть.
   2. При анализе видео, убедитесь, что вывод .csv файлы, которые будут подаваться в код для 3D реконструкции траектории.

6. Калибровка коробки

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти инструкции используются для определения матриц преобразования для преобразования точек, определенных в прямых и зеркальных представлениях, в трех-D координаты. Для самой актуальной версии и более подробной информации о том, как использовать пакет boxCalibration, с https://github.com/LeventhalLab/boxCalibrationм.

1. Соберите все калибровочные изображения в одной папке.
2. Используя ImageJ/Fiji, вручную отметьте точки пропуска для каждого калибровообразуемого изображения. Сохраните это изображение под словам "GridCalibration"YYYMMD".tif", где 'YYYMMDD' является датой, которой соответствует калибровочное изображение, и '' - это номер изображения для этой даты.
   1. Используйте функцию измерения в ImageJ (в панели инструментов, выберите Анализ Мера). На этом будет отображаться таблица, содержащая координаты для всех отмеченных точек. Сохраните этот файл с именем "GridCalibration-YYYMMDD.csv", где дата и номер изображения совпадают с соответствующим файлом .tif.
3. Из пакета калибровки коробки откройте файл 'setParams.m'. Этот файл содержит все необходимые переменные и их описание. Отожобье переменных по мере необходимости, чтобы соответствовать спецификациям проекта.
4. Выполнить функцию калибровкиКоробки. В окне команды появится несколько запросов. Первый запрос спрашивает, следует ли анализировать все изображения в папке. Ввод Y закончится подсказки, и все изображения для всех дат будут проанализированы. Ввод N подскажет пользователю ввести даты для анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В папке калибровочных изображений будут созданы два новых каталога: 'markedImages' содержит файлы .png с определенными знаками контрольной панели на изображении калибровки. Папка «Box Calibration» содержит файлы .mat с параметрами калибровки коробки.
5. Запустите функцию checkBoxКалибра. Это создаст новую папку ,проверить калибровку' в папке 'boxCalibration'. Каждая дата будет иметь субфолдер, содержащий изображения и несколько файлов .fig, которые используются для проверки того, что калибровка коробки была завершена точно.

7. Реконструкция 3D траекторий

1. Соберите файлы .csv, содержащие выход учебной программы, в структуру каталога, описанную в сценарии reconstruct3Dtrajectories.
2. Выполнить реконструкцию3Dtrajectories. Этот скрипт будет искать структуру каталога и сопоставлять прямые/зеркальные точки на основе их имен в наклонной программе (важно использовать одни и те же имена частей тела в обоих представлениях).
3. Выполнить расчетКинематики. Этот скрипт извлекает простые кинематические элементы из трех-D реконструкций траектории, которые могут быть адаптированы к конкретным потребностям.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение оценивает положение окклюзионных частей тела на основе их соседей и их расположение в комплементарном представлении (например, расположение части тела в прямом представлении камеры ограничивает его возможные расположения в зеркальном представлении). В те моменты, когда лапа закрывается в зеркальном представлении, проходя через слот, координаты лап интерполируются на основе соседних кадров.

Результаты

Крысы приобретают квалифицированную задачу достижения быстро после акклиматизации к аппарату, с производительностью плато с точки зрения как количество достигает и точность в течение 1-2 недель (Рисунок 5). На рисунке 6 показаны примеры видеокадров, указывающих на структуры, идентифицированные DeepLabCut, а на рисунке 7 показаны наложенные индивидуальные траектории достижения из одного сеанса. Наконец, на рисунке

Обсуждение

Родоводство опытное достижение стало стандартным инструментом для изучения физиологии двигательной системы и патофизиологии. Мы описали, как реализовать автоматизированную крысу квалифицированных достижения задача, которая позволяет: обучение и тестирование с минимальным наблюдением, 3-D лапы и цифры реконструкции (во время достижения, захвата, и лапы опрокидывания), в режиме реального времени идентификации лапа во время достижения, и синхронизации с внешней электроникой. Он хорошо подходит для корреляции кинематики пере...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
прозрачные панели из поликарбоната	TAP Пластик		резка на заказ (см. конструкцию коробки)
инфракрасный источник/детектор	Med Associates	ENV-253SD	30-дюймовая
камера	диапазона Basler	acA2000-340kc	2046 x 1086 CMV2000 340 кадров в секунду Цветная камера Link
объектив камеры	Мегапиксель (компьютар)	M0814-MP2	2/3" 8 мм f1.4 с блокировкой диафрагмы и
Кабели камеры	Basler	#2000031083	Кабель PoCL Camera Link SDR/MDR Full, 5 м - Кабели передачи данных
зеркала	Amazon
Linear Actuator	Concentrics	LACT6P	Linear Actuator 6" Stroke (номинальный), 110 Lb Force, 12 В постоянного тока, с потенциометром
резервуар/воронка для гранул	Amico (Amazon)	a12073000ux0890	6" воронка
направляющая трубка	ePlastics	ACREXT.500X.250	1/2" OD x 1/4" ID Clear. Экструдированный акриловый трубка из плексигласа x 6 футов длинный
стержень для доставки гранул	ePlastics	ACRCAR.250	0,250 дюйма DIA. Литой акриловый стержень (длина 2 фута)
пластиковый Т-образный соединитель	United States Plastic Corp	# 62065	3/8 " x 3/8" x 3/8" ID шланга ID Черный тройник HDPE
светодиодные светильники	Освещение EVER	4100066-DW-F	Гибкая водонепроницаемая светодиодная лента 12 В, светодиодная лента, дневной свет белый, сверхяркий 300 единиц 5050 светодиодов, 16,4 фута 5 м катушка
фонарь подложка	из пластика	ACTLNAT0,125 x 12 x 36	дюймов натуральный ацеталь лист
диффузор	23114-01,007x8,5	x 11 ", матовый двухсторонний
шкаф и нестандартные материалы рамы	различные (Home Depot и т. Д.)		Древесноволокнистая плита 3/4 дюйма (размеры каждой конструкции см. в протоколе)
акустическая пена	Acoustic First		FireFlex Wedge Акустическая пена (толщина 2 дюйма)
вентиляционные вентиляторы	Cooler Master (Amazon)	B002R9RBO0	Винтовочный подшипник 80 мм Бесшумный охлаждающий вентилятор для корпусов компьютеров и процессорных кулеров
Дверцы шкафа петли	Everbilt (Home Depot	#14609	непрерывная стальная петля (1,4" x 48")
колеса шкафа	Everbilt (Home Depot	#49509	Мягкая резиновая поворотная пластина ролик с номинальной нагрузкой 90 фунтов и боковой
ручкой дверцы тормозного шкафа	Everbilt (Home Depot	#15094	Белая легкая дверная тяга (4,5 ")
компьютер	Hewlett Packard	Z620	HP Z620 Настольная рабочая станция
Камера Link Frame Grabber	National Instruments	#781585-01	PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Связь с камерой - Полная
многофункциональная плата RIO	National Instruments	#781100-01	PCIe-17841R
Аналоговый кабель RIO Плата	National Instruments	SCH68M-68F-RMIO	Многофункциональный кабель
Цифровой кабель RIO Board Cable	National Instruments	#191667-01	SHC68-68-RDIO Цифровой кабель для
аналоговой клеммной колодки	National Instruments	#782536-01	SCB-68A Шумоподавление, экранированный блок разъемов ввода-вывода
Цифровая клеммная колодка	National Instruments	#782536-01	SCB-68A Шумоподавление, экранированный блок разъемов ввода-вывода
24-позиционная релейная стойка	Measurement Computing Corp.	SSR-RACK24	Твердотельная релейная объединительная плата (реле типа Gordos/OPTO-22), 24-канальный
переключатель постоянного тока	Measurement Computing Corp.	SSR-ODC-05	Модуль твердотельного реле, одиночный, переключатель постоянного тока, от 3 до 60 В постоянного тока @ 3,5 А
DC	Sense Measurement Computing Corp.	SSR-IDC-05	Твердотельный релейный модуль, одиночный, датчик постоянного тока, от 3 до 32 В
постоянного тока Источник питания постоянного тока	BK Precision	1671A	Тройной выход 30 В, 5 А Цифровой дисплей Источник питания постоянного тока
Сахарные гранулы	Bio Serv	F0023	Беспыльные прецизионные гранулы, 45 мг, сахароза (без ароматизаторов)
LabVIEW	National Instruments	LabVIEW 2014 SP1, 64 и 32-разрядные версии	64-разрядный LabVIEW требуется для доступа к достаточному объему памяти для потоковой передачи видео, но кодирование FPGA должно выполняться в 32-разрядном LabVIEW
MATLAB Программное	обеспечение для калибровки и реконструкции траектории Matlab R2019a написано на Matlab и требует набора инструментов компьютерного зрения