Методическая статья

Анализ микробиоты с использованием двухступенчатого ПЦР и секвенирования гена нового поколения 16S rRNA

DOI:

10.3791/59980

⸱

15 октября 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Iowa, 2Medical Scientist Training Program, University of Iowa, 3Graduate Program in Immunology, University of Iowa, 4Graduate Program in Molecular Medicine, University of Iowa

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описана упрощенная стандартная операционная процедура профилирования микробиома с использованием метагеномного секвенирования и анализа 16S rRNA с использованием свободно доступных инструментов. Этот протокол поможет исследователям, которые являются новыми для области микробиома, а также тех, кто требует обновления методов для достижения бактериального профилирования с более высоким разрешением.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кишечник человека колонизирован триллионами бактерий, которые поддерживают физиологические функции, такие как метаболизм продуктов питания, сбор энергии и регуляция иммунной системы. Возмущение здорового микробиома кишечника было предложено играть определенную роль в развитии воспалительных заболеваний, в том числе рассеянного склероза (МС). Экологические и генетические факторы могут влиять на состав микробиома; таким образом, выявление микробных сообществ, связанных с фенотипом болезни, стало первым шагом на пути к определению роли микробиома в здоровье и болезнях. Использование 16S rRNA метагеномных секвенирования для профилирования бактериального сообщества помогло в продвижении микробиома исследований. Несмотря на широкое использование, не существует единого протокола для анализа таксономического профилирования на основе 16S rRNA. Другим ограничением является низкое разрешение таксономического назначения из-за технических трудностей, таких как меньшее секвенирование читает, а также использование только вперед (R1) читает в конечном счете из-за низкого качества реверса (R2) читает. Существует необходимость в упрощенном методе с высоким разрешением для характеристики бактериального разнообразия в данном бионезоле. Достижения в области технологии секвенирования с возможностью секвенирования более длинных считываемых с высоким разрешением помогли преодолеть некоторые из этих проблем. Современная технология секвенирования в сочетании с общедоступным метагеномным анализом трубопровода, такого как R-основанный раскол Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) помогла продвинуть микробное профилирование с высоким разрешением, так как DADA2 может назначить последовательность в роду и видов. Описано здесь руководство для выполнения бактериального профилирования с использованием двухступенчатого усиления V3-V4 области гена 16S rRNA, а затем анализ с использованием свободно доступных инструментов анализа (т.е., DADA2, Phyloseq, и METAGENassist). Считается, что этот простой и полный рабочий процесс послужит отличным инструментом для исследователей, заинтересованных в проведении исследований микробиома профилирования.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микробиота относится к коллекции микроорганизмов (бактерий, вирусов, археев, бактериофагов и грибов), живущих в определенной среде, и микробиом относится к коллективному геному резидентных микроорганизмов. Как бактерии являются одним из наиболее распространенных микробов у людей и мышей, это исследование сосредоточено только на бактериальных профилирования. Кишечник человека колонизирован триллионами бактерий и сотнями бактериальных штаммов1. Нормальная микрофлора кишечника играет жизненно важную роль в поддержании здорового состояния у хозяина путем регулирования функций (т.е. поддержания нетронутого кишечного барьера, пищевого метаболизма, энергетического гомеостаза, ингибирования колонизации патогенными организмами, и регуляция иммунных реакций)2,3,4,5. Композиционные возмущения микрофлоры кишечника (китидисковый дисбактериоз) были связаны с рядом заболеваний человека, включая желудочно-кишечные расстройства6,ожирение7,8,инсульт9, рак10, диабет8,11, ревматоидный артрит12, аллергии13, и центральной нервной системы, связанных с заболеваниями, такими как рассеянный склероз (MS)14,15 и болезнь Альцгеймера болезни (Ад)8,16. Поэтому в последние годы растет интерес к инструментам для определения бактериального состава на различных участках тела. Надежный метод должен иметь такие характеристики, как высокая пропускная способность и простота в использовании, способность классифицировать бактериальную микробиоту с высоким разрешением и быть недорогой.

Микробиологические методы, основанные на культуре, недостаточно чувствительны, чтобы выявить и охарактеризовать сложный микрофлору кишечника из-за неспособности нескольких кишечных бактерий расти в культуре. Появление технологии на основе секвенирования, особенно 16S rRNA основе метагеномного секвенирования, преодолелнекоторые некоторые из этих проблем и преобразованы микробиом исследования17. Расширенная технология секвенирования на основе 16S rRNA помогла установить важнейшую роль микрофлоры кишечника в здоровье человека. Проект микробиома человека, инициатива18Национальных институтов здравоохранения и проект MetaHIT (европейская инициатива)19 помогли в создании базовой основы для анализа микробиома. Эти инициативы помогли начать многочисленные исследования для определения роли микрофлоры кишечника в здоровье и болезнях человека.

Ряд групп показали дисбактериоз кишечника у пациентов с воспалительными заболеваниями12,14,15,20,21,22. Несмотря на широкое использование для таксономического профилирования из-за способности к мультиплексу и низким затратам, не существует единых протоколов для таксономического профилирования на основе 16S rRNA. Другим ограничением является низкое разрешение таксономического назначения из-за меньшего секвенирования считывает (150 bp или 250 bp) и использования только вперед секвенирования читать (R1) из-за низкого качества обратного секвенирования читает (R2). Тем не менее, достижения в области технологии секвенирования помогли преодолеть некоторые из этих проблем, таких как способность последовательности больше читает с помощью парного конца читает (например, Illumina MiSeq 2x300bp).

Нынешняя технология секвенирования может секвенировать 600 bp хорошего качества читает, что позволяет слияние R1 и R2 читает. Эти слитые более длинные R1 и R2 считывания позволяют улучшить таксономические назначения, особенно с платформой с открытым доступом R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2). DADA2 использует ампликонпоследовательности вариант (ASV) на основе назначений вместо оперативной таксономической единицы (OTU) назначения на основе 97% сходства используется в ЦИМЕ23. AsV матчи приводят к точной последовательности в базе данных в пределах 1-2 нуклеотидов, что приводит к назначению на уровне рода и видов. Таким образом, сочетание более длинных, качественных парных считываемых и более эффективных таксономических инструментов назначения (таких как DADA2) преобразовало исследования микробиома.

Приведено здесь пошаговым руководством для выполнения бактериального профилирования с использованием двухступенчатого усиления V3-V4 области 16S rRNA и анализа данных с использованием DADA2, Phyloseq, и METAGENassist трубопроводов. Для этого исследования используются человеческие лейкоцитные антигены (HLA) II трансгенных мышей класса, так как некоторые аллели HLA класса II связаны с предрасположенностью к аутоиммунным заболеваниям, таким как MS20,24,25. Однако, важность генов класса HLA II в регулировании состава кишечной микробиоты неизвестна. Предполагается, что молекула HLA класса II будет влиять на кишечное микробное сообщество, выбирая для конкретных бактерий. Основной комплекс гистосовместимости (MHC) класса II нокаут мышей (AE.KO) или мышей, выражающих человеческие молекулы HLA-D-8 (HLA-D'8)24,25,26 были использованы для того, чтобы понять важность HLA класса II молекул в формирование кишечного микробного сообщества. Считается, что этот полный и упрощенный рабочий процесс с R-анализом данных послужит отличным инструментом для исследователей, заинтересованных в проведении исследований микробиома.

Поколение мышей не хватает эндогенных мурин MHC класса II генов (AE.KO) и AE-/-. HLA-D'A1'0103, D'B1'0302 (HLA-D'8) трансгенных мышей с C57BL/6J фон был описан ранее26. Образцы фекальных образцов собираются у мышей обоих полов (8-12 недель). Мыши были ранее выведены и поддерживается в Университете штата Айова животных объекта в рамках NIH и институциональных руководящих принципов. Стратегии контроля загрязнения, такие как отляг мышей внутри ламинарного шкафа потока, изменение перчаток между различными штаммами мышей, и надлежащее содержание мышей являются критическими шагами для профилирования микрофлоры кишечника.

Надлежащее индивидуальное защитное оборудование (PPE) настоятельно рекомендуется в течение всей процедуры. Соответствующие негативные меры контроля должны быть включены при выполнении мер по изоляции ДНК, усилению ПЦР1 и ПЦР2 и последовательности. Рекомендуется использовать стерильные, dNase-free, RNase-free, и pyrogen-free supplies. Назначенный пипеттор для работы микробиома и фильтрованные советы пипетки должны использоваться во всем протоколе. Анализ микробиоты состоит из семи этапов: 1) сбор и обработка фекальных образцов; 2) экстракция ДНК; 3) усиление гена 16S rRNA; 4) конструкция библиотеки ДНК с использованием индексированного ПЦР; 5) очистка и количественная оценка индексируемого ПЦР (библиотека); 6) секвенирование MiSeq; и 7) обработка данных и анализ последовательности. Схематическая диаграмма всех этапов протокола отображается на рисунке 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Университета Айовы.

1. Фекальные сбор ые образца и обработка

  1. Стерилизовать разделитель ные ящики (см. Таблицу материалов, Дополнительная рисунок 1) с 70% этанола.
  2. Предварительно метка микроцентрифуговых труб (по одному на мышь) с идентификатором образца и группой обработки (если это применимо).
  3. Поместите мышей в стерилизованные ящики делителя и дайте им испражняться нормально до 1 ч.
  4. Соберите фекальные гранулы в пустой, предварительно помеченной 1,5 мл микроцентрифуговой трубки с помощью стерильных щипочек и закройте трубку надежно. Стерилизовать щипточки после сбора с каждой мыши.
  5. Поместите микроцентрифугную трубку, содержащую фекальные гранулы, в морозильную камеру -80 градусов до дальнейшей обработки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коробки разделителя являются выгодными, поскольку они позволяют одновременно йогаетировать образцы фекалий у нескольких мышей (до 12) одновременно.

2. Извлечение ДНК

  1. Удалите фекальные образцы (мышь или человека) из морозильной камеры и оттаивайте при комнатной температуре (RT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется разморозить образцы стула человека на ночь при 4 градусах по Цельсию по мере необходимости для сбора 200 мг или необходимого количества из образцов запасов.
  2. Используйте 200 мг исходных материалов и элитной ДНК до конечного объема в 50 л.
  3. Включите набор изоляции ДНК пустой, в котором не фекальный образец добавляется, но обрабатывается через все шаги экстракции ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Специфический набор изоляции ДНК (см. Таблица материалов) был использован, так как он содержит специфические реагенты для удаления ингибирующих материалов, таких как биосолисты, непереваренный растительный материал и соединения гема из лизинированных красных кровяных клеток, присутствующих в стуле человека и мыши Образцы.
  4. Поместите трубку из биса в гомогенизатор (см. Таблицу Материалов)и гомогенизуйте образцы на 45 с на RT и скорость 4,5 м/с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бисобить гомогенизатор от любого производителя могут быть использованы. Тем не менее, рекомендуется стандартизировать метод, в частности, скорость и продолжительность гомогенизации, при использовании бис-избиения гомогенизатор от другого поставщика.
  5. Изолировать ДНК из отдельных образцов машки фекальные с помощью бактериального комплекта изоляции ДНК после протокола производителя (см. Таблица материалов) с незначительными изменениями. Количественно выделение изолированной ДНК путем загрузки 1 Зл ДНК на фторметр или на чип электрофорекс высокой чувствительности (см. Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый выход ДНК может варьироваться от 500-2500 нг, когда начиная с 200 мг фекального образца.
  6. Отрегулируйте концентрацию ДНК до 4-20 нг/л с помощью буфера elution. Реквантифицировать ДНК (как это делается в шаге 2.5), прежде чем приступить к 16S rRNA усиление гена (PCR1), если PcR1 не выполняется в тот же день.

3. 16S rRNA усиление гена (PCR1)

  1. Настройка 16S rRNA усиление гена (PCR1) в 96 хорошо ПЦР пластины с использованием 25 л объем реакции.
  2. Используя многоканальную пипетку, добавьте 12,5 л 2-х высокой точности полимеразной ферментной смеси, включая буфер, в дополнение к dNTPs (см. Таблица материалов):40 нг ДНК в до 10,5 л общего объема (настроить общий объем с помощью воды класса ПЦР): 1 Л (каждый) вперед и обратные грунтовки при концентрации 1 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности грунтовок таковы:
    вперед праймер 5'-TCGTGGCAGCGTCA GATGTGTATAGAGA CAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' обратный грунт No 5'-GTCTCGGGGCCGGGAGGATGTA TaAGAGCACAACTACHVGGGTATTAATC C-3'. Включите сжалкую комплект из шага 2.3 (контроль реагента комплекта) в пластине ПЦР.
  3. Печать пЦР пластины и центрифуги на 1000 х г при 20 градусов по Цельсию в течение 1 мин в столешной плите центрифуги (см. Таблица материалов) и выполнять ПЦР в тепловой цикл, запрограммированный на: 95 кв кв в течение 3 мин; 25 циклов по 1) 95 градусов по Цельсию на 30 с, 2) 55 градусов по Цельсию на 30 с, 3) 72 градуса по Цельсию на 30 с; окончательное расширение при 72 градусах по Цельсию в течение 5 мин; и удерживайте при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя этот метод усиления гена 16S rRNA должен работать с различными типами биоспеционаторов, рекомендуется стандартизировать количество циклов усиления при запуске нового проекта.
  4. Подтвердите размер продукта ПЦР1, загрузив 1 зл ДНК на чип электрофореза высокой чувствительности. Кроме того, запустить 5 зЛ 16S rRNA-усиленный продукт на 1,5% агарозный гель, чтобы подтвердить 550 bp продукта PCR1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка усиливаемого продукта 16S rRNA является необязательной и зависит от используемого комплекта/метода изоляции ДНК. При использовании внутреннего метода изоляции ДНК, продукт PCR1 может быть очищен с использованием комплекта очистки ДНК микробиома в рамках протокола производителя (см. Таблица материалов). Используемый здесь комплект изоляции ДНК дает ультрачистую ДНК и не требует очистки продукта ПЦР1.

4. Строительство библиотеки ДНК с использованием индексированных ПЦР (PCR2)

  1. Поместите индекс 1 и индекс 2 штрих-кодами в специальную стойку (см. Таблицу Материалов) для 96 библиотек.
    1. Упорядочить индекс 1 праймер в столбцах 1-12 и индекс 2 грунтовки в строках A-H специальной стойки.
    2. Добавьте 2,5 зл и l индекса 1 в столбцы 1-12 и индекс 2 грунтовки в строках A-H с помощью многоканальных пипетков. Поместите новую крышку (см. Таблицу Материалов) на Индекс 1 и Индекс 2 усыновителей праймеры и хранить его в морозильной камере -20 градусов.
  2. Используя многоканальный пипетки, добавьте 12,5 зл и л из 2-х высокой точности полимеразной ферментной смеси, содержащей буфер, в дополнение к dNTPs(см. Таблица материалов); 5 зЛ воды класса ПЦР и 2,5 л 16С rRNA-усиленного продукта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте уникальные индексы к каждому образцу для мультиплексирования более 96 библиотек за один запуск, как описано в Kiernan et al.27. В настоящем протоколе используются адаптеры из коммерческого комплекта (например, Nextera XT Index Kit) в соответствии с инструкцией производителя, предусмотренной методом секвенирования метагеномики 16S (например, Illumina).
  3. Печать и центрифуга индексируемой пЦР пластины на 1000 х г при 20 градусах по Цельсию в течение 1 мин и выполнять ПЦР в тепловой цикл, запрограммированный на: 95 градусов по Цельсию в течение 3 мин; 8 циклов из 1) 95 градусов по Цельсию на 30 с, 2) 55 градусов по Цельсию на 30 с, 3) 72 градуса по Цельсию на 30 с; и окончательное расширение при 72 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
  4. Подтвердите размер 630 базового проиндексированного продукта ПЦР, загрузив 1 зл ДНК на чип электрофоразвысокой высокой чувствительности. Кроме того, запустите 5 зЛ индексируемого пЦР-продукта на 1,5% геля агарозы, чтобы подтвердить размер и интенсивность продукта.

5. Очистка индексированных ПЦР (ПЦР2) и количественная оценка

  1. Бассейн 5 ЗЛ ампликона PCR2 с использованием многоканальных пипетков из каждой скважины в многоканальный лоток резервуара, свободный от обнаруживаемых DNase, RNase, ДНК человека и пирогенных бактерий (см. Таблица Материалов).
  2. Перенесите объединенный продукт из многоканального лотка резервуара в пустую, предварительно маркированную микроцентрифугную трубку и вихрь мощностью 1,5 мл.
  3. Очистите продукт PCR2 с помощью стандартного комплекта магнитных бусин(см. Таблица Материалов) в рамках инструкции производителя. Печать и хранить оставшиеся 20 qL ПЦР2 в той же пластине при -80 градусов по Цельсию для дальнейшего использования, если это необходимо.
  4. Приготовьте свежий 80% этанола, добавив 4 мл 100% этанола до 1 мл воды класса ПЦР.
  5. Уравновесите магнитный шарик к RT и вихрь в течение 30 с, чтобы равномерно разогнать бусины.
  6. Кратко вихрь и спина вниз объединенных образцов амплекона PCR2.
  7. Добавьте 80 л магнитных бусин октядрий в предварительно маркированную, стерильную микроцентрифуговую трубку 1,5 мл с 80 злицу объединенных продуктов ПЦР, затем вихрь и ненадолго свернуть, чтобы равномерно переостереть магнитные бусы.
  8. Инкубировать содержимое на RT, не нарушая трубки в течение 15 минут.
  9. Поместите трубку с ДНК и магнитными бусинками на магнитной подставке(см. Таблица Материалов) в течение 5 мин.
  10. Тщательно удалите и отбросьте 150 зл супернатанта.
  11. Добавьте 200 л свежеприготовленного 80% этанола, не нарушая шарики и инкубировать в течение 30 с.
  12. Тщательно удалить, и отбросить все супернатант.
  13. Повторите шаги 5.11-5.12. Удалите оставшийся том с помощью пипетки P10. Разрешить бусины воздуха сухой в течение 15 минут, с индексом ПЦР трубки, оставшиеся на магнитной подставке.
  14. Снимите с магнитной стойки. Добавьте 33 зЛ буфера элуции (буфер элюции набора ДНК является приемлемым). Vortex хорошо, и выполнить быстрый спин, чтобы удалить все оставшиеся жидкости на стороне. Инкубировать в течение 2 мин и поставить на магнитную трибуну в течение 5 минут.
  15. Передача 30 злител супернатанта (чистых продуктов ПЦР) в предварительно маркированную микроцентрифугную трубку 1,5 мл.
  16. Количественно очищенный бассейн, загрузив 1 зл и 1 л очищенного бассейна на фторметр или чип электрофорез высокой чувствительности, так как это потребуется во время секвенирования. Выполните MiSeq, как описано ниже.

6. Секвенирование MiSeq

  1. Создайте образец листа, содержащего информацию о штрих-коде для метагеномики рабочего процесса и демультиксирования на инструменте MiSeq(см. Таблица материалов). Загрузите этот образец в программное обеспечение (например, Illumina Experiment Manager).
  2. Разбавить объединенные библиотеки от шага 5.15 до 4 нм.
  3. Денатурная объединила библиотеки, объединив 5 qL из 4 нМ библиотечного бассейна с 5 qL свежеприготовленных 0,2 М НаОХ в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки. Вихрь кратко смешать, центрифуга кратко и инкубировать в течение 5 минут на окружающем RT.
  4. Добавьте 990 л ледяного буфера гибридизации (HB буфер) и пипетку осторожно перемешать. Это даст 20 pM библиотеки.
  5. Объедините 2 qL из 10 nM библиотеки управления с 3 qL буфера EBT (10 mM Tris-HCl, рН 8.5, с 0.1% Tween 20) для того чтобы дать библиотеку управления 4 nM. Добавьте 5 л свежеприготовленных 0,2 N NaOH и вихрь кратко перемешать. Инкубировать в течение 5 мин на RT.
  6. Добавьте 990 йл ледяной буфер гибридизации (HB буфер) и пипетки осторожно, чтобы смешать. Это даст 20 библиотек управления pM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Денатурированные 20 pM библиотек управления могут храниться при -20 градусах Цельсия до 4 недель. Через 4 недели число кластеров, как правило, уменьшается.
    1. Объедините 210 л библиотеки 20 pM с 40 юл из 20 pM библиотеки управления (окончательная концентрация - 18%), и добавьте 350 qL буфера HB. Загрузите библиотеку в конечной концентрации 7 pM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Детали ввода должны быть скорректированы в процентах от производительности выполнения.
  7. Инкубировать образцы в течение 2 мин при 96 градусах Цельсия. Положить на лед в течение 5 мин. Загрузите 600 qL конечного бассейна в соответствующую скважину картриджов MiSeq.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раздел 6 выше может быть выполнен на геномном / ДНК основной объект.

7. Обработка данных и анализ последовательности

  1. Используйте программное обеспечение R (версия 3.5) для обработки и анализа данных DADA2. Для шагов 7.1-7.4, используйте программное обеспечение открытого доступа, как указано в ранее разработанном DADA2 онлайн учебник найти на lt;https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html.gt.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Легко пригодится R-скрипт в качестве дополнительного файла 2,и пользователи должны изменить имя и источник секвенирующих файлов (например, SAMPLENAME-R1'001.fastq и SAMPLENAME-R2'001.fastq).
  2. Визуализируйте качественные профили передних и обратных считываемых с помощью команды plotQualityProfile.
  3. Обрезка нуклеотидов с переднего и обратного считывает на основе качественного сюжета. Эти параметры определяются параметром truncLen в DADA2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь 280 используется в качестве порога длины, для которого считывается форвард, и 260 используется в качестве порога длины, для которого будет отбрасываться обратный считыванный.
  4. Обработка сырья 16S данных, как fastq файлов по трубопроводу DADA2, как указано в онлайн-учебник (найдено на lt;https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html такса с базой данных ссылки Сильва23.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица варианта последовательности ампликонов образца, генерируемая из конвейера DADA2, включена в качестве дополнительного файла 3. Можно использовать справочную базу данных Greengene или Silva, поскольку с использованием любой из этих баз данных не было обнаружено различий в бактериальной классификации.
  5. Создание пользовательского картографируемого файла, содержащего метаданные (например, генотип, пол, лечение и т.д.) для каждого образца. Пример файла метаданных был включен в качестве дополнительного файла 4.
  6. Рассчитайте альфа-разнообразие (индекс Шеннона) и бета-разнообразие с помощью анализа основных координат (PCA) на основе разреженных отсчетов OTU с использованием Phyloseq28, как указано в онлайн-учебнике, найденном на сайте zlt;https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html.gt.
  7. Выполните следующий анализ в METAGENassist29.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Выполните дифференциальный анализ изобилия, используя рейтинговый тест Уилкоксона на уровне рода. Тепловые карты и дифференциально обильные таксоны выделены с помощью METAGENassist29, общедоступный и веб-анализ трубопровода.
    1. Загрузите таблицу таксономического изобилия (формат CSV) и выберите Образцы в столбце.
    2. Загрузите файл отображения (формат CSV) и выберите Образцы в строке.
    3. Выберите Параметры для удаления переменных с более чем 50% нулей и исключения неназначенных и неотображеных считываемых.
    4. Выберите Параметры для нормализации строк по сумме и нормализует столбцы журнала.
    5. Сделать вулкан, PCA, или PLSDA участок, нажав то же самое в левой колонке и нажмите Удалить образцы имя, чтобы сделать график.
    6. Выполните t-тест(если только две группы) или ANOVA (если больше двух групп), чтобы визуализировать особенности (бактерии), которые отличаются между группами. Нажмите Избранные функции, чтобы визуализировать конкретные бактерии, которые отличаются между группами.
    7. Нажмите Dendrogram или тепловую карту для создания соответствующих участков. Дополнительный анализ, такой как визуализация образцов по группам или t-test/ANOVA-на основе 25 функций, может быть выполнен.
    8. Нажмите RandomForest, чтобы создать графики, показывающие функции, которые могут быть использованы для классификации. Нажмите на вкладку «Варианс» сверху, чтобы создать графики для верхних объектов, которые отличаются между группами. Нажмите Подробная информация о функциях, чтобы увидеть список бактерий, которые отличаются между группами и нажмите каждой бактерии, чтобы создать графическое резюме того же.
    9. Нажмите на вкладку Outlier сверху, чтобы визуализировать образцы, которые являются выбросами.
    10. Наконец, нажмите Скачать и выбрать либо 1) почтовый файл, содержащий все анализ выполняется или 2) желаемые функции для загрузки. Этот файл должен быть сохранен как уникальное имя и должен быть расстегнут перед использованием.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для подробных статистических тестов, проведенных во время анализа микробиома, обратитесь к работам Чэнь и др. и Hugerth et al.14,30.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как MHC класса II молекул (HLA у людей) являются центральными игроками в адаптивной иммунной реакции и показать сильные ассоциации с предрасположенностью к MS24,25,26, было предисегоценно, что HLA класса II молекулы II молекулы повлияет на состав кишечника микробов. Таким образом, мыши, не имеющие гена КЛАССА II MHC (AE.KO) или выражающие человеческий ген HLA-D-8 (HLA-D-8), были использованы, чтобы понять важность молекул класса...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный протокол прост, с простыми в последующей шаги для выполнения микробиома профилирования с использованием 16S rRNA метагеномных секвенирования из большого числа биоspecimenнезов, представляющих интерес. Секвенирование следующего поколения преобразовало исследования микробной экологии, особенно в моделях человеческих и доклинических заболеваний31,32. Основным преимуществом данной методики является ее способность успешно анализировать сложные микробные комп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

А. М. получил роялти от клиники Майо (оплачивается Evelo Biosciences) в качестве одного из изобретателей технологии, утверждая, что использование Prevotella histicola для лечения аутоиммунных заболеваний.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают финансирование из NIAID / NIH (1R01AI137075-01), Карвер Целевой Медицинской исследовательской инициативы Грант, и Университет Штата Айовы экологического здоровья научно-исследовательский центр, NIEHS / NIH (P30 ES005605).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл Натуральная микроцентрикуга ПробиркаСША, Научный1615-5500Сбор фекалий
3М ручной аппликатор Ракель PA1-G3M, MN, USСкребок для правильной герметизации ПЦР-планшета
Agencourt AMPure XPBeckman Coulter, IN, СШАA63880Очистка ПЦР, NGS Clean-up, очистка ПЦР
Agilent DNA 1000 REAGENTAgilent Technologies, CA, США5067-1504Количественная оценка ДНК и контроль качества
Биоанализатор DNA 1000 чипAgilent Technologies, CA, США5067-1504Количественный анализ ДНК и контроль качества
Индекс Adopter Replacement CapsIllumina, Inc., CA, США15026762 Новыйколпачок для праймера Index 1 и 2 Primer
DNeasy PowerLyzer PowerSoil KitMoBio теперь входит в состав QIAGEN, Валенсия, Калифорния, США12855-100DNA изоляция
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x)Kapa Biosystem, MA, СШАKK2602PCR готовая смесь для Amplicon PCR1 и индексированных PCR2
Lewis Divider BoxesLewis Bins, WI, USND03080Сбор фекалий
Магнитный стендNew England BioLabs, MA, СШАS1509SДля очистки ПЦР
MicroAmp Fast Optical 96-луночный реакционный планшетПрикладные биосистемы, Thermo Fisher Scientific, Калифорния, США4346906ПЦР-планшет
MicroAmp Оптическая адгезивная пленкаApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Калифорния, США4311971Запайщик ПЦР-планшетов
Microfuge 20 ЦентрифугаBeckman Coulter, IN, СШАB30154Центрифуга, используемая для выделения ДНК
MiSeq Reagent Kit (600 циклов)v.3Illumina, Inc., CA, СШАMS-102-3003Для секвенирования MiSeq
Набор для подготовки библиотеки ДНК Nextera XTIllumina, Inc., CA, СШАFC-131-100116S рРНК Резервуары для подготовки
реагентов Многоканальные лоткиASI, FL,СШАRS71-1Для объединения пластины продукта PCR2
ЦетрифугаThermo Fisher Scientific, CA, США75004393Для смешивания реагентов ПЦР и удаления пузырьков воздуха с планшета
PhiX ControlIllumina, Inc., CA, СШАFC-110-3001Для контроля секвенирования MiSeq
Набор для очистки микробиомаThermo Fisher Scientific, CA, СШАA29789Для очистки продукта PCR1
PowerLyzer 24 Гомогенизатор OmniInternational, GA, США19-001Бисер для кубита выделения ДНК
dsDNA HS (высокая чувствительность) набор для анализаThermo Fisher Scientific, CA, СШАQ32854Количественная оценка ДНК
TruSeq Index Plate FixtureIllumina, Inc., CA, СШАFC-130-1005Для организации индексных праймеров
Вертикальные разделители (большие)Lewis Bins, WI, USDV-2280Сбор кала
Вертикальные разделители (маленькие)Lewis Bins, WI, USDV-1780Сбор кала
7100038651

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
  2. Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
  3. Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
  4. Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
  5. Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
  6. Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
  7. Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
  8. Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer's disease. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
  9. Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
  10. Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
  11. Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695(2018).
  12. Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189(2017).
  13. Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
  14. Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484(2016).
  15. Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
  16. Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
  17. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, Suppl 1 4516-4522 (2011).
  18. Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449 (7164), 804-810 (2007).
  19. Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, Suppl 1 23-28 (2010).
  20. Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015(2016).
  21. Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429(2015).
  22. Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
  23. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  24. Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
  25. Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
  26. Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
  27. Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn's Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn's & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
  28. McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217(2013).
  29. Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
  30. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561(2017).
  31. Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617(2015).
  32. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
  33. Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
  34. Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649(2013).
  35. Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
  36. Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
  37. Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462(2019).
  38. Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
  39. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52(2017).
  40. Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
  41. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
  42. Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112(2014).
  43. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24(2016).
  44. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87(2014).
  45. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564(2014).
  46. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
  47. Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
  48. Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
  49. Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

16SDADA2PhyloseqMETAGENassistV3 V4

Похожие статьи