Методическая статья

Идентификация циркулярных РНК с использованием секвенирования РНК

DOI:

10.3791/59981

⸱

14 ноября 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Genomic Research Institute, 2Arizona Alzheimer's Consortium, 3Banner Sun Health Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Круговые РНК (циркрнки) являются некодирующие РНК, которые могут иметь роль в транскрипционной регуляции и посредничестве взаимодействий между белками. После оценки различных параметров для строительства библиотек секвенирования циркрнки был составлен протокол с использованием застрявшей общей подготовки библиотеки РНК с помощью предварительной обработки RNase R и представлен здесь.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Циркулярные РНК (circRNAs) представляют собой класс некодирующих РНК, участвующих в функциях, включая регулирование микроРНК (miRNA), посредничество белково-белковых взаимодействий и регуляцию скррижки генов родителей. В классическом следующем поколении секвенирования РНК (РНК-сек), циркрнки, как правило, упускается из виду в результате выбора поли-A во время строительства библиотек мРНК, или находятся в очень низком изобилии, и поэтому трудно изолировать и обнаружить. Здесь был оптимизирован протокол строительства библиотеки circRNA путем сравнения комплектов подготовки библиотек, вариантов предварительной обработки и различных общих объемов ввода РНК. Были протестированы два коммерчески доступных целых комплекта подготовки библиотеки транскриптома, с и без RNase R предварительной обработки, а также с использованием переменных количеств общего объема РНК-ввода (1 до 4 мкг). Наконец, несколько типов тканей; включая печень, легкие, лимфатические узлы и поджелудочную железу; а также несколько областей мозга; включая мозжечок, нижнюю теменной доли, среднюю височную извилину, затылочную кору и превосходную лобную извилину; были сравнена для оценки изобилия циркрнки по типам тканей. Анализ генерируемых данных РНК-сек с использованием шести различных инструментов обнаружения циркрнки (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC и CIRCexplorer) показал, что полный комплект подготовки библиотеки РНК с RNase R предварительной обработкой и 4 мкг РНК-ввода является оптимальным метод определения наивысшего относительного числа циркрн. В соответствии с предыдущими выводами, наибольшее обогащение циркрнков наблюдалось в тканях мозга по сравнению с другими типами тканей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Круговые РНК (CircRNAs) являются эндогенными, не кодирующих РНК, которые привлекли внимание, учитывая их широкое выражение в эукариотической транскриптоме1,2,3. Они образуются, когда экзоны обратно-сращивания друг к другу и, следовательно, первоначально считались сращивания артефактов4,5. Тем не менее, недавние исследования показали, что циркрнки экспонат авт., ткани, и стадии развития специфической экспрессии3,6 и эволюционно сохранены2,3. Кроме того, они участвуют в посредничестве белково-белковых взаимодействий7,микроРНК (miRNA) связывания3,8,9,10,и регуляции скрушины генов родительских11.

В классическом секвенировании РНК (РНК-сек) циркрнки могут быть полностью потеряны при строительстве библиотеки в результате выбора поли-А для мРНК или могут быть трудно изолировать, учитывая их низкое изобилие. Тем не менее, последние исследования характеристик циркрнки включили предварительный этап лечения с использованием RNase R для того, чтобы обогатить для цирка2,12,13. RNase R является экзорибонуклеазом, который переваривает линейные РНК, оставляя за собой круговые структуры РНК. Протоколы обогащения CircRNA были оптимизированы путем генерации и сравнения данных из двух коммерчески доступных целых комплектов транскриптомной библиотеки, с шагом предварительной обработки RNase R и без него, а также с использованием различных количеств общего объема ввода РНК (от 1 до 4 мкг). Оптимизированный протокол затем использовался для оценки обилия циркрнков в пяти различных областях мозга (мозжечок ,BC), нижняя теметельная доля «IP», средняя височная извилина «Mg», затылочная кора и превосходная лобная извилина »SF» и четыре других типа тканей (liver (ПА) , легочная « LU», лимфальное узели). Библиотеки RNA-seq были сопряжены с последовательностью конца и данные были проанализированы с помощью шести различных алгоритмов прогнозирования циркуляции: find_circ3,CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17, и CIRCexplorer18. На основе нашего анализа, наибольшее количество уникальных циркрнков было обнаружено при использовании мель общей РНК комплект подготовки библиотеки с RNase R предварительной обработки и 4 мкг общего ввода РНК. Оптимизированный протокол описан здесь. Как сообщалось ранее19,20, наибольшее обогащение циркрнков наблюдалось в головном мозге по сравнению с другими типами тканей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование проводилось в соответствии со всеми институциональными, национальными и международными руководящими принципами в области благосостояния человека. Мозг ткани были получены из Баннер Солнце Здравоохранения научно-исследовательский институт мозга и тела Пожертвование программы в Сан-Сити, штат Аризона. Деятельность программы донорства мозга и тела одобрена Западным советом по институциональному обзору (#20120821 протокола WIRB). Все субъекты или их законные представители подписали информированное согласие. Коммерческие (не мозговые) биоспеции были приобретены у Proteogenex.

1. RNase R Лечение

ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих шагах объем реакции корректируется на общую сумму 50 кЛ. Это минимальный объем выборки, который будет использоваться в комплекте очистки РНК и концентратора (см. Таблица материалов). Кроме того, оптимизированный протокол, описанный здесь, предназначен для входной суммы 4 мкг общей РНК. Более длительное время инкубации для лечения RNase R рекомендуется для вхоложного количества

  1. Разбавить общую РНК до 4 мкг в 39 ЛЛ RNase свободной воды в микроцентрифуговой трубки и хорошо перемешать путем пипеттинг.
  2. В отдельной трубке разбавьте RNase R до рабочей концентрации 2 U/Зл с 1x RNase R Реакционный буфер. Сделать только достаточно для немедленного использования.
  3. Пипетка 39 зл и 5 л 10x RNase R Реакция буфера в 1,5 мл реакционной трубки и хорошо перемешать путем пипеттинг (50 л будет общий объем реакции). Далее, добавьте 6 зл ИТ RNase R (2 U/L).
  4. Отрегулируйте пипетку до полного объема реакции (50 л) и хорошо перемешайте, в10 раз пополнив трубку вверх и вниз.
  5. Поместите трубку в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Убедитесь, что полный объем реакции погружается в водяную ванну.
  6. Поместите трубку на лед и немедленно приступаем к очистке РНК и концентрации (раздел 2).

2. Очистка РНК с помощью РНК очистки и концентратор комплект

ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании высококачественной РНК (RIN'gt;8, DV200'gt;80%), лечение RNase R может привести к потере примерно 60% РНК. Используя ввод 4 мкг, предполагается, что после раздела 1 остается 2-2,5 мкг обработанной РНК.

  1. Перед началом, подготовить РНК мыть буфер, добавив 48 мл 100% этанола в буферный концентрат и хорошо перемешать путем пипеттинг. Поместите колонны очистки в трубки для сбора (см. Таблицу Материалов)и поместите в стойку трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующие настройки центрифугации для всех следующих шагов: 10 000-16 000 х г. Если dNase I лечение уже было выполнено, пропустить DNase I лечение на данном этапе.
  2. Добавьте 2 тома РНК Связывающий буфер в образец RNase R и хорошо перемешайте путем пипеттинга (общий объем: 150 зл).
  3. Добавьте 1 том 100% этанола в РНК Связывающий буфер и RNase R обработанные образца смеси, и хорошо перемешать путем пипеттинг (общий объем: 300 кЛ).
  4. Перенесите весь объем в столбец и центрифугируйте столбец на 30 с. Отбросьте поток.
  5. Добавьте 400 qL РНК Prep Buffer непосредственно к столбце, центрифугируйте столбец на 30 с и отбросьте поток.
  6. Добавьте 700 л РНК-буфера на колонку, центрифугируйте столбец на 30 с и отбросьте поток.
  7. Добавьте 400 qL РНК вымойте буфер непосредственно к столбце, центрифугиколонка в течение 2 минут, и передать столбец на свежий RNase свободной 1,5 мл трубки.
  8. Добавьте 11 кЛ воды без RNase непосредственно к столбце, держа наконечник пипетки прямо над фильтром колонны и гарантируя, что вода приземляется только на фильтр колонны.
  9. Инкубировать колонну в течение 1 мин при комнатной температуре и центрифуги в течение 1 мин.
  10. Перед тем, как отбросить столбец, проверьте протекаете в трубке без RNase. Если элуция была успешной, храните образец при -80 градусах по Цельсию или немедленно приступайте к подготовке библиотеки. Окончательный общий объем элюции, насчитываемый примерно в 10 зл, используется для строительства библиотеки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пункт остановки: Оставьте РНК при -80 градусов на срок до 7 дней, прежде чем продолжить подготовку библиотеки.

3. CircRNA Библиотека Prep

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблица материалов для комплекта, который содержит большинство реагентов, используемых в этом разделе.

  1. РРНК истощение и фрагментация
    1. Перенесите 10 л очищенной РНК со ступени 2.10 в чистый колодец в новой 96-колодской пЦР пластине 0,3 мл. К скважине добавьте 5 зЛ связывающего буфера rRNA, за которым следует 5 кЛ рРНК Удаление Mix. Аккуратно пипетка вверх и вниз 10 раз, чтобы смешать.
    2. Печать пластины и инкубировать в течение 5 мин при 68 градусах По Цельсию на заранее запрограммированных, предварительно нагретый термоциклер блока. После завершения 5 мин инкубации, поместите тарелку на скамейку и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 мин.
    3. Снимите уплотнение с тарелки. Добавьте в образец 35 зл. вихревых комнатных шариков удаления rRNA. Отрегулируйте пипетку до 45 qL и пипетки вверх и вниз 10-20x, чтобы тщательно перемешать. Инкубировать тарелку в течение 1 мин при комнатной температуре.
    4. Перенесите пластину на магнитную подставку и инкубировать на подставке в течение 1 мин или до тех пор, пока раствор не расчистит. Перенесите все супернатанты (45 евро) в новый колодец на той же пластине или новую пластину (в зависимости от того, с каким количеством образцов вы работаете).
    5. Vortex РНК очистки шарики (см. Таблица материалов) до тех пор, пока хорошо рассеялись, и добавить 99 л бусин к каждому образцу. Пипетка вверх и вниз 10x, чтобы смешать. Инкубировать тарелку при комнатной температуре в течение 10 мин.
    6. Перенесите пластину на магнитную подставку и инкубировать еще 5 мин или до тех пор, пока раствор не расчистит. Удалите и сбросьте все супернатанты из колодца.
    7. С пластиной еще на магнитной подставке, добавить 200 л свежеприготовленных 80% EtOH к колодцу, не нарушая шарики. Инкубировать в течение 30 с, затем удалить и отказаться от этанола. Повторите в общей сложности 2 стирания.
    8. Добавьте 11 кЛ elution Buffer к каждой скважине и пипетке вверх и вниз 10 раз, чтобы смешать. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 мин, а затем перенести на магнитную подставку, пока раствор не прояснит (1-5 мин).
    9. Перенесите 8,5 л супернатанта из скважины в новый колодец на той же тарелке или на новую пластину. Добавьте 8,5 зл и l из Elute, Primer, Фрагмент Высокой смеси для каждого хорошо содержащие образец. Пипетка вверх и вниз 10 раз, чтобы тщательно перемешать.
    10. Печать пластины и инкубировать в течение 8 мин при 94 градусах По Цельсию на заранее запрограммированных, предварительно нагретый термоциклер блока. Снимите с термоциклора, когда он достигнет 4 градусов по Цельсию и центрифуги кратко.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно приступайке к протоколу Synthesize First Strand cDNA.
  2. Синтезировать cDNA
    1. Для каждого готовящемся образца смешайте 9 л первого синтеза стрядок с 1 зл и обратной транскриптазой (см. Таблица материалов). Добавьте в образец 8 кл.л. смеси. Пипетка вверх и вниз 6 раз, чтобы смешать.
      1. Печать пластины и инкубировать на заранее запрограммированных, предварительно нагретый термоциклер блок, используя следующие параметры: 25 КК в течение 10 мин, 42 КК в течение 15 мин, 70 C в течение 15 мин, 4 C удержания. Немедленно приступайке ко второму синтезу нитей.
    2. Добавьте 5 юл буфера resuspension к каждому образцу, за которым следует 20 злиц мастер-микса второй отметки маркировки. Pipette весь объем вверх и вниз 6 раз.
    3. Печать пластины и инкубировать на заранее запрограммированных, предварительно нагретый термоцикл блок установлен до 16 градусов по Цельсию в течение 1 ч. После инкубации снимите пластину с термоциклора и дайте ей уравновеситься до комнатной температуры.
    4. Vortex PCR очищения шарики (см. Таблица материалов) и добавить 90 бусинок l к каждому колодцу образца. Пипетка вверх и вниз 10 раз, чтобы тщательно перемешать. Инкубировать при комнатной температуре 10 мин.
    5. Перенесите смесь биса/образца на магнитную подставку и инкубировать в течение 5 мин или до тех пор, пока жидкость не очистится. Удалите и отбросьте супернатант.
    6. Добавьте 200 кЛ 80% EtOH к каждому образцу. Инкубировать образцы на магнитной подставке при комнатной температуре 30 с. Отбросьте супернатант. Повторите 1x.
    7. Дайте бисеру высохнуть при комнатной температуре в течение 6 мин, а затем снимите с магнитной стойки.
    8. Повторное увеличение шариков в буфере resuspension 19,5 л. Пипетка вверх и вниз 10 раз, чтобы тщательно перемешать. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 мин, затем переложить на магнитную стойку и инкубировать еще 1 мин или до тех пор, пока жидкость не очистит.
    9. Передача 17,5 л супернатанта на новую скважину/новую пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если не происходит немедленно, образцы могут храниться при -20 градусов по Цельсию в течение 7 дней.
  3. Подготовка библиотеки
    1. Добавьте 12,5 злителк A-Tailing Mix к каждому хорошо содержащему супернатант. Pipette весь объем вверх и вниз в 10 раз, чтобы смешать.
    2. Инкубировать реакцию на заранее запрограммированном, предварительно нагретом блоке термоциклора, установленном до 37 градусов по Цельсию, используя следующие параметры: 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин, 70 градусов по Цельсию в течение 5 мин, 4 градуса по Цельсию. Когда образцы достигают 4 градусов по Цельсию, немедленно приступайке к перевязке адаптера.
    3. К каждому образцу добавляйте 2,5 л буфера Resuspension, 2,5 л уникального адаптера РНК и 2,5 л ligation Mix. Пипетка вверх и вниз 10x, чтобы смешать.
    4. Инкубировать образцы на заранее запрограммированном, предварительно нагретом термоцикле блок при 30 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
    5. Добавьте 5 зЛ буфера стоп-лиги к каждому образцу и пипетку вверх и вниз, чтобы смешать.
    6. Добавьте 42 зЛ смешанных шариков очистки ПЦР к каждому образцу и тщательно перемешайте. Выполните шаги 3.2.6 до 3.2.10, но измените объем повторной подвески до 52 зл и окончательный объем elution до 50 зл.
    7. Повторите протокол очистки пЧР снова с 50 злификации от шага 3.3.6, но изменить объем повторного подвески до 22 Зл и окончательный объем elution до 20 Зл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если не происходит немедленно, образцы могут храниться при -20 градусов по Цельсию в течение 7 дней.
    8. Добавьте в каждый образец 5 зЛ пЦР Primer Cocktail и 25 Л ПЦР Master Mix. Смешайте путем pipetting вверх и вниз 10 раз. Инкубировать реакцию на запрограммированном, предварительно нагретом термоцикле блоке, используя следующие параметры: 98 градусов по Цельсию на 30 с; затем 8 циклов 98 градусов по Цельсию на 10 с, 60 градусов по Цельсию на 30 с и 72 градуса по Цельсию на 30 с; затем 72 кк в течение 5 мин, затем 4 градуса по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация общего числа циклов ПЦР может потребоваться для создания достаточного количества библиотекдля для секвенирования.
    9. Следуйте протоколу для очистки шариков пЧР (шаги 3,2,4 до 3,2,9), за исключением добавления 50 qL хорошо смешанных бусинок пЦР очистки и изменения объема повторного подвески до 32,5 л с окончательным объемом elution 30 зл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны храниться при -20 градусах Цельсия.
  4. Количественная оценка и контроль качества с помощью анализатора нуклеиновой кислоты
    1. Разрешить ленты и реагенты, чтобы уравновесить при комнатной температуре в течение 30 мин.
    2. Смешайте 2 злицы библиотеки с 2 йЛ буфера HS D1000 и добавьте к совместимой скважине.
    3. Печать плотно с совместимым уплотнением фольги, и вихрь в течение 1 мин при 2000 об/мин.
    4. Спин вниз и загрузить пластину на анализатор следующие программные подсказки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер библиотек должен быть примерно 260 б.п.

4. Рабочий процесс анализа данных

  1. Последовательность библиотек RNA-seq (см. Таблица материалов) для генерации 82 bp парного конца читает. Преобразуйте исходные данные последовательности в виде файлов basecall (.bcl) в FAST с помощью инструмента bcl2fastq (v0.2.19).
  2. Обнаружение циркрн.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на ранее сообщенных доказательств того, что подход обнаружения цирка ансамбля работает лучше по сравнению с использованием одного инструмента обнаружения21,22, мы предлагаем использовать несколько инструментов для обнаружения цирка. Здесь были определены циркрнки с использованием шести существующих алгоритмов прогнозирования циркрнки: find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE и DCC, применяя рекомендуемые параметры параметров для каждого алгоритма.
    1. Скачать и установить каждый алгоритм обнаружения circRNA на высокопроизводительный вычислительный кластер Linux с помощью инструкций, предоставленных разработчиками.
    2. Выровняй РНК-сек ФАСТ с эталонным геномом (GRCh37), используя выровняте, рекомендованный для каждого инструмента.
    3. После выравнивания выполняйте алгоритмы обнаружения циркрнки, применяя рекомендуемые параметры параметров.
    4. Каждый инструмент будет выделять файл результатов нескольких столбцов со списком обнаруженных циркрнков, извлекать координаты циркрнков и количество поддерживающих считываний из этого, чтобы количественно определить количество кандидатов, обнаруженных в каждом состоянии выборки/теста.
  3. Преобразуйте выводковые координаты circRNA CIRI, Mapsplice и DCC в 0-основанные координаты, чтобы соответствовать трем другим алгоритмам.
  4. Выберите циркрнки с двумя или более поддерживающими считываниями или ниже по течению анализы и сравнения. Таблица 1 обобщает все параметры, оцениваемые в нашем исследовании, а также общее количество считывательных считок, генерируемых для каждого образца.
  5. Для каждого состояния образца/теста подсчитайте количество обнаруженных циркрн, нормализованных к количеству отображенных считок, генерируемых для этой библиотеки, на миллион. Обобщить результаты по различным инструментам/образцам в участках коробок, как описано в результатах представитель.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сначала была проведена оценка данных, генерируемых с использованием коммерчески доступной универсальной РНК-системы управления (УК) и с использованием двух комплектов подготовки библиотек, оба из которых включают этап истощения рибо в своих протоколах. Используя аналитический рабочий процесс (рабочий процесс анализа данных, раздел 4), в целом в наборах данных TruSeq было обнаружено большее количество циркрн по сравнению с наборами Kapa(рисунок 1). Хотя рибосомные РНК (rRNA) проценты были ниж...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании были протестированы два коммерчески доступных комплекта для подготовки библиотек, варианты предварительной обработки и количество входной РНК для оптимизации протокола обогащения циркрнки для строительства библиотек секвенирования циркрнки. На основе оценок этого исследования очевиден ряд ключевых аспектов и важнейших шагов в создании библиотек секвенирования циркрн. Наша оценка подтверждает полезность RNase R предварительной обработки, о чем свидетельствует увеличение числа цирка, обнаруженных. В цел...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) из Сан-Сити, штат Аризона, за предоставление тканей мозга человека. BBDP была поддержана Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (U24 NS072026 Национальный мозг и ткани ресурс для болезни Паркинсона и связанных с ними расстройств), Национальный институт по проблемам старения (P30AG19610 Аризона болезнь Альцгеймера Основной центр), Аризона Департамент здравоохранения (контракт 211002, Аризона Альцгеймера исследовательский центр), Аризона биомедицинских исследований комиссии (контракты 4001, 0011, 05-901 и 1001 в Аризоне Паркинсона болезни консорциума) и Майкл J. Фокс Фонд исследований Паркинсона27. Это исследование было также поддержано DHS и штата Аризона (ADHS гранта ADHS14-052688). Мы также благодарим Андреа Шмитт (Banner Research) и Синтию Лечуга (TGen) за административную поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,000 & микро; L наконечники для пипетокRaininGP-L1000F
20 & L наконечники для пипетокRaininSR L 10F
200 & L наконечники для пипетокRaininSR L 200F
2200 TapeStation Аксессуары (крышки из фольги)Agilent Technologies5067-5154
2200 Аксессуары TapeStation (наконечники)Agilent Technologies5067-5153
Клейкая пленка для микропланшетовVWR60941-064
AMPure XP Beads 450 млBeckman CoulterA63882ПЦР-очистка
Eppendorf twin.tec 96-луночные ПЦР-планшетыVWR951020401
Высокочувствительные реагенты D1000Agilent Technologies5067-5585
Высокочувствительные D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584
HiSeq 2500 Система секвенированияIlluminaSY-401-2501
HiSeq 3000/4000 PE Cluster KitPE-410-1001
HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 циклов)IlluminaFC-410-1002
HiSeq 4000 Система секвенированияIlluminaSY-401-4001
HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2IlluminaPE-402-4002
HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 циклов)IlluminaFC-402-4022
Kapa Total RNA KitRocheKK8400
Центр снабжения этанолом класса молекулярной биологииFisher ScientificBP28184
Qubit Assay Tubesот Thermo FischerQ32856
Qubit dsDNA High Sense Assay Kitот Thermo FischerQ32854
Очистка и концентратор РНК - 5ZymoRCC-100Содержит очистительные колонки, пробирки
Бусины RNAClean XPBeckman Coulter GenomicsБусины для очистки РНК
Rnase RLucigenRNR07250
SuperScript II Обратная транскриптаза 10 000 единицThermoFisher (LifeTech)18064014
TapeStation 2200Анализатор нуклеиновых кислотAgilent Technologies
TElowEVWR10128-588
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep KitIllumina20020596Kit, используемый в разделе 3
Двухкамерный разделенный лотокVWR3054-1004
Центр снабжения ультрачистой водойот Thermo Fischer10977-015
Универсальный контроль РНКAgilent740000
для сбора

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733(2012).
  2. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  3. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  4. Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
  5. Nigro, J. M., et al. Scrambled exons. Cell. 64 (3), 607-613 (1991).
  6. Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777(2013).
  7. Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
  8. Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
  9. Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
  10. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
  11. Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
  12. Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
  13. Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919(2016).
  14. Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573(2015).
  15. Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178(2010).
  16. Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695(2015).
  17. Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
  18. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  19. Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
  20. Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
  21. Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58(2016).
  22. Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420(2017).
  23. Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
  24. Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
  25. Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
  26. Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2(2019).
  27. Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

RTruSeqKAPA

Похожие статьи