Murine цервикальной аорты трансплантации модель с использованием модифицированных non-Suture манжеты Техника

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол гетеротопной аортальной трансплантации у мышей с использованием техники не-шовной манжеты в модели шейки матки. Эта модель может быть использована для изучения основной патологии хронической аллотрансплантата васкулопатии (CAV) и может помочь оценить новые терапевтические агенты, с тем чтобы предотвратить его образование.

Аннотация

С введением мощных иммуносупрессивных протоколов возможны различные достижения в профилактике и терапии острых эпизодов отторжения. Однако за последние десятилетия можно было наблюдать лишь незначительное улучшение долгосрочных результатов трансплантации твердых органов. В этом контексте, хроническая аллотрансплантат васкулопатия (CAV) по-прежнему представляет собой ведущую причину поздней органной недостаточности в сердечной, почечной и легочной трансплантации.

До сих пор, основной патогенез развития CAV остается неясным, объясняя, почему эффективные стратегии лечения в настоящее время отсутствует и подчеркивая необходимость соответствующих экспериментальных моделей для того, чтобы изучить основные патофизиологии, ведущие к Формирование CAV. Следующий протокол описывает модель гетеротопической аорты шейки матки с использованием модифицированной техники, не присущей манжете. В этом методе, сегмент грудной аорты находится в неправильном общей сонной артерии. С помощью техники не-сутур манжеты, легко учиться и воспроизводимой модели может быть установлен, сводя к минимуму возможную неоднородность зашесущих сосудистых микро анастомозов.

Введение

За последние шесть десятилетий, сплошная трансплантация органов превратилась из экспериментальной процедуры в стандарт ухода за лечением конечной стадии органной недостаточности¹. В связи с улучшением противомикробных препаратов, хирургических методов и продвижения в иммуносупрессивных полков, ранний показатель успеха трансплантации твердых органов значительно возросли за последние десятилетия².

Тем не менее, долгосрочные показатели выживаемости трансплантата не значительно улучшились таким же образом³. Развитие CAV является основным фактором, ограничивающим долгосрочное выживание^4,5,6. Эта патология характеризуется образованием концентрического неоистимного слоя, состоящего из гладких мышечных клеток, что приводит к постепенному сужению сосуда и последовательному мальперфузии пересаженного твердого органа. У реципиентов пересадки сердца, CAV поражения могут быть диагностированы в до 75% пациентов 3 лет после трансплантации⁷.

Патофизиология CAV еще не до конца понятна. Это, кажется, связано с многочисленными иммунологическими и неиммунологическими факторами, приводящими к эндотелиальным повреждениям с последующей эндотелиальной активацией и дисфункцией^8. До сих пор не существует варианта причинно-следственной связи для профилактики CAV, подчеркивая необходимость воспроизводимой модели малых животных для изучения формирования и потенциальной терапии CAV.

С использованием моделей трансплантации аорты, CAV, как поражения можно увидеть 4 недели после трансплантации. Эти поражения состоят в основном из сосудистых гладких мышечных клеток, тем самым, напоминающих патологию человека. Из-за широкого спектра трансгенных и нокаут мышей, использование моделей мыши в трансплантации связанных патологий предлагает уникальную возможность определить новые терапевтические варианты и понять их развитие. Из-за малого диаметра пересаженных сосудов, однако, использование моделей мыши обычно ассоциируется с длинными кривыми обучения и первоначальный высокий уровень осложнений⁹. С введением не-шов манжеты техники, эта самая сложная часть операции может быть облегчена и диаметр анастомоза сохраняется постоянно^10,11.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Немецкого закона о защите животных (TierSchG.) (АЗ: 55.2-1-54-2532.Vet_02-80-2015).

1. Приют для животных

1. Для экспериментов используйте мышей C57BL/6 и BALB/c весом 20-25 г с мышами C57BL/6 в качестве животных-реципиентов и мышей BALB/c в качестве животных-доноров.
2. Покупка животных и дом в барьерных патогенных объектов, в соответствии с руководящими принципами FELASA для мониторинга здоровья¹².
3. Держите мышей в стандартных клетках Макролона с обогащением вложенного материала. Обеспечить доступ к воде и пеллетным продуктам питания в дневном/ночном цикле 12 ч.
4. Поддерживайте комнатную температуру на уровне 22 и 2 градусов по Цельсию, а относительная влажность - 55 и 5%.

2. Подготовка получателя

1. Во-первых, анестезировать животное-реципиент (C57BL/6) с интраперитонеальной инъекцией мидазолама (5 мг/кг; 5 мг/мл), медетомидина (0,5 мг/кг; 1 мг/мл) и фентанила (0,05 мг/кг; 0,05 мг/мл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная глубина анестезии должна быть достигнута в 5-10 мин.
   1. Pinch задние ноги с щипками, чтобы проверить на рефлексы, чтобы подтвердить глубину анестезии.
2. Закрепите все волосы боковой области шейки матки электрическим клипером для мелких животных и нанесите офтальмологическую мазь ватными тампонами, чтобы предотвратить высыхание глаз во время процедуры.
3. Поместите животное в положение на спине на грелку под микроскопом и аккуратно засуните его ноги к операционному столу с чувствительной полоской штукатурки.
4. Наклоните голову назад и скраб оперативного поля несколько раз с алкоголем.
5. Сделайте разрез кожи от яремного разреза к правой нижней нижней нижней челюсти с небольшими ножницами.
6. Удалите правую нижнюю часть подчелюстной железы через биполярную сетора педикюра и последующее иссечение с помощью микроскисоров.
7. Удалите правую стерноклеидомастоидную мышцу через биполярную каутерию верхней и нижней части и последующее иссечение с помощью микроскиссоров, чтобы получить доступ к общей сонной артерии.
8. Мобилизовать общую сонную артерию как можно дальше дистально и проксимально, потянув окружающие соединительной ткани друг от друга с тонкими щипками.
9. Свяжите две 7-0 шелковые лигатуры с минимальным расстоянием между каждой вокруг середины общей сонной артерии и трансектировать общую сонную артерию с тонкими микроскрицами между лигатурами.
10. Пройдите проксимальный, ligated конец через манжету и исправить его с небольшой зажим артерии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Манжеты, которые были использованы в этой процедуре были вырезаны с микросциссорами из труб полиимидов с внешним диаметром 0,610 мм и толщиной стены 0,0254 мм. Завершенные манжеты имели длину 2 мм с одной половиной, которая используется для манжеты процесса, будучи полный цилиндр, а другая половина, которая зажата, будучи полуцилиндром.
11. Удалите лигатуру с тонкой микросциссоров, как можно ближе к лигатуре, как это возможно, и промыть просвет с гепарина солий (50 МЕ / мл) с иглой 30 G, в то время как забота, чтобы не повредить стенки сосуда.
12. Растягивайте открытый просвет с помощью мелких сосудистых расширителей и всегда сонной пень над манжетой, потянув его мягко над полиимидной трубки.
13. Немедленно исправить вечно йонотид с слабо предварительно связали 7-0 шелковой петли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свободно предварительно связать 4 7-0 шелковые петли диаметром около 1,5 мм до операции, чтобы сделать манжеты процедуры гладкой и легче.
14. Выполните ту же процедуру (2.10-2.13) на другом конце сонной артерии.
15. Установите получателя животных в сторону и увлажнить оперативное поле с солевым раствором до тех пор, пока аорты сегмента explanted.

3. Операция донора

1. Анестезия донорской мыши (BALB/c) таким же образом, как животное-реципиент.
   1. Pinch задние ноги с щипцы, чтобы проверить на рефлексы, чтобы подтвердить достаточную анестезию.
2. Закрепите все волосы брюшной и грудной области электрическим клипером для мелких животных и нанесите офтальмологическую мазь ватными тампонами, чтобы предотвратить высыхание глаз во время процедуры.
3. Поместите животное в положение на спине на грелку под микроскопом и аккуратно засуните его ноги к операционному столу с чувствительной полоской штукатурки.
4. Несколько раз скраб оперативного поля с алкоголем.
5. Выполните полынь брюшной лапаротомии с небольшими ножницами и нажмите кишечник немного вверх, чтобы разоблачить нижней полы вены (IVC).
6. Введите нижнюю полину вены (IVC) с 1 мл гепаринизационного солира с помощью иглы 30 G.
7. Вырежьте брюшную аорту и IVC ниже почечных артерий с небольшими ножницами, чтобы exsanguinate донора животных. Свободно поместите компресс в брюшную полость, чтобы впитать кровь.
8. Выполните торакотомию при двусторонней диверсии ребер ножницами и наклоните переднюю грудную стенку краниально хирургическим зажимом, чтобы разоблачить средостение.
9. Вырезать IVC и пищевод непосредственно над диафрагмой с микросцисорами.
10. Удалите сердце и легкие, наклоняя их вверх с щипками проведения сократить IVC / пищевода, а затем excising их с микросциссорами из их базы, чтобы получить доступ к грудной аорты в сердечных mediastinum.
11. Мобилизуйте грудную аорту из окружающих тканей, потянув за собой окружающую соединительную ткань и жир тонкими щипками, стараясь не повредить межреберные артерии.
12. Каутеризируйте все ветви из грудной аорты с биполярными щипцы каутери и акциза аорты сегмента между диафрагмой и аортальной арки с помощью микроскисоров.
13. Промыть вырезанный аортированный сегмент с гепарина сольник с иглой 30 G, при этом заботясь, чтобы не повредить стенки сосуда, чтобы удалить оставшиеся крови или сгустки, и передать трансплантата для получателя животного.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Непосредственно поместите аортачный трансплантат в примерно нужном положении получателя во время передачи. Если Есть проблемы, запутанные различные концы трансплантата в получателя животных, свободные лигатуры вокруг дистального конца может помочь.

4. Имплантация

1. Потяните проксимальный конец донорского аортального сегмента над проксимальной манжетой поверх вечной сонной артерии с тонкими щипками и немедленно зафиксируйте ее слабо завязанной 7-0 шелковой петлей.
2. Обрезать дистальный, свободный конец аортального трансплантата с микросциссорами так, чтобы длина трансплантата соответствовала расстоянию между двумя манжетами.
3. Повторите шаг 4.1 на другом конце аорты с другой манжетой, чтобы завершить анастомоз.
4. Удалите дистальный зажим, чтобы ретроградная перфузия.
5. После достижения гемостаза, удалить проксимальный зажим для завершения анастомоз.
6. Наконец, закройте рану 6-0 непрерывным швом.

5. Послеоперационный уход

1. Мониторинг мыши тесно в первые 6 ч после операции, а затем несколько раз в день в течение первых 72 ч после трансплантации, чтобы обнаружить любые осложнения мгновенно.
2. Для послеоперационной обезболивании вводят пересаженную мышь с бупренорфином (0,05-0,1 мг/кг) непосредственно после трансплантации, а затем каждые 12 ч в течение 72 ч, чтобы обеспечить соответствующую долгосрочную обезболивание.

6. Объяснения аорты трансплантата

1. Анестезия пересаженного животного с интраперитонеальной инъекцией мидазолама (5 мг/кг; 5 мг/мл), мететомидина (0,5 мг/кг; 1 мг/мл) и фентанила (0,05 мг/кг; 0,05 мг/мл) 4 недели после трансплантации.
   1. Pinch задние ноги с щипцы, чтобы проверить на рефлексы, чтобы подтвердить достаточную анестезию.
2. Закрепите все волосы брюшной, грудной и шейной области электрическим клипера для мелких животных.
3. Поместите животное в положение на спине на грелку под микроскопом и аккуратно засуните его ноги к операционному столу с чувствительной полоской штукатурки.
4. Несколько раз скраб оперативного поля с алкоголем.
5. Выполните полынь брюшной лапаротомии с небольшими ножницами и нажмите кишечник немного вверх, чтобы разоблачить нижней полы вены (IVC).
6. Введите нижнюю полину вены (IVC) с 1 мл гепаринизационного солира с помощью иглы 30 G.
7. Вырежьте брюшную аорту и IVC ниже почечных артерий с небольшими ножницами, чтобы exsanguinate донора животных. Свободно поместите компресс в брюшную полость, чтобы впитать кровь.
8. Сделайте разрез кожи от яремного разреза к правой нижней нижней нижней челюсти с небольшими ножницами, соответствующими разрезу кожи, сделанному во время процедуры пересадки.
9. Определите пересаженный аортальный трансплантат вместе с дистальной и проксимальной манжетой и тупой удалить любые окружающие ткани с помощью щипц.
10. Используя микросциссоры, прорезать общую сонной артерии дистальной и проксимальной к аортальной трансплантата с манжетами, чтобы высадить аортальный трансплантат вместе с двумя концами манжеты.
11. Разрежьте аортатический сегмент пополам и сохраните образцы для дальнейшего анализа (замороженные секции, парафиновые встроенные секции, оснастки замороженный материал)^13,14.

Результаты

В полностью MHC-несоответствие трансплантации модели, концентрический неоинтимальный слой можно увидеть 4 недели после трансплантации (Рисунок 2). Этот слой состоит в основном из сосудистых гладких мышечных клеток, как иммуногистологическое окрашивание для SM22 (селективный маркер для зрелых сосудистых гладких мышечных клеток) выявлено. Как уже говорилось ранее, эти сосудистые гладкие мышечные клетки являются патогномонические для поражений видели в хронической аллотрансплантат васкулопатии....

Обсуждение

Хроническая аллотрансплантат васкулопатия является основной причиной поздней потери трансплантата после трансплантации твердых органов сердца и, вероятно, почек и легких аллотрансплантатов⁸. До сих пор не может быть разработан апогеонный терапевтический режим для предотвращения образования CAV.

Патофизиология CAV является многофакторной и включает в себя иммунологические и неиммунологические аспекты^16. Использование моделей грызунов в транспланта...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Balb-c Мыши (H2-d)	Charles River	Штамм# 028	Донорское животное
Биполярная система прижигания	ERBE	ICC 50 / 20195-023	Биполярное прижигание
C57BL/6J (H-2b)	Charles River	Штамм# 027	Животное-реципиент
Хэлси Иглодержатели	FST	12501-12	Иглодержатели
Холстед-Москит Щипцы	AESCULAP	BH111R	Изогнутый зажим
Медицинская полиимидная трубка	Nordson MEDICAL	141-0031	Материал манжеты
Micro Serrefines	FST	18055-04	Зажим для микрососудов
Микро-адсон Щипцы (зубчатые)	FST	11018-12	Стандартные щипцы
Микро-Зубчатый зажим Наложение щипцов	FST	18057-14	Clipapplicator
S& Т-образные щипцы - наконечники SuperGrip (под углом 45°)	S& T	00649-11	Тонкие щипцы
S& Щипцы для расширения Т-образных сосудов - угловые 10°; (Диаметр наконечника 0,2 мм)	S& T	00125-11	Сосудистый дилататор
Schott VisiLED Set	Schott	MC 1500 / S80-55	Световой
стереоскопический микроскоп	ZEISS	SteREO Discovery.V8	Микроскоп
студент Тонкие ножницы / Хирургические ножницы - Остро-тупой	FST	91460-11 / 14001-12	Стандартные ножницы
Vannas-Tü bingen Пружинные ножницы (изогнутые, 8,5 см)	FST	15004-08	Микросигсоры (изогнутые)
Vannas-Tü Пружинные ножницы bingen (прямые, 8,5 см)	FST	15003-08	Микросиссоры (прямые)