Методическая статья

Модуляция субклеточной локализации Тау как инструмент для исследования экспрессии генов, связанных с болезнями

DOI:

10.3791/59988

⸱

20 декабря 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biology, BIO@SNS, Scuola Normale Superiore

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тау является нейрональным белком, присутствующим как в цитоплазме, где он связывает микротрубочки, так и в ядре, где он оказывает нетрадиционные функции, включая модуляцию генов, связанных с болезнью Альцгеймера. Здесь мы описываем метод исследования функции ядерного Тау, исключая при этом любые помехи, исходящие от цитоплазмии Тау.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тау является микротрубочным связывающим белком, выраженным в нейронах, и его основная известная функция связана с поддержанием цитоскелетной стабильности. Тем не менее, последние данные показали, что Тау присутствует также в других субклеточных отсеках, включая ядро, где он вовлечен в защиту ДНК, в транскрипции RRNA, в мобильности ретротранспозонов и в структурной организации ядро. Недавно мы показали, что ядерный Тау участвует в экспрессии гена VGluT1, предлагая молекулярный механизм, который мог бы объяснить патологическое увеличение высвобождения глутамата на ранних стадиях болезни Альцгеймера. До недавнего времени участие ядерного Тау в модуляции экспрессии генов-мишеней было относительно неопределенным и неоднозначным из-за технических ограничений, которые препятствовали исключению вклада цитоплазмии Тау или эффекта других ниже по течению факторов, не связанных с ядерной Тау. Чтобы преодолеть эту неопределенность, мы разработали метод для изучения экспрессии генов-мишеней, специально модулируемых ядерным белком Тау. Мы использовали протокол, который соединяет использование сигналов локализации и субклеточной фракционирования, что позволяет исключить помехи из цитоплазмических молекул Тау. В частности, протокол прост и состоит из классических и надежных методов, которые в широком смысле применимы для изучения ядерной функции Тау в других типах клеток и клеточных условиях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Функции тау белка в ядре получили значительный интерес в последние годы, как было показано, тесно связаны с нуклеиновыми кислотами1,2,3,4,5,6. Действительно, недавнее исследование генома показало, что Тау связывает генные и межгенные последовательности ДНК in vivo7. Роль в нуклеолярной организации было предложено8,9,10,11. Кроме того, Тау было предложено принять участие в защите ДНК от окислительного и гипертермического стресса5,10,12,13, в то время как мутировавший Тау был связан с хромосомой нестабильности и анеуплоидии14,15,16.

До сих пор проблемы в изучении функций Тау в ядерном отсеке оставались практически нерешенными из-за трудностей в расчленении конкретного вклада ядерного Тау из вклада цитоплазмита Тау. Более того, функции, приписываемые молекулам Тау в ядерном отсеке, до сих пор лишь коррелируют, поскольку в них отсутствует недвусмысленная демонстрация прямого участия ядерных белков Тау. Действительно, участие Тау в мобильности ретротранспозонов или в транскрипции RRNA или в защите ДНК11,12,17,19,19 может быть также объяснено вкладциоплазмическим Тау или влияние других факторов вниз по течению, не связанных с ядерным Тау.

Здесь мы предоставляем метод, который может решить эту проблему, используя классическую процедуру для изоляции ядерного отсека в сочетании с использованием Tau конструкций 0N4R помечены ядерной локализации (NLS) или ядерных экспортных сигналов (NES). Такой подход устраняет сложные вопросы, связанные с возможными артефактами из-за распространения молекул Тау из цитоплазмического отсека. Кроме того, конструкции Тау-НЛС и Тау-НЕС вызывают обогащение или исключение молекул Тау из ядерного отсека, соответственно, обеспечивая положительный и отрицательный контроль за вовлечением ядерных молекул Тау в конкретную функцию. Протокол технически прост, и он состоит из классических и надежных методов, которые широко применимы для изучения ядерной функции Тау в других типах клеток, дифференцированных или нет, таких как раковые клетки, которые активируют Тау выражение20,21. Кроме того, он может быть применен и к другим белкам, которые присутствуют как в цитоплазме, так и в ядре для того, чтобы вскрыть биологические функции, связанные с различными отсеками.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культура клеток

  1. Культурные клетки SH-SY5Y (линия клеток нейробластомы человека, CRL-2266) в полной среде (модифицированная среда Eagle Dulbecco:питательная смесь F12 «DMEM/F-12» дополнена 10% сывороткой крупного рогатого скота плода ,FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 U/mL пенициллина и 100 мл streptomycin). Поддержание клеток в инкубаторе при состоянии 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. Выращивайте клетки в 10 см пластин и расщепляйте при слиянии.

2. Дифференциация клеток

  1. Чтобы дифференцировать клетки SH-SY5Y, на следующий день после покрытия, добавьте 10 мкм ретинойной кислоты (РА) для завершения среды в течение 5 дней.
  2. Шестой день заменяет среднюю дифференциацию: DMEM/F-12 дополнен 50 нг/мЛ BDNF, 2 мМ L-глютамин. Не добавляйте FBS или антибиотики.
  3. Выращивайте клетки в среде дифференциации в течение 3 дней.

3. Химерическая конструкции клонирования

  1. Создание Tau-NLS построить путем клонирования путем ограничения фермента пищеварения в кадре на 3 ' конец Тау последовательности 0N4R (383aa) 3xNLS (SV40NLS):5'-CCAAAAAAGaGAGAAAAГАЗА.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 3xNLS в 3'end Тау клонируется в pCMV-Tau плазмид для выражения млекопитающих, эксплуатирующих места ограничения XhoI и BamHI в многоклонный сайт (MCS).
  2. Создание Tau-NES построить путем клонирования путем ограничения фермента пищеварения в кадре на 3 ' конец Тау последовательности 0N4R (383aa) Nes последовательности: 5'-AGTGAGCTGCAGAACAAGCTGGAGAGTGGCTCTCGAGAGTGGCTCTCGAGAGTGGCTCTCGA-3'.
    ПРИМЕЧАНИЕ: РЭШ в 3'end Тау клонируется в pCMV-Tau плазмид для выражения млекопитающих эксплуатации EcoRI и BamHI места ограничения в MCS.
  3. Преобразуйте штамм DH5alpha E.coli с 100 нг ДНК со ступени 3.1 или 3.2 и клеток пластинна на пластинах LB-Agar с ампициллином 100 мг/мл. Пусть расти в одночасье при 37 градусах Цельсия.
  4. Выберите одну колонию и шип клетки в 5 мл LB с ампициллин. Пусть клетки растут при 37 градусов по Цельсию в возбуждении в одночасье.
  5. Извлеките плазмид с мини-препкой дна (Таблица материалов)и последовательность для проверки конструкций.
  6. Преобразование ШТАММа DH5alpha E. coli с последовательностью проверенных конструкций и пластинна клеток на пластинах LB-Agar с ампициллин. Пусть расти в одночасье при 37 градусах Цельсия.
  7. Выберите одну колонию и шип клетки в 5 мл LB с ампициллин. Пусть клетки растут при 37 градусах Цельсия в возбуждении в течение 2 ч.
  8. Положите клетки со ступени 3,7 в 200 мл LB с ампициллин. Пусть расти в одночасье при 37 градусах Цельсия.
  9. Пеллетите клетки при 3500 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
  10. Экстракт плазмиды с ДНК maxiprep (Таблица материалов).

4. Трансфекция клеток

  1. Семена 400000 клеток от шага 1.1 в 6-колодцпластины или 20000 клеток в 8-коловидной камерной горки. Плита четыре образца: контрольные клетки, которые будут трансфицироваться с пустым вектором, клетки, которые будут трансфицироваться с немаркированных Тау, клетки, которые будут трансфицироваться с Тау-NLS и клетки, которые будут трансфицироваться с Тау-NES.
  2. На следующий день после посева transfect 400 нг ДНК для каждого колодца с использованием катионных липидов (Таблица материалов) в 6-ну хорошо пластин или 200 нг ДНК для каждого колодца для 8-колодец камеры слайды, в соответствии с инструкциями производителя.
    1. Инкубировать ДНК и катионные липиды отдельно в 250 Л (для 6-ну колодцев) или 25 Л (для 8-колодцев камерных слайдов) пониженной среды сыворотки в течение 5 мин на РТ. Затем объединить их для создания ДНК-липидного комплекса и инкубировать в течение 20 минут.
    2. Замените культурную среду 2 мл (для 6-ну колодцев) или 250 л (для 8-колодцев камерных слайдов) свежей полноценной культуры среды. Добавьте в клетки комплекс ДНК-липидов и инкубируйте при 37 градусах Цельсия за одну ночь.
  3. Кроме того, трансфект ДНК с катионным реагентом полиэтиленина (PEI).
    1. Смешайте 2 мкг ДНК и 6 л PEI с 200 злителю полной культуры среды (для каждой скважины в 6-ну хорошо пластин), или 1 мкг ДНК и 3 мкг PEI с 100 зл и полной среде культуры (для каждого колодца в 8-колодцевых камерных слайдах) , вихрь и инкубировать в течение 10 минут на RT.
    2. Добавьте смесь к клеткам и добавьте 1,8 мл полной культуры среды на скважину в 6-ну скважинных пластинах или 150 л полной культуры среды на хорошо в 8-колодские камеры слайды для достижения покрытия объема.
  4. Измените среду на следующий день после трансфекции и добавьте медиадифференциации, описанные в шаге 2.2.

5. Иммунофлуоресценция

  1. Удалите культуры среднего и промыть клетки с 1x PBS. Исправить клетки со 100% холодным метанолом в течение 3 мин без тряски. Удалите решение крепления и кратко промыть 1x PBS.
  2. Пермяки с 0,1% неионического сурфактанта в 1x PBS в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Кратко, мыть с 1x PBS, 3 раза.
  3. Инкубировать клетки с блокирующим буфером (0,1% Tween 20 и 1% BSA в PBS) в течение 30 минут на RT на орбитальном шейкере.
  4. Инкубировать с соответствующими первичными антителами (например, мышь моноклонального анти-Tau13 антитела) разбавленной 1:500 в блокировании буфера ночь на 4 кв С на орбитальной шейкер. Удалите раствор антитела и промыть, кратко, с 1x PBS.
  5. Инкубировать вторичными антителами, спряженных с фторфором (например, антителами против мышей, спряженных с Alexa Fluor 633), разбавленным 1:500 в блокирующем буфере на 1 ч на RT. Удалите раствор антитела и кратко помойте 1x PBS 3 раза.
  6. Чтобы испачкать ядра, инкубировать с DAPI разбавленной 1:20,000 в блокирующем буфере в течение 10 минут на RT. Wash с 1x PBS 3 раза. Гора покрываетна на слайде с помощью антифадейсмонтажной среды.

6. Западная подись

  1. Чтобы собрать клеточные гранулы со ступени 4.4, удалите среду и вымойте клетки с помощью PBS. Инкубировать с 500 злитрового 0,1% трипсина в течение 4 мин при 37 градусах Цельсия. Добавьте равный объем полных средних и повторной работы ячеек.
  2. Собирайте клетки в трубке и центрифуге при 500 х г в течение 5 мин. В конце центрифугации тщательно удалите супернатант. Добавьте 1 мл PBS, центрифугу при 500 х г в течение 5 мин и осторожно удалите супернатант. Храните пеллеты для клеток на льду для немедленного использования или замораживание при -80 градусах по Цельсию для длительного хранения.
  3. Для общего экстракта белка, инкубировать клеточные гранулы в течение 30 минут на льду в буфере лизиса (20 мм Tris-HCl pH 8, 20 мМ NaCl, 10% глицерола, 1% octylphenoxy поли (этиленокси) этанол, разветвленный(Таблица материалов),10 мМ EDTA добавки с протфф. В зависимости от обилия гранул, используйте от 50 до 100 л буфера из лиза.
    1. Centrifuge экстракт на 16000 х г в течение 15 мин. Соберите супернатант и количественно концентрации белка по любому стандартному анализу количественной оценки. Подготовьте образцы белка для SDS-PAGE, смешивая 20 мкг белков с 5 qL 4x laemmli буфера в общей сумме 20 qL и кипятить при 100 кс в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец может храниться при -20 градусах Цельсия.
  4. Для субклеточных фракционирования, resuspend клетки от шага 6.2 в полной среде, и собрать 1 х 106 клеток на каждый образец. Центрифуга при 500 х г в течение 10 минут для получения клеточных гранул для следующих шагов.
    1. Чтобы изолировать субклеточные отсеки, фракционные в соответствии с комплектом спецификаций. Чтобы изолировать каждую фракцию, инкубировать клеточные гранулы со ступени 6.4 с соответствующим буфером, центрифугой, соберите супернатант и добавьте следующий буфер к грануле, как описано в 6.4.1.1-6.4.5. Добавьте в порядок цитоплазмический буфер экстракции, буфер извлечения мембраны, буфер ядерной добычи, буфер ядерной добычи, дополненный 5 мМ CaCl2 и 3 U/L микрококковой нуклеайзой и буфером цитоскелетной добычи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все буферы должны быть дополнены ингибиторами протеазы. Масштабируйте объемы буфера в зависимости от объема клеточной гранулы.
      1. Чтобы изолировать цитозолическую фракцию, инкубировать клеточные гранулы в 100 л ледяного цитоплазмического эксплуатанта, дополненного ингибиторами протеазы при 4 градусах Цельсия с нежным смешиванием в течение 10 мин. Центрифуга при 500 х г при 4 кв с в течение 5 мин и перенесите супернатант на предварительно охлажденные трубки.
      2. Добавьте 100 qL ледяного мембранного буфера экстракции, дополненного ингибиторами протеазы, к грануле со ступени 6.4.1.1 и инкубировать при 4 градусах Цельсия с нежным смешиванием в течение 10 мин. Центрифуга при 3000 х г при 4 кв. м. в течение 5 мин и соберите супернатан.
      3. Для растворимых ядерных фракций добавьте 50 qL ядерного буфера добычи, дополненного ингибиторами протеазы, к грануле со ступени 6.4.1.2 и вихрем. Инкубировать при 4 градусах по Цельсию в течение 30 мин, центрифуги при 5000 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 5 мин, и собирать супернатант.
      4. Для нерастворимых ядерных фракций добавьте 50 qL буфера ядерной добычи, дополненного ингибиторами протеазы, CaCl2 и микрококковой нуклеаза к грануле от шага 6.4.1.3, и вихря. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 5 мин, а затем вихрь снова. Центрифуга на 16000 х г на RT в течение 5 минут и собирать супернатант.
      5. Для цитоскелетной фракции добавьте 50 qL цитоскелетного буфера экстракции, дополненного ингибиторами протеазы, к гранулям от шага 6.4.1.4 и вихря. Инкубировать 10 мин на RT. Центрифуга трубки на 16000 х г в течение 5 минут, собирать супернатант и отказаться от гранул.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Масштабируйте объемы буфера в соответствии с объемом ячейки, как указано в протоколе набора. Для получения более подробной информации об инкубации и центрифугации и температуре22,23,24,25,26,27,28,29. Кроме того, используйте любые стандартные методы30, которые, используя моющие средства и увеличивая ионную прочность и скорость центрифугирования, отделяют цитосолико, мембранно-связанные, цитоскелеты и ядерные фракции. Разделите растворимую ядерную фракцию и нерастворимую ядерную фракцию, используя стандартные буферы ядерной добычи. Образец может храниться при -20 градусах Цельсия.
    2. Для SDS-PAGE добавьте 7 qL 4x буфера Laemmli к 20 qL субклеточных фракций, полученных из шагов 6.4.1.1-6.4.1.5, кипятить при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
  5. Загружайте образцы на акриламидный гель и выполняйте электрофорез при постоянном напряжении 120 В. Перенесите белки в мембрану нитроцеллюлозы при 250 мА за 90 мин.
  6. Проверьте надлежащий электрофорез протеинового геля и успешное промсвязьбуние путем инкубации мембраны в течение 5 минут в растворе окрашивающего понсо. Промыть мембрану в дистиллированной воде до тех пор, пока фон не будет чистым. Удалите пятно путем продолжения мытья с Tris буферных соления с Tween 20 (TBST) в течение 10 минут на шейкер.
  7. Инкубировать мембрану с блокирующим раствором (5% молока в TBST) на 1 ч при РТ на шейкере. Вымойте 3 раза с TBST в течение 5 мин.
  8. Гибридизировать мембрану с первичным антителом в блокирующем растворе (1% молока в TBST) на ночь при 4 градусах Цельсия. Вымойте 3 раза с TBST в течение 5 мин.
  9. Гибридизуйте мембрану с HRP-конъюгированным вторичным антителом в блокирующем растворе для 1 ч на RT. Вымойте 3 раза с TBST в течение 5 мин.
  10. Обнаружение белковой полосы с использованием хемилюминесценции. Количественная интенсивность западных полос Blot ImageJ. Нормализуйте экспрессию белка на продукт домашнего гена: гистон H2B для ядерно-растворимых и нерастворимых фракций, GAPDH для цитоплазмической фракции и для общего экстракта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стратегия, используемая для вскрытия воздействия ядерного Тау в экспрессии генов, избегая вклада цитоплазмических белков Тау, была изображена на рисунке 1. Кратко, белки Tau маркированные с NLS или NES аккумулируются в или исключены от ядерного отсека, соответственно. Функциональным эффектом этого дисбаланса является изменение экспрессии гена, измеренное как продукт гена VGluT1.

После описания прото...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем метод измерения влияния ядерного белка Тау на экспрессию генов. С этим протоколом вклад цитоплазмикТа Тау сильно ограничен. Критические шаги этого протокола следующие: дифференциация клеток SH-SY5Y человека, субклеточная фракционирование и локализация белка Тау в ядерном отсеке.

Во-первых, как показано в разделе репрезентативных результатов, дифференциация SH-SY5Y клеток путем добавления РА и BDNF имеет решающее значение для получения хорошей подготовки нейронных клеток в культуре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами от Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 633 козий анти-мышь IgGLife TechnologiesA21050IF 1:500
анти-актин антителоBETHYL LABORATORIEA300-485Aанти-кролик WB 1:10,000
анти-GAPDH антителоFitzgerald Industries International10R-G109aанти-мышь WB 1:10,000
анти-H2B антителоAbcamab1790анти-кролик WB 1:15,000
антитело к тау-13Santa Cruz Biotechnologysc-21796антимышиный WB 1:1,000; IF 1:500
анти тубулин альфаантитело Thermo Fisher ScientificPA5-16891антимышиный WB 1:5,000
анти VGluT1 антителоSigma-AldrichAMAb91041антимышиный WB 1:500
BCA набор для анализа белкаEurocloneEMPO14500
BDNFAlomone LabsB-250
блокатор блоттинг-классаBiorad1706404Обезжиренное сухое молоко
BOVIN SERUM ALBUMINSigma-AldrichA4503-50g
cOmplete MiniRocheингибитор 11836170001 протеазы
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 лунокBiorad5678093
DAPIThermo Fisher Scientific62247
DMEM/F-12GIBCO21331-020
Модифицированный орел Дульбекко's Medium Low GlucoseEurocloneECM0060L
EDTASigma-Aldrich0390-100mlpH = 8, 0,5 М
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаEurocloneEC50182L
глицериномSigma-AldrichG5516-500ml
Goat anti-mouse IgG-HPRSanta Cruz Biotechnologysc-2005WB 1:1,000
Козья анти-кроличья IgG-HPRSanta Cruz Biotechnologysc-2004WB 1:1,000
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50mlОктилфенокси поли(этиленокси)этанол
Иммобилон ВестернMERCKWBKLS0500
Lab-Tech Камерный предметный стек 8 лунок предметное стеклонунк177402
L-глутаминEurocloneECB3000D100X
Липофектамин 2000 реагент для трансфекцииThermo Fisher Scientific12566014катионный липид
МетанолSigma-Aldrich322415-6X1L
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100G
NaClSigma-AldrichS3014-1kg
Opti-MEM восстановленная сывороткасреда Gibco31985070
PEI Sigma-Aldrich40,872-7
Пенициллин/СтрептомицинThermo Fisher Scientific1514012210,000 Ед/мл, 100 мл
фосфатного буферного раствора (Дульбекко А)ОКСОИДBR0014G
ФосСтопРош4906837001ингибитор фосфатазы
QIAGEN Plasmid Maxi KitQiagen12163Шаг 3.10
Ретиноевая кислотаSigma-AldrichR2625-100mg
Набор для фракционирования субклеточного белка для культивируемых клетокThermo Fisher Scientific78840
Поддерживаемая нитроцеллюлозная мембранаBiorad1620097
TC-Plate 6wellSARSTEDT833,920
TCS SP2 лазерный сканирующий конфокальный микроскопLeicaN/A
Triton x-100Sigma-AldrichX100-500mlНеионогенное поверхностно-активное вещество
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific154000540,50%
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ml
VECTASHIELD среда для монтажа с защитой от выцветания VectorLaboratoriesH-1000
Wizard Plus SV Minipreps Системыочистки ДНКPromegaA1330Шаг 3.5

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
  2. Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
  3. Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
  4. Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
  5. Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
  6. Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  7. Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
  8. Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91(2017).
  9. Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
  10. Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
  11. Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
  12. Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
  13. Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
  14. Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
  15. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
  16. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
  17. Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
  18. Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
  19. Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70(2018).
  20. Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
  21. Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
  22. Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
  23. Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
  24. Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
  25. Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
  26. Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
  27. Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
  28. Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
  29. Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
  30. ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , Intechopen. (2012).
  31. Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
  32. Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells? Proceedings. 2 (25), 1577(2018).
  33. Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
  34. Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1(2013).
  35. Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Tau NLS Tau NESSH SY5Y

Похожие статьи