Method Article

Дискриминация и картирование первичных и обработанных стенограмм в митохондрии кукурузы с использованием круговой стратегии на основе РТ-ПЦР

DOI:

10.3791/60019

⸱

July 29th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем круговую стратегию на основе РТ-ПЦР путем объединения круговой РТ-ПЦР, количественного RT-PCR, полифосфатазы РНК 5 и Северной подья. Этот протокол включает в себя шаг нормализации, чтобы свести к минимуму влияние нестабильной 5' трифосфат, и он подходит для распознавания и отображения первичных и обработанных стенограмм стабильно накопленных в митохондрии кукурузы.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В митохондриях растений, некоторые устойчивые состояния стенограммы имеют 5' трифосфат, полученный из транскрипции инициации (первичные транскрипты), в то время как другие содержат 5' монофосфата, генерируемого посттранскриптионно (обработанные транскрипты). Для разлиения между этими двумя типами стенограмм было разработано несколько стратегий, и большинство из них зависит от наличия/отсутствия 5' трифосфата. Тем не менее, трифосфат на первичном 5 ' termini нестабилен, и это препятствует явной дискриминации двух типов стенограмм. Для систематического дифференцировать и картировать первичные и обработанные транскрипты, старично накопленные в митохондрии кукурузы, мы разработали круговую стратегию на основе RT-PCR (cRT-PCR) путем объединения cRT-PCR, лечения полифошпатазы RNA 5, количественной РТ-ПЦР (РТ-кПкР) и Северная поместье. В качестве улучшения, эта стратегия включает в себя шаг нормализации РНК, чтобы свести к минимуму влияние нестабильной 5' трифосфата.

В этом протоколе обогащенная митохондриальная РНК предварительно обрабатывается полифосфатами РНК 5, которая преобразует 5' трифофат в монофосфат. После круговой и обратной транскрипции, два cDNAs, полученных из 5' полифосфатазы и необработанных РНК нормализуются кукурузой 26S зрелой rRNA, которая имеет обработанный 5 ' конец и нечувствительна к 5' полифосфаза. После нормализации первичные и обработанные транскрипты дискриминируются путем сравнения продуктов cRT-PCR и RT-qPCR, полученных из обработанных и необработанных РНК. Транскрипт термини определяются путем клонирования и секвенирования продуктов CRT-PCR, а затем проверяются Северной подись.

С помощью этой стратегии, наиболее устойчивый состояние стенограммы в митохондрии кукурузы были определены. Из-за сложной схемы транскрипта некоторых митохондриальных генов, несколько транскриптов устойчивого состояния не были дифференцированы и/или отображены, хотя они были обнаружены в северной погредете. Мы не уверены, подходит ли эта стратегия для дискриминации и картирования стабильного состояния стенограммы в других митохондриях растений или в пластидов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В митохондриях растений, многие зрелые и предшественники РНК накапливаются как несколько изоформ, и устойчивый состояние стенограммы могут быть разделены на две группы на основе разницы в их 5 'концы1,2,3, 4. Первичные транскрипты имеют 5' трифосфатных концов, которые получены от инициации транскрипции. В отличие от этого, обработанные транскрипты имеют 5' монофосфат, генерируемый посттранскрипционной обработкой. Дискриминация и картирование двух типов транскриптов имеют важное значение для разгадки молекулярных механизмов, лежащих в основе....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Праймер Дизайн

  1. Дизайн генных праймеров для обратной транскрипции (RT) с использованием ПЦР праймер дизайн программного обеспечения (Таблица материалов) на основе общих правил грунтовки дизайн17.
    ПРИМЕЧАНИЕ: RT праймеры очень специфичны для целевых стенограмм, и они, как правило, закреплены на 5 ' часть последовательности кодирования (зрелые мРНК и прекурсор РНК), или 500-600 nt вниз по течению ожидаемого 5 ' конец (18S и 26S rRNAs).
  2. Дизайн пары расходящихся грунтовки для усиления циркулярных стенограмм по cRT-PCR.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Парные расходящихся грунтовки фланг 5'-3 'стыковка кругов....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка эффективности циркуляризации митохондриальной РНК

В предыдущем исследовании, как общий и митохондриальной РНК были использованы для cRT-PCR картирования митохондриальной транскрипт термини в Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), и два типа РНК дал аналогичные результаты картирования12. Первоначально мы также использовали общие РНК для cRT-PCR картирования митохондри.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В предыдущем исследовании, всего и митохондриальных РНК из клеточной культуры подвески Arabidopsis были использованы для картирования митохондриальной транскрипт термини cRT-PCR, и аналогичные результаты были получены12. Однако, только обогащенная митохондриальная РНК была использована длякартирования митохондриальных транскрипт термини во многих других исследованиях 1,2,3,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 31600250, Y.З.), Научно-технические проекты города Гуанчжоу (грант No 201804020015, H.N.), и Китайской системой сельскохозяйственных исследований (грант No). КАРС-04-PS09, H.N.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Уксусная кислотаАладдин, КитайA112880Для приготовления 1x TAE буфера
Applied Biosystems 2720 ТермоамплификаторThermo Fisher Scientific, США4359659Термоамплификатор для амплификации ПЦР
Аскорбиновая кислотаSigma-aldrich, СШАV900134Для приготовления экстракционного буфера
Biowest AgaroseBiowest, Испания9012-36-6Для разрешения ПЦР препараты и РНК
Бычий сывороточный альбуминSigma-aldrich, СШАA1933Для приготовления экстракционного буфера
Бромофенол синийSigma-aldrich, СШАB8026Для приготовления загрузочного буфера для электрофореза агарозного геля и Норн-блота
DEPCSigma-aldrich, США V900882Дезактивации РНКазы
DIG Северный стартовый наборRoche, США12039672910Для мечения DIG-RNA и Норн-блоттинга. Набор содержит реагенты для транскрипции-мечения РНК с DIG и Т7 РНК-полимеразой, гибридизации и хемилюминесцентного детектирования.
EDTASigma-aldrich, СШАV900106Для приготовления экстракционного буфера и 1x TAE буфера
EGTASigma-aldrich, СШАE3889Для приготовления промывочного буфера
Система документирования геляBio-Rad, СШАGel Doc XR+Для получения изображения агарозного геля
ГлицеринSigma-aldrich, СШАG5516Для приготовления загрузочного буфера для электрофореза агарозного геля
GoldView II (5,000x)Solarbio,. КитайG8142Окрашивание ДНК
Hybond-N+, Нейлоновая мембранаAmersham Biosciences, СШАRPN119Для Northern blot
Image LabBio-Rad, СШАImage Lab 3.0Image gel, и сравните обилие продуктов ПЦР.
KH2PO4Sigma-aldrich, СШАV900041Для приготовления экстракционного буфера
KOHAladdin, КитайP112284Для приготовления экстракционного буфера
L-цистеинSigma-aldrich, СШАV900399Для приготовления экстракционного буфера
MillexMillipore, СШАSLHP033RBДля стерильной экстракции и промывные буферы методом фильтрации
MiraclothCalbiochem, США475855-1RДля фильтрации измельченных ядровых тканей
MOPSSigma-aldrich, СШАV900306Для приготовления бегущего буфера для Северного блоттинга
NanoDropThermo Fisher Scientific, США2000CДля анализа концентрации и чистоты РНК
NaOHSigma-aldrich, СШАV900797Для приготовление промывочного буфера
pEASY-Blunt простое клонирование вектораTransGen Biotech, КитайCB111Клонирование гелеизвлеченной полосы. Он содержит промотор Т7 на несколько базисных пунктов от места введения.
Phanta max сверхточная ДНК-полимеразаVazyme, ChinaP505ДНК-полимераза для амплификации ПЦР
Polyvinylpyrrolidone 40Sigma-aldrich, СШАV900008Для приготовления экстракционного буфера
Primer Premier 6.24PREMIER Biosoft, СШАPrimer Premier 6.24Для разработки праймеров для обратной транскрипции и амплификации ПЦР
PrimeScript II обратная транскриптазаТакара,Япония 2690Для синтеза первой цепи кДНК
PureLink RNA Mini kitThermo Fisher Scientific, США12183025Для очистки РНК
5'-полифосфатазыEpicentre, СШАRP8092HДля преобразования 5'-трифосфата в ингибитор монофосфатной
РНКазыNew England Biolabs, UKM0314Компонент реакций самолигирования РНК и обработки 5'-полифосфатазой, используется для ингибирования активности РНКазы.
Ацетат натрияSigma-aldrich, СШАV900212Для приготовления буфера для Норн-блота
Sodium chlorideSigma-aldrich, СШАV900058Для приготовления 20x SSC
SsoFas evaGreen супермиксыBio-Rad, США1725202Для RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1New England Biolabs, UKM0437Для круговой обработки РНК
Tetrasodium пирофосфатSigma-aldrich, США221368Для приготовления экстракционного буфера
Набор для очистки миди TIANgel TiangenBiotech, КитайDP209Для очистки фрагментов ДНК из агарозного геля
TrisAladdin, КитайT110601Для приготовления 1x TAE буфера
TRIzol реагентInvitrogen, США15596026Для извлечения митохондиральной РНК.
Универсальный набор для очистки ДНКTiangen Biotech, КитайDP214Для восстановления линеаризованных пластмидов в результате реакции фермента рестрикции
Ксилолцианол FFSigma-aldrich, СШАX4126Для приготовления загрузочного буфера для электрофореза агарозного геля

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Circular RT PCRRNA 5 PolyphosphataseMitochondrial RNA ExtractionQuantitative RT PCRNorthern BlotMaize MitochondrionTermini MappingPrimary Processed TranscriptsRNA NormalizationDivergent Primers

Related Articles