Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Возмущение эндотелиальной биомеханики через Connexin 43 Структурные нарушения

5.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60034

⸱

4 октября 2019 г.

 , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of Central Florida, 2Burnett School of Biomedical Sciences, College of Medicine, University of Central Florida

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол на основе механики, чтобы нарушить разрыв соединения connexin 43 и измерить последующее воздействие это оказывает на эндотелиальной биомеханики через наблюдение тяги и межклеточных напряжений.

Аннотация

Эндотелиальные клетки были созданы для генерации межклеточных напряжений и тяг, но роль разрыв увязов играть в эндотелиального межклеточного стресса и тяги поколения в настоящее время неизвестно. Таким образом, мы представляем здесь механики на основе протокола для зондирования влияния разрыв соединения connexin 43 (Cx43) имеет на эндотелиальной биомеханики, подвергая слияния эндотелиальных монослоев известного ингибитора Cx43 2,5-dihydroxychalcone (халкон) и измерение влияния этого ингибитора на тяги и межклеточные стрессы. Мы представляем репрезентативные результаты, которые показывают снижение как тяги, так и межклеточных напряжений при высокой дозировке халкона (2 мкг/мл) по сравнению с контролем. Этот протокол может быть применен не только к Cx43, но и к другим развязкам, при условии использования соответствующего ингибитора. Мы считаем, что этот протокол будет полезен в области сердечно-сосудистых и механобиологических исследований.

Введение

Поле, которое относится к изучению влияния физических сил и механических свойств на клеточной и тканевой физиологии и патологии известен как механобиология1. Несколько полезных методов, которые были использованы в механобиологии являются монослой нойелии стресс микроскопии и тяговой силы микроскопии. Микроскопия силы тяги позволяет вычислять tractions произведенных на интерфейсе клетк-субстрата, пока микроскопия усилия монослой позволяет вычислить межклеточных напряжений произведенных между смежными клетками внутри monolayer2 ,3,4,5,6. Результаты, полученные из предыдущих методов, показали, что механические напряжения, полученные из клеток, играют решающую роль в определении судьбы множества клеточных процессов3,4,5. Например, при воздействии внешней механической силы, группа клеток, мигрирующих как коллектив, может изменить свою морфологию и поляризовать свою форму, чтобы выровнять и мигрировать по направлению прикладной силы, частично генерируя тяги7, 8. Tractions обеспечивают метрику, которая может быть использована для оценки сотрудничности клеток и рассчитывается с помощью микроскопии силы тяги (TFM). Микроскопия силы тяги (TFM) начинает с определением клеточных индуцированных деформаций субстрата последовано за вычислением поля тяги используя математически строгий, механик-основанный вычислительный подход. Так как способность вычислить тяги была вокруг в течение довольно продолжительного времени, исследователи использовали TFM, чтобы выявить влияние tractions на множество процессов, в том числе рак9, заживление ран10 и оценка инженерии сердечной ткань11.

Внедрение ТФМ и МСМ вместе можно разделить на три основных шага, которые должны быть выполнены в следующем порядке: во-первых, определяются гидрогелевые деформации, производимые клетками; во-вторых, тяги восстанавливаются после деформаций гидрогеля; и в-третьих, для вычисления нормальных и сдвига межклеточных напряжений в рамках всего монослойа используется подход конечного элемента. Для вычисления смещений геля изображения флуоресценции с клетками сравнивались с эталонным изображением биса (без клеток) с помощью специально написанной целуются велоциметрии изображения частиц (PIV). Размер кросс-корреляционного окна и перекрытие для анализа PIV были выбраны в 32 х 32 пикселя и 0,5, соответственно. В это время пиксельные сдвиги были преобразованы в микроны путем умножения с коэффициентом преобразования пикселя к микрон (для нашего микроскопа этот коэффициент преобразования составляет 0,65) для получения перемещений в плоскости. Ошибки, связанные с игнорированием внеплановых перемещений, незначительны12,13. После вычисления смещений геля, Есть два типа измерения тяги, которые могут быть использованы, ограниченные тяги и неограниченные тяги8,14. Неограниченные тяги обеспечивают поле тяги для всего поля зрения (включая области с ячейками и без), в то время как ограниченные тяги обеспечивают поле тяги только для областей, которые включают ячейки14. Затем межклеточные напряжения рассчитываются с помощью монослойной стрессовой микроскопии (МСМ), которая является продолжением микроскопии силы тяги. Внедрение МСМ основано на предположении, что локальные тяги, прилагаемые монослой ячеек на интерфейсе клеток-субстрата, должны быть сбалансированы механическими силами, передаваемыми между клетками на интерфейсе ячейки, как того требуют законы Ньютона7 ,12,13. Ключевым предположением здесь является то, что монослой клетки можно рассматривать как тонкий эластичный лист, потому что распределение тяги в монослой еронет и баланс силы не зависит от свойств клеточного материала. Еще одно ключевое предположение состоит в том, что силы тяги уравновешиваются локальными межклеточными нагрузками в оптическом поле зрения (в пределах монослой) и влияние этого силового баланса минимально в дистальной области (вне монослой)13. Таким образом, пограничные условия, определяемые межклеточными нагрузками, смещениями или комбинацией обоих на монослойной границе, имеют решающее значение для выполнения МСМ13. Принимая во внимание приведенную выше информацию, мы используем МСМ для выполнения конечного анализа элементов (FEM) для восстановления максимального основного стресса(максимума)и минимального основного стресса(min)путем вращения плоскости напряжения в каждой точке в монослой. Эти основные стрессы впоследствии используются для расчета 2D среднего нормального межклеточного стресса(макс ймин) /2» и 2D максимального сдвига межклеточного стресса(макс -мин) /2 » в пределах всего монослойного 12,13. Эта процедура описана более подробно Tambe et al.12,13

Монослойная микроскопия стресса (МСМ) позволяет рассчитать межклеточные напряжения клеток, образовавшиеся в пределах монослойной6,7,8,12,13. Эти межклеточные стрессы были предложены, чтобы иметь важное значение для роста тканей и ремонта, заживление ран, и метастазировать рак12,15,16,17. Кроме того, межклеточные стрессы были предложены также иметь важное значение в эндотелиальной миграции клеток и эндотелиальной функциибарьера 17,18. В то время как соединения клеток, такие как узкие соединения и адепты, как было предложено, чтобы играть важную роль в эндотелиальной межклеточной генерации стресса и передачи, роль разрыв соединений остается неуловимым. Разрыв ные соединения физически соединяют соседние клетки и обеспечивают путь для электрического тока и молекул (Злт;1 KDa), чтобы пройти между соседними клетками19,20,21. Хотя эндотелиальные клетки выражают Cx37, Cx40, и Cx43 разрыв узлов19,22, Cx43, возможно, наиболее важным с точки зрения прогрессирования заболевания23. Доказательства важности Cx43 можно найти в том, что генетическое удаление Cx43 у мышей приводит к гипотонии24 и оказывает неблагоприятное воздействие на ангиогенез25. Кроме того, Cx43 был задокументирован, чтобы быть важным для миграции клеток и распространения и в прогрессировании атеросклероза18,22,23,24,25 .

В этом протоколе мы использовали TFM и MSM для исследования того, будет ли тяга и межклеточное напряжение в рамках слияния, эндотелиальный монослой будет влиять на нарушение эндотелиального разрыва соединения Cx43. Мы нарушили Cx43 с 2,5-dihydroxychalcone (халкон), молекула документально ингибировать Cx43 выражение26. Chalcone был использован для того чтобы нарушить Cx43 вместо siRNA по мере того как chalcone было сообщено ранее Ли et al. для того чтобы нарушить выражение Cx4326. Кроме того, мы были особенно заинтересованы в влиянии халкона на эндотелий, как было также сообщается, противовоспалительное и противо-тромбоцитов соединения, которые потенциально могут быть использованы для профилактики и лечения различных сосудистых патологии26. Обработка chalcone была выполнена час после начала эксперимента, chalcone-обработанные monolayers были изображены на итог 6 часов, и обработка изображения была выполнена с custom-written кодом MATLAB для того чтобы обусловить tractions и затем межклеточные Напряжения. Наши результаты показали общее снижение тяги и межклеточных стрессов, предполагая, что Cx43 играет ключевую роль в эндотелиальной биомеханике.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Изготовление гелей полиакриламид (PA)

  1. Приготовление блюда Петри
    1. Приготовьте связываемый силановой раствор, смешивая 200 мл ультрачистой воды с 80 йл уксусной кислотой и 50 зл 3-(триметоксисил)пропил метакрилат. Bind silane - это решение, используемое для функционализации стеклянной нижней поверхности чашки Петри для крепления гидрогеля.
    2. Перемешать раствор связывания силан на перемешать пластины, по крайней мере 1 ч.
    3. Побалуйте центр хорошо чашку Петри с связывая силан раствор в течение 45 минут.
    4. Удалить связывательный силановый раствор и промыть чашку Петри ультра-чистой водой 2x-3x.
    5. Сухие поверхности чашки Петри и хранить при комнатной температуре для будущего использования.
  2. Приготовление раствора гидрогеля
    1. Смешайте ультра-чистую воду, 40% акриламида и 2% бис-акриламида в 15 мл центрифуги трубки в соответствии с таблицей 1.
    2. Добавьте в раствор гидрогеля 80 л/с флуоресцентных бусинок.
    3. Аккуратно встряхните трубку, чтобы смешать бисер с раствором геля.
    4. Слегка затяните крышку трубки на центрифуге трубки и поместите в вакуумную камеру.
    5. Дега гель раствор, по крайней мере 45 мин в вакуумной камере.
  3. Гидрогель полимеризация
    1. Во-первых, добавьте 75 зЛ 10% аммония persulfate (растворенный в ультра-чистой воде), а затем добавьте 8 зл TEMED (N, N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine) к раствору гидрогеля.
    2. Поместите 24 л раствора гидрогеля в центре чашки Петри (см. Таблицу 2).
    3. Используйте 18-мм крышку, чтобы сгладить гидрогель. Это даст высоту 100 мкм.
    4. Подождите, по крайней мере 30-40 минут для геля полимеризации.
    5. Погрузите полимеризованный гидрогель в ультра-чистую воду, чтобы предотвратить обезвоживание геля.
    6. Обложка чашку Петри с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотоотбеление флуоресцентных бусин и хранить при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрогель может храниться в течение до 3 месяцев, но предлагается, чтобы эти гели использовать не более чем через 1 неделю после изготовления для получения наилучших результатов.

2. Клеточная культура

  1. Культура человеческой пупочной вены эндотелиальных клеток (HUVECs) в клеточной культуре среды 200 (см. Таблица материалов) дополнены 1% пенициллина-стрептомицина на 0,1% желатина покрытием колбы при 37 КК и 5% CO2.

3. Подготовка трафарета микрошаблона

  1. Лечить тонкий слой полидиметилсилоксана (PDMS) в 100 мм Петри блюдо путем смешивания силиконовой базы с силиконовым лечащевым агентом в соотношении 20:1 (база: лечащий агент).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать другую базу для лечения коэффициентов агента (напротив 10:1 или 30:1). Тем не менее, более низкая база для лечения агента отношение даст более жесткую картину, в то время как более высокая база для лечения агента отношение будет производить более мягкую картину.
  2. Подготовьте 20:1 (базовый: лечебный агент) PDMS раствор и тщательно перемешайте в 50 мл центрифуги трубки. Перевернуть трубку вверх дном и энергично встряхнуть несколько раз, чтобы обеспечить надлежащее смешивание раствора PDMS, так как неравномерное смешивание приведет к неполной полимеризации.
  3. Удалите пузырьки, которые были введены из вышеуказанного шага центрифугировании раствора PDMS в течение 1 мин при 190 х г.
  4. Налейте 5-6 мл раствора PDMS в центре 100 мм чашки Петри и агитировать блюдо до решения PDMS охватывает всю поверхность блюда Петри.
  5. Лечить раствор PDMS на ночь при 50-60 градусах Цельсия. PDMS также можно вылечить при комнатной температуре.
  6. Удалите круговой трафарет PDMS диаметром 16 мм с помощью перфоратора отверстия.
  7. Используйте удар биопсии для создания небольших отверстий в трафарете PDMS. В этом протоколе используется биопсия диаметром 1,25 мм.
  8. Стерилизовать трафареты PDMS, сначала погрузив их в 70% этанола в течение 2-3 мин, успокоив избыток этанола, а затем поместив под ультрафиолетовый свет в течение 5 мин.

4. Гидрогелевое покрытие коллагена-I

  1. Снимите крышку с гидрогеля и усилите лишнюю жидкость.
  2. Поместите трафарет PDMS на поверхность гидрогеля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пинцеты могут быть использованы для применения легкого давления на трафарет PDMS для обеспечения водонепроницаемого уплотнения между трафаретом PDMS и поверхностью гидрогеля. Наши трафареты PDMS являются водонепроницаемыми и тем самым препятствуют доступу к воде между верхней поверхностью геля и поверхностью дна PDMS. Кроме того, жесткость гидрогеля не нужно корректировать в отношении жесткости PDMS.
  3. Обложка поверхности гидрогеля с sulfosuccinimidyl-6-(4-азидо-2-нитрофениламино) гексаноат (сульфо-SANPAH) растворяется в 0,1 M HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетанесульфоновой кислоты) буферный раствор в концентрации 1: 1000 место под УФ-место под 100 лампа (мощность 36 Вт) в течение 8 мин.
  4. Прикрепляйте избыток раствора сульфо-САНПАХ и HEPES и промойте гидрогель дважды с 0,1 M HEPES следуют дополнительные два полоскания с ультра-чистой водой.
  5. Аспирируем избыток ультра-чистой воды и шерсти гидрогелей с 0,1 мг/мл коллагена-I ночь на 4 градуса Цельсия.
  6. Обложка блюда и защитить флуоресцентные бусы от фотоотбелевания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: трафареты PDMS используются для создания монослойных микрошаблонов. Микроузорные монослои используются, поскольку они позволяют одновременно наблюдать несколько монослойов одной и той же геометрии и размеров в ходе каждого эксперимента. Однако, если микрошаблоны не желать вышеуказанных шагов могут следовать, за исключением шага 4.2.

5. Создание монослойных huVEC на гидрогелях

  1. Используйте 1x трипсин, чтобы отсоединить клетки от тканевых культовых колб в течение 3-5 мин в инкубаторе.
  2. После трипсинизации добавьте средства массовой информации клеточной культуры в раствор трипсина и добавьте в 15 мл центрифуги трубки.
  3. Центрифуги яточного раствора в течение 3 мин при 1710 х г. Небольшой белый гранулы клеток должны быть видны в нижней части центрифуги трубки.
  4. Аспирировать супернатант и resuspend клетки в средствах массовой информации до концентрации 50 х 104 клетки / мл.
  5. Удалить коллаген-I из гидрогеля и промыть 1x с PBS.
  6. Добавьте 75 х 103 ячеек в верхней части трафарета PDMS и позвольте клеткам прикрепляться к поверхности гидрогеля не менее 1 ч в инкубаторе при 37 градусах По Цельсия и 5% CO2.
  7. Удалить трафарет PDMS и добавить по крайней мере 2 мл средств массовой информации в чашку Петри. Погрузите трафарет PDMS в 10x трипсин, чтобы удалить любые прикрепленные клетки и стерилизовать путем распыления с 70% этанола, а затем размещение под ультрафиолетовым светом в течение 5 мин.
  8. Поместите чашку Петри в инкубатор и подождите не менее 36 ч или пока не будет наблюдаться сольственный монослой.

6. 2,5 дигидроксихалкона для лечения Cx43 нарушения

  1. Растворите 2,5 дигидроксихалкона (халкон) в диметилсульфокиде (ДМСО), чтобы сделать раствор запаса 0,1875 мг/мл.
  2. Разбавить стоковый раствор с помощью средств массовой информации клеточной культуры, чтобы сделать слабую концентрацию халкона (0,2 мкг/мл) аликот и высокую концентрацию халкона (2 мкг/мл) аликот.

7. Приобретение данных

  1. Найдите клеточные острова с микроскопом.
  2. Приобрести фазовую контрастность и изображения биса для морфологии клеток изображения и смещения гидрогеля, соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовалась 10-разная цель для получения данных.
  3. В конце эксперимента отсоединяют клетки с 10-x трипсином и приобретают изображение поверхности геля без клеток (ссылка на изображение).

8. Иммуностоинирование

  1. Зафиксировать монослой с 4% формальдегидом и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15 мин.
  2. Удалить 4% формальдегида и добавить 0,2% Тритон X-100 в течение 5 мин при 37 Градусов по Цельсию в пермяки клеток.
  3. Удалить 0,2% Triton X-100 и промыть монослой pbS 2x-3x.
  4. Обложка монослой с 2% бычьей сыворотки альбумина (BSA) раствор для 45 мин при 37 градусов по Цельсию.
  5. Удалите 2% раствор BSA и промыть монослой PBS 2x-3x.
  6. Добавьте первичные антитела Cx43 в концентрации 1:400 в образец и инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
  7. Удалите первичные антитела и промыть образец с PBS 2x-3x.
  8. Добавить вторичные антитела в концентрации 3:200 и инкубировать в течение 2 ч при 37 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть покрыты для предотвращения фотоотбеления.
  9. Удалить вторичные антитела и промыть PBS 2x-3x.
  10. Накрыть образец монтажной средой (Fluromount-G DAPI) и уплотнить 18-мм крышкой.

9. Внедрение микроскопии силы тяги (TFM) и монослойной микроскопии стресса (MSM)

  1. Расчет деформации гидрогеля
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведена пошаговая процедура расчета смещения с использованием MATLAB.
    1. Откройте основной файл traction.m в MATLAB (для всех процедур MATLAB см. Дополнительные материалы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям, приведенным в коде для установки каталога MATLAB.
    2. Определите следующие переменные: формат изображения, преобразование пикселя к микрон, модуля Янга, соотношение Пуассона и цель микроскопа.
    3. Найдите бисин, изображение трипсина и фазовое изображение с помощью подпрограммы OpenFiles.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для больших наборов данных лучше всего называть файлы в последовательном порядке. Например, файлы должны называться "filename1.tif", "filename2.tif" и т.д.
    4. Определите квадратную рентабельность инвестиций (регион интереса) вокруг монослойячейки и выполните подпрограмму cell-cropper для обрезки исходного изображения.
    5. Выполните подпрограмму смещения для вычисления перемещений.
    6. Выполните подпрограмму Dedrift, чтобы удалить любые дополнительные неклеточные перемещения, которые могут быть вызваны дрейфом стадии микроскопа.
  2. Вычисление тяги
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, неограниченные tractions рассчитываются с помощью нашей пользовательской процедуры MATLAB. Шаг за шагом тяги вычислений с использованием процедуры MATLAB ранее упоминалось приведено ниже.
    1. Определите следующие переменные в рамках процедуры traction.m: состояние границы, толщина геля, высота геля и сдрифтер.
    2. Выполните подпрограмму тяги и поиска для расчета тяги и выполнения подпрограммы plot'traction для сюжета. Все тяги в X-направлении (Tx) и y-направление (Ty) вместе с соответствующими местоположениями пикселей можно найти в файле traction.dat, который будет сгенерирован кодом.
  3. Вычисление межклеточных стрессов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг за шагом инструкции для межклеточного стресса вычислений с использованием процедуры MATLAB ранее упоминалось приведены ниже.
    1. Выполните подпрограмму mark'circular-domain для указания границы монослой. Эта процедура подскажет всем обрезанным изображениям фазы последовательно для пользователя вручную нарисовать границу вокруг монослой. Храните в виду nXPts, генерируемые в окне команды, и используйте их позже в качестве параметров сетки как в оси X, так и в оси Y для анализа FEM (см. шаг 9.3.2).
    2. Выполняйте Run-StressCode для расчета межклеточных стрессов. Эта подзаоражая непосредственно считывает параметры из файла "model.in" и выполняет "island.exe" для выполнения анализа FEM. Перед запуском этой рутины убедитесь, что все параметры в model.in файле, т.е. параметры сетки в X и Y, преобразование пикселя в микрон, модуль Янга геля, соотношение Пуассона, высота монослой и монослойный узор (полоса или отверстие) редактируются Правильно.
    3. Участок все результаты FEM с помощью подпрограммы plot-FEM'results.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все генерируемые результаты будут автоматически храниться в папке «Результаты» в каталоге MATLAB.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Фазовые контрастные изображения контроля, 0,2 мкг/мл и 2 мкг/мл халкона, обработанные монослойными, были сделаны за 30 минут до обработки чалконей(рисунок 1A-C)и через 2 часа после лечения чалконом(рисунок 1D-F). Клеточные индуцированные смещения биса (мкм) наблюдалось снижение как в низкой дозе халкона и высоких дозах халкон условиях(Рисунок 2E,F) п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наша группа, как и другие, успешно использует TFM и MSM для зондирования влияния клеточных соединений в различных патологических и физиологических клеточных процессах in vitro7,15,18,27 . Например, Hardin et al. представили очень проницательное исследование, которое предлагает межклеточной передачи стресса руководства параклеточного разрыва формирования в эндотелиальных клетках

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Университета Центральной Флориды стартовых фондов и Национального сердца, легких, и крови института Национального института здравоохранения в соответствии с наградой K25HL132098.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
18 мм покровный листThermoFisher18CIR-1Необходим для выравнивания полиакриламидных гелей
2% бис-акриламидBIO-RAD1610143Компонент полиакриламидного геля
2′,5′-ДигидроксихалконSIGMAIDF00046Для нарушения структуры Cx43
3-(Триметоксисилил)пропилметакрилатSIGMA2530-85-0Стоковый раствор для связывания силановой смеси с уксусной кислотой и ультрачистой водой
40% АкриламидBIO-RAD1610140Компонент полиакриламидного геля
Уксусная кислотаFisher-Sceintific64-19-7Необходим для связывания солевого раствора
Alexa Fluro 488 коз против мышей IgG;ThermoFisherCatalog # A-11001Вторичное антитело
Персульфат аммонияBIO-RAD1610700Полиакриламид гель полимеризующий агент
Бычья сыворотка Альбумин (BSA)SIGMA9048-46-8Для изготовления блокирующего раствора
Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 мг/мл, 100 млAdvance Biomatrix5005-100MLИспользование в качестве внеклеточного матрикса
Corning Cell Culture Фосфатный буферный физиологический раствор (1x)Fisher-Sceintific21040CVБуферный физиологический раствор, необходимый для клеточной культуры
Диметилсульфоксид, Fisher BioReagentsFisher-Sceintific67-68-5Для растворения халкона и получения исходного раствора
Fluoromount-G с DAPIThermoFisher00-4959-52Монтажная среда для иммуностейтинга, используемая для окрашивания для DAPI
Флуростная микросфера Карбоксилат-модифицированные бусиныThermoFisherF88120,5 мкм карбоксилат-модифицированные бусины (красные), 2% сухих веществ
Буферный раствор HEPES 1 MSIGMA7365-45-9Эссенциально для
LVESThermoFisherA1460801Essential HUEVC медиа 200
добавка Medium 200ThermoFisherM200500Незаменимые среды для клеточной культуры
HUVECМышиное моноклональное антитело Cx43 (CX - 1B1)ThermoFisherCatalog #13-8300Первичное антитело для
чашки Петри Cx43 (диаметр 35 мм)CellVisD35-20-1.5H35 мм чашка Петри с центральной лункой 20 мм
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 мгProteochem102568-43-4Необходимо для функционализации поверхности полиакриламидного геля
SYLGARD 184 Набор силиконовых эластомеровDOW corning2646340Силиконовый эластомер с отвердителем для получения PDMS
TEMEDBIO-RADПолиакриламидный гель полимеризатор
Triton-X 100SIGMA9002-93-1Для проникновения клеток
Trypsin-EDTAThermoFisher25300054Используется для разъединения клеток
1610801

Ссылки

  1. Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
  2. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  3. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  4. Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
  5. Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
  6. Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
  7. Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
  8. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
  9. Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
  10. Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
  11. Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706(2018).
  12. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  13. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172(2013).
  14. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
  15. Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
  16. Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
  17. Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
  18. Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327(2019).
  19. Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
  20. Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  21. Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
  22. Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
  23. Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
  24. Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
  25. Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).
  26. Lee, Y. N., et al. 2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
  27. Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
  28. Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Возмущение эндотелиальной биомеханики через Connexin 43 Структурные нарушения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.