Методическая статья

Целенаправленная блокировка антител двойным функциональным конъюгированным антигенным пептидом и миметикой FC-III (DCAF)

DOI:

10.3791/60063

⸱

17 сентября 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Structural Biology of Zhejiang Province, School of Life Sciences, Westlake University, 2Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, 3MOE Key Laboratory of Bioinformatics, Center for Synthetic and Systems Biology, School of Life Sciences, Tsinghua University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработка двойного функционального конъюгированного антигенного пептида и миметики FC-III (DCAF) является новым для устранения вредных антител. Здесь мы описываем подробный протокол для синтеза молекулы DCAF1, который может избирательно блокировать антитела 4G2 для устранения эффекта повышения антител, зависящих от них во время инфицирования вирусом Денге.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Устранение вредных антител из организмов является ценным подходом для вмешательства антител связанных заболеваний, таких как геморрагическая лихорадка денге и аутоиммунных заболеваний. Поскольку тысячи антител с различными эпитопами циркулируют в крови, ни один универсальный метод, за исключением двойного функционального конъюгирования антигенного пептида и миметики Fc-III (DCAF), не был направлен на конкретные вредные антитела. Развитие молекул DCAF вносит значительный вклад в прогресс целевой терапии, которые были продемонстрированы для устранения антител зависимых повышение (ADE) эффект в модели инфекции вируса Денге (ДЕНВ) и повысить ацетилхолин активности рецепторов в модели миастении gravis. Здесь мы описываем протокол для синтеза молекулы DCAF (DCAF1), который может избирательно блокировать антитела 4G2, чтобы замять эффект ADE во время инфекции вируса Денге, и проиллюстрировать связывание DCAF1 к 4G2 антитела анализа ELISA. В нашем методе DCAF1 синтезируется путем спряжения гидразина, производного пептида FC-III, и рекомбинантного, выраженного длинной селиксом с антигенной последовательностью через местную химическую перевязку (NCL). Этот протокол был успешно применен к DCAF1, а также другие молекулы DCAF для ориентации их cognate антител.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Антитела играют важную роль в гуморальном иммунном ответе для нейтрализации патогенных бактерий и вирусов1. Тем не менее, некоторые антитела проявляют вредное воздействие на организмы, такие как кросс-реактивные антитела в эффекте ADE во время инфекции DENV и сверхреактивные антитела в миастении gravis, которая является аутоиммунным заболеванием2,3. ADE эффект опосредован кросс-реактивных антител, которые делают мост для подключения DENV и Fc рецепторов представления клеток4,5, в то время как миастения gravis вызвано чрезмерными антителами, которые атакуют рецепторы ацетилхолина между клеточными клетками соединений в мышечной ткани6,7. Хотя частично эффективные подходы были разработаны для лечения этих заболеваний8,9, несомненно, прямое устранение этих вредных антител будет делать прогресс для вмешательства.

Недавно молекулы DCAF, которые имеют двойные функциональные группы, были разработаны для целевых блокирующих антител10. DCAF является длинный пептид, который состоит из 3 частей: 1) антигенная часть, которая может конкретно распознать коньяк антитела, 2) Fc-III или Fc-III-4C тег для сильно связывания с fc региона антитела ингибировать либо FC рецептора или дополнения компонентов белков , 3) длинный суликовый связующий, который спряжяэтику этих двух функциональных групп10. Связующее звено, разработанное из домена Moesin FERM, было оптимизировано программным обеспечением "Россетей" для обеспечения того, чтобы антигенная часть и часть FC-III в молекуле DCAF могли связываться с регионами Fab и FC IgG одновременно. Четыре молекулы DCAF были синтезированы для целевой 4 различных антител, среди них DCAF1 был использован для устранения 4G2 антитела, которое является кросс-реактивного антитела во время инфекции DENV внести свой вклад в эффект ADE; и DACF4 был разработан для спасения рецепторов ацетилхолина, блокируя антитела mab35 в миастении gravis10.

В настоящем исследовании, принятом DCAF1 в качестве примера, мы показали протоколы для синтеза молекулы DCAF и обнаружения взаимодействия между DCAF и его коньяк антитела. DCAF1 полусинтезируется NCL подход11,12,13,14, который спряжядает гидразина производной от пептида Fc-III и выраженный связующий-антиген частей вместе. Подход NCL имеет значительные преимущества перед полностью химическим синтезом и полностью рекомбинантным выражением синтеза DCAF1, поскольку оба этих метода приводят к низкой урожайности и высокой стоимости. Нынешний подход является не только наиболее экономически эффективным способом получить полнометражный DCAF, но и может поддерживать конформацию связующих частей, аналогичных его родной форме. Поскольку различные молекулы DCAF имеют аналогичные последовательности, за исключением антигенных частей, наши методы синтеза DCAF1 и взаимодействия между DCAF1 и 4G2 антитела могут быть применены к другим молекулам DCAF целевой блок их cognate антител, а также.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Химический синтез гидразина, производного пептида FC-III

  1. Преобразование 2-Cl-(Trt)-Cl сгоны до 2-Cl-(Trt)-NHNH2 сена
    1. Взвесить 625 мг 2-Cl-(Trt)-Cl смолы (0,25 ммоль) в 25 мл пептид синтеза сосуда.
    2. Добавьте 5 мл N,N-диметилформамид (DMF) в суслив с верхней части сосуда, положите крышку назад, аккуратно встряхните сосуд на 15 с, а затем слейте его. Повторите dMF мыть еще два раза.
    3. Добавьте 5 мл дихлорметана (DCM) в сосуд, положите крышку назад, аккуратно встряхните сосуд на 15 с, а затем слейте его. Повторите DCM мыть еще два раза.
    4. Повторите шаг 1.1.2 три раза.
    5. Используйте 6 мл 50% (vol/vol) DMF/DCM, чтобы набухать порезы на мине в течение 30 минут, а затем слейте ее.
    6. Передача 6 мл 5% (vol/vol) NH2NH2 в DMF в реакционный сосуд, встряхните смесь при 120 об/мин, 30 градусов по Цельсию в течение 30 минут, а затем слейте раствор вакуумным насосом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить 0,3 мл гидрата гидразина до 5,7 мл DMF, чтобы получить 5% (vol/vol) NH2NH2. Свежеприготовленный NH2NH2 перед использованием.
      ВНИМАНИЕ: Гидразин гидрат является опасным веществом и может вызвать рак. Носите лабораторное пальто, перчатки и маску. Выполните эксперименты в дымовой капюшон.
    7. Добавьте 5 мл DMF к сосуду, аккуратно встряхните его в течение 15 с, а затем слейте его.
    8. Повторите шаг 1.1.6, а затем промойте мизину, повторяя шаги 1.1.2-1.1.4 в течение двух раз.
    9. Добавьте 6 мл 5% (vol/vol) MeOH/DMF к сосуду, аккуратно встряхните его в течение 10 минут, а затем слейте его.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг очень важен для обеспечения неотреагированных сайтов на мели ограничены.
    10. Тщательно вымойте мизину, повторив шаги 1.1.2-1.1.4.
    11. Добавьте 5 мл DCM в сучку, осторожно встряхните ее в течение 15 с, а затем слейте ее, чтобы получить 2-Cl-(Trt)-NHNH2 смина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По сравнению с заменой, мизаня становится желтой или светло-зеленой.
  2. Пептидное удлинение
    1. Добавьте 1 ммоль fmoc-Ala-OH (934 мг) и 0,95 ммоль 1-бис (диметиламино)метилене-1H-1,2,3-триазоло-4,5-б pyridinium hexafluophosphate 3-y
      ВНИМАНИЕ: Воздействие HATU может вызвать аллергическую реакцию. Носите лабораторное пальто, перчатки и маску.
    2. Добавьте 2 ммоль N,N-diisopropylethylamine (DIEA) (0,36 мл) в растворенный раствор и вихрь в течение 0,5-1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Критический шаг: Активация должна занять не более 5 мин, так как активированные аминокислоты изысоризируются от более активных О-форм до менее активных N-форм с течением времени.
    3. Добавьте активированный Fmoc-Ala-OH в реакционный сосуд, содержащий 2-Cl-(Trt)-NHNH2 посуды, подготовленной со ступени 1.1. Аккуратно встряхните при 120 об/мин, 30 градусов по Цельсию в течение 20 минут в постояннотемпературном шейкере, а затем слейте раствор вакуумным насосом.
    4. Добавьте 5 мл DMF, чтобы вымыть мизину, аккуратно встряхните ее в течение 15 с, а затем слейте ее.
    5. Добавьте 1 ммоль Fmoc-Ala-OH (934 мг) и 0,95 ммоль 2-(6-хлоро-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3,3-тетраметиламиниум гексафтороффат (HCTU) (390 мг) в 5 мл трубки DF.
      ВНИМАНИЕ: Воздействие ВГТУ может вызвать аллергическую реакцию. Носите лабораторное пальто, перчатки и маску.
    6. Добавьте 2 ммоль DIEA (0,36 мл) в трубку и вихрь в течение 0,5-1 мин, чтобы растворить его.
    7. Добавьте активированный Fmoc-Ala-OH в реакционный сосуд. Аккуратно встряхните при 120 об/мин, 30 градусов по Цельсию в течение 40-60 минут в вшейке с постоянной температурой, а затем слейте раствор вакуумным насосом.
    8. Вымойте сетину, повторив шаги 1.1.2-1.1.4.
    9. Добавьте 4 мл 20% (vol/vol) пиперидин в DMF в мудрию, аккуратно встряхните его в течение 5 минут при комнатной температуре, а затем слейте раствор.
      ВНИМАНИЕ: Пиридин легко воспламеняется и токсичен. Выполните эксперименты в дымовой капюшон.
    10. Добавить еще 4 мл 20% (vol/vol) пиперидин в DMF в сиюре, аккуратно встряхните его в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем слейте раствор.
    11. Следуйте шагам 1.2.1-1.2.10 к паре и дезащита Fmoc-Ала-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-His-OH и Fmoc-Ala-OH. Повторите шаги 1.2.5-1.2.10 для пары и дезащита Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gly-OH и Fmoc-Asp-OH.
    12. Повторите шаги 1.1.2-1.1.4 для тщательного мытья мисинки.
    13. Повторите шаг 1.1.3 для мытья мизины, а затем вакуумно-сухой мисинки в течение 5 мин.
  3. Расщепление гидразина, полученного от грубого пептида Fc-III
    1. Добавьте 12 мл коктейлей трифтороацетической кислоты (TFA)/2,2"-(этиленедиокси)диетанэтиол (DODT)/триизопропилсилан (TIPS)/H2O (92.5/2.5/2.5/2.5) к смоле, а затем использовать вшейке с постоянной температурой, чтобы расщеплять пептид из мисинки при 200 об/мин, 37 кВ около 2 ч. Фильтр смеси в 50 мл центрифуги трубки.
    2. Добавьте 1 мл коктейлей в сиську, чтобы вымыть ее и собрать фильтрат в 50 мл центрифуги трубки. Повторите два раза.
    3. Сконцентрируйте смесь до 2 мл с помощью вейпера ротора в капоте дыма, а затем добавьте 20 мл предварительно охлажденных диэтилового эфира в трубку, чтобы осаждать сырые пептиды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Anhydrous эфир должен быть предварительно охлажден до 0 градусов по Цельсию, чтобы избежать насильственного выброса тепла, который может вызвать побочные реакции сырой пептид.
    4. Инкубировать пептидные осадки при -20 градусах по Цельсию на 1-2 ч.
    5. Центрифуга при 5000 х г,4 кв кв 10 мин и удалить растворитель из центрифуги трубки тщательно.
    6. Добавьте 20 мл предварительно охлажденных диэтилового эфира в трубку два раза в соответствии с шагами 1.3.3-1.3.5 для мытья осадков. Воздушно-сухой пептидный продукт в часовом стекле около 15 мин. Храните сушеные сырые пептиды при 4 градусах По Цельсию для дальнейшего анализа.
  4. Очистка гидразина, производного пептида FC-III
    1. Используйте высокопроизводительную систему жидкой хроматографии (HPLC) для очистки пептида на 30 мин градиента (0-1 мин, 5% B; 1-20 мин, 50% B; 20-25 мин, 85% B; 25-30 мин, 85% B) при скорости потока 1 мл/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонна имеет идентификатор 4,6 мм, длина 250 мм, упакованная с помощью сусла с c-18. Мобильная фаза А состояла из 0,1% TFA в воде, а мобильная фаза B состояла из 100% ацетонитрила и 0,1% TFA.

2. Выражение белка и очищение связующих и антигенных частей

  1. Пласмид строительство
    1. Синтезировать всю последовательность генов, которые могут выразить SUMO-linker-антиген (см. Таблица материалов).
    2. Вырезать 10 нг ПЭТ-28а пустой вектор и 50 нг синтезированных SUMO-linker-антиген фрагмент ДНК с помощью NcoI и XhoI в 37 кс водяной бане в течение 3 ч.
    3. Очистите двойной фермент переваренный вектор и фрагмент ДНК с помощью набора для экстракции геля ДНК.
    4. Добавьте 5 зЛ днк-усваивается фрагмент ДНК, 5 qL переваренных вектора, 1 зл Т4 ДНК лигазы, 2 Зл 10x буфера лигазе и 7 Л ddH2O в реакционную трубку, а затем инкубировать его на ночь при 16 градусах Цельсия.
    5. Смешайте 10 л лижации от шага 2.1.4 до 100 л компетентных клеток (DH5) и положите его на ледяную ванну в течение 30 мин. Положите компетентные клетки на водную ванну 42 градусов и быстро перенесите ее в ледяную ванну в течение 2 мин. LB жидкой среде (без антибиотиков) в трубку и встряхнуть его при 37 КС, 180 об/мин в течение 1 ч. Пальто компетентных клеток на пластину Kanamycin LB, чтобы сделать их равномерно распределены, и положить пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в одночасье.
    6. Выберите 5 одиночных колоний из плиты и культуры бактерий в 5 мл среды LB в пробирке с помощью 37 кс шейкер.
    7. Извлеките плазмиды из бактерий, собранных со ступени 2.1.6 с помощью комплекта плазмидной добычи.
    8. Отправить плазмиды для секвенирования генов и выбрать положительную колонию, которая может выразить SUMO-linker-антигенсинтез афсинтез ателье белка. Преобразуйте положительную плазмиду в BL21 (DE3)plysS компетентные клетки после шага 2.1.5.
  2. Очистка белка
    1. Выберите одну колонию трансформаторов со ступени 2.1.7 до 5 мл жидкой среды LB, содержащей канамицин (50 мкг/мл). Встряхните культуры на ночь при 200 об/мин, 37 градусов по Цельсию.
    2. Прививать 1 л прероразогретого носителя LB, содержащего канамицин (50 мкг/мл) в колбе с 5 мл ночных культур, и расти при 37 градусах Цельсия с энергичной тряской, пока OD600 не будет 0,6.
    3. Добавьте изопропил-Д-тиогалактозид (IPTG) в среднюю и окончательную концентрацию 0,4 мМ и встряхните колбу при 200 об/мин на ночь при 20 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Низкая температура для индукции белка важно, чтобы избежать включения тела формирования, поэтому убедитесь, что температура не более 22 градусов по Цельсию.
    4. После сбора клеток, добавить 50 мл буфера лисиса в клетки гранулы, чтобы повторно готировать клетки. Снотировать клеточные лисаты дважды в течение 5 мин при 200 Вт, УЗИ 3 с, интервал 3 с на льду. Центрифуге его на 15000 х г в течение 30 минут при 4 градусах по Цельсию, чтобы собрать супернациантов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: буфер лисиса состоит из 50 мм2PO4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол. Отрегулируйте значение pH до 8.0 с помощью NaOH.
    5. Добавьте 2 мл 50% Ni-NTA Sephorase, уравновешенные буфером лисиса, к очищенным супернатантам и аккуратно перемешайте, встряхивая (200 об/мин на роторном шейкере) при 4 КК на 1 ч.
    6. Загрузите смесь lysate и Ni-NTA в столбец с нижней розеткой, и снимите нижнюю крышку и отбросьте столбец.
    7. Вымойте три раза с 6 мл буфера мытья, а затем увядить целевой белок 3 раза с 1,5 мл буфера elution. Соберите унитеву в одной трубке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для мытья состоит из 50 мм2PO4, 300 мМ NaCl, 30 мМ имидазола. Отрегулируйте значение pH до 8.0 с помощью NaOH. Элуционный буфер состоит из 50 мм2PO4,300 мМ NaCl, 250 мМ имидазола. Отрегулируйте значение pH до 8.0 с помощью NaOH.
    8. Положите eluate в мешок диализа в 1 L 50 mM PBS при 4 c для того чтобы desalt белок. Замените новый фосфат буферный солен (PBS) в 3 раза.
  3. Расщепление тега SUMO
    1. Добавьте 2 мл мелкого убиквитин-подобного модификатора (СУМО) маркированного белка при концентрации 1 мг/мл, 1 мл SUMO Protease (см. Таблица материалов),1 мл 10-х сумо-буфер афериста и 6 мл ddH2O для подготовки реакционного решения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация белка суМО тегов составляет около 1 мг/мл. Чрезмерные концентрации после пищеварения фермента могут вызвать коагуляцию белка.
    2. Инкубировать смесь для 12-16 ч при 4 градусах Цельсия.
    3. Centrifuge смесь на 15000 х г в течение 10 минут при 4 градусах И отбросить агрегаты. Добавьте 0,5 мл 50% суспензии Ni-NTA, уравновешенной на 50 мМ PBS, к 10 мл очищенных супернатантов и аккуратно перемешайте, встряхнув (200 об/мин на роторной шейкере) при 4 кв. м в течение 60 мин.
    4. Загрузите смесь lysate и Ni-NTA в колонку с крышкой нижней розетки. Снимите нижнюю крышку, а затем сохранить поток через в 15 мл центрифуги трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хистегированный белок SUMO является обязательным на столбце. Ссылка-антиген часть, которая начинается с Cys для реакции NCL, находится в потоке до конца.
    5. Центрифуга поток через на 15000 х г в течение 10 минут при 4 кв и отбросить агрегаты. Очистите связующее-антигенную часть с помощью HPLC на 25 мин градиента (0-1 мин, 5% B; 1-3 мин, 15% B; 3-20 мин, 45% B; 20-21 мин, 85% B; 21-25 мин, 85% B) при скорости потока 1 мл/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонна имеет идентификатор 4,6 мм, длина 250 мм, упакованная с помощью сусла с c-18. Мобильная фаза А состояла из 0,1% TFA в воде, а мобильная фаза B состояла из 100% ацетонитрила и 0,1% TFA.
    6. Соберите очищенный продукт из HPLC, а затем заморозить сухой ночь, чтобы получить linker-антиген продукта.

3. Сборка DCAF1 по местной химической перевязке

  1. Конъюгирование fc-III пептида и связующего-антигена часть вместе
    1. Взвесить 1,8 мг гидразина производного пептида FC-III в 2 мл EP трубки и добавить 0,8 мл 6 М GnHCl в 0,2 М2PO4 (pH 3.0) решение, чтобы растворить его путем вихря.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 6 M GnHCl в 0,2 М2PO4 (pH 3.0) решение готовится путем корректировки значения рН с HCl или NaOH.
      ВНИМАНИЕ: NaOH и HCl очень коррозионны. Носите лабораторное пальто, перчатки и маску.
    2. После центрифугирования трубки при температуре 7200 х г в течение 1 мин при комнатной температуре поставьте трубку в ледосолевой ванне и используйте магнитное перемешивание, чтобы осторожно агитировать раствор в течение 15 мин.
    3. Добавьте 40 qL 0.5 M NaNO2 к раствору для того чтобы окисить группу гидразина. Аккуратно агитировать раствор еще 15 мин в ледяной соляной ванне.
    4. Взвесить и добавить 11 мг очищенной связующее-антигенная часть, приготовленное со ступени 2.3 и 13.6 мг 4-меркаптопенилетической кислоты (MPAA) в реакционную трубку в ледяной соляной ванне, перемешайте в течение 5 мин, а затем отрегулируйте значение рН до 6,8-7,0 при комнатной температуре с 6 МГП.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Регулировка значения рН на нейтральное является критическим шагом для инициирования реакции перевязки.
    5. После 12 ч добавьте 0,4 мл 0,1 М три (2-карбоксетил) нейтральный раствор фосфина гидрохлорид (TCEP) (pH 7.0) в систему реакции и перемешайте в течение 20 минут, чтобы прекратить реакцию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 0.1 M TCEP нейтральное решение (pH 7.0) подготовлено путем растворения TCEP в 6 M GnHCl в 0.2 M2PO4 (pH 3.0) решение, и использование NaOH для регулировки значения pH до 7.0.
    6. Centrifuge трубки на 15000 х г в течение 10 мин, затем анализировать и очищать перевязочный продукт с HPLC на 26 мин градиента элюционист (0-1 мин, 5% B; 1-21 мин, 45% B; 21-22 мин, 85% B; 22-26 мин, 85% B) скорость 1 m. Ожидаемая доходность реакции перевязки составляет более 50%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонна имеет идентификатор 4,6 мм, длина 250 мм, упакованная с помощью сусла с c-18. Мобильная фаза А состояла из 0,1% TFA в воде, а мобильная фаза B состояла из 100% ацетонитрила и 0,1% TFA.
  2. Десульфуризация конъюгированного
    1. Растворите конъюгированный (3,4 мг, 0,3 мкмоль), приготовленный со ступени 3,1,6 в 50 л 6 М ГнХЛ в 0,2 М2PO4 (pH 7.0) раствор.
    2. Добавьте к вышеуказанной смеси 50 qL из 1 M TCEP, 10 л tBuSH и 5 л 0,1 М ВА-044.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 0,1 М WA-044 раствор готовится путем растворения 9,7 мг порошка VA-044 в 0,3 мл 6 М GnHCl в 0,2 М2PO4 (pH 7.0) раствор. Раствор VA-044 следует готовить заново перед использованием, так как VA-044 легко окисляется при воздействии воздуха.
    3. Отрегулируйте окончательный рН раствора до 6,9 и держите solutiomat 37 градусов по Цельсию с перемешиванием около 5 ч.
    4. Центрифуги трубки на 15000 х г в течение 10 мин и удалить нерастворимые вещества. Проанализируйте и очистите ликционный продукт с помощью HPLC на 26 мин градиента (0-1 мин, 20% В; 1-21 мин, 45% В; 21-22 мин, 85% В; 22-26 мин, 85% В) при скорости потока 1 мл/мин. Ожидаемая доходность реакции на десульфуризацию составляет около 40%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонна имеет идентификатор 4,6 мм, длина 250 мм, упакованная с помощью сусла с c-18. Мобильная фаза А состояла из 0,1% TFA в воде, а мобильная фаза B состояла из 100% ацетонитрила и 0,1% TFA.
  3. Удаление Acm, чтобы получить конечный продукт DCAF1
    1. Растворите пептид (1,35 мг, 0,11 мкм), приготовленный со ступени 3,2,4 в 200 мЛ 32 мМ AgOAc, а затем перемешайте реакционную смесь при комнатной температуре в течение 4 ч.
    2. Добавьте 3 зЛ 1М дитиотрия (DTT) в 6 M GnHCl в 0,2 М2PO4 (pH 7.0) раствор для преобразования тиолатов серебра на пептид бесплатно тиол.
    3. После сильнопомешвания в течение 1 мин, центрифуга трубки на 15000 х г в течение 10 минут, чтобы отказаться от нерастворимых веществ. Проанализируйте и очистите конечный продукт с помощью HPLC на 26 мин градиента (0-1 мин, 20% В; 1-21 мин, 45% B; 21-22 мин, 85% B; 22-26 мин, 85% B) при скорости потока 1 мл/мин. Ожидаемая доходность для Acm дезащиты реакции составляет около 30%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонна имеет идентификатор 4,6 мм, длина 250 мм, упакованная с помощью сусла с c-18. Мобильная фаза А состояла из 0,1% TFA в воде, а мобильная фаза B состояла из 100% ацетонитрила и 0,1% TFA.
    4. После очистки HPLC, заморозить сухой конечный продукт на ночь, и растворить порошок в PBS (50 мм2PO4, 150 мм NaCl, рН 8.0). Centrifuge трубки на 15000 х г в течение 10 минут при 4 кв и отбросить гранулы.
    5. Отрегулируйте концентрации конечного продукта (от шага 3,4) и связующей антигенной части (от шага 2,3,6) до 10 мкм, запишите круговой дихроизм (CD) спектра от 260 до 195 нм этих двух продуктов с помощью cd-спектрометра при 25-м мм длине пути.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CD-спектры используются для демонстрации количества сугнительственной структуры в конечном продукте так же, как и в рекомбинантном выраженном.

4. Обнаружение продуктов масс-спектрометрией

  1. Отделить продукт от каждой химической реакции на 60 мин градиента elution (0-8 мин, 2% B; 8-10 мин, 5% B; 10-35 мин, 30% B; 35-50 мин, 50% B; 50-52 мин, 80% B; 52-58 мин, 80% B; 58-59 мин, 2% B; 59-60 мин, 2% B) при скорости потока 0.30 00 м/м000 000м/00 м/00 м/00 м/00 м/000 м/00м/00 00 м/00м/000 м/000 м/000м/000 м/000 м/00 м/00 м/000 м/000 м/000м00000м0000000м00000000м0000м000м00м00м00м00м00м00м0000000м000м00м000м00м00м00м00м00м00м00м00м/000м000м/м000000000000м000м/0000 м/000 система nano-HPLC, которая непосредственно взаимосвязана с масс-спектротером высокого разрешения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аналитическая колонка находится в 75 мкм ID, 150 мм длиной, упакованы с C-18 мизины. Мобильная фаза А состояла из 0,1% для модной кислоты в воде, а мобильная фаза B состояла из 100% ацетонитрила и 0,1% для модной кислоты.
  2. Управляйте масс-спектрометром в режиме полного сканирования и установите диапазон м/з на уровне 300-2000, а разрешение - 60 000.
  3. Откройте данные масс-спектра и найти пики продукта на каждом этапе, чтобы подтвердить химическую реакцию успешно предварительно.

5. ELISA анализа взаимодействия между DCAF1 и 4G2 антитела

  1. Пальто 96-хорошо микротитер пластины с 1 пмоль анти-GST антитела (см. Таблица материалов) в 100 злитель покрытия буфера / хорошо, печать пластины и инкубировать его при 4 кв С ночь на шейкер.
  2. Блок каждый колодец с 200 л 1% BSA в PBS, печать пластины и инкубировать его при комнатной температуре в течение 1 ч на шейкер.
  3. Вымойте каждый хорошо 4 раза с помощью PBS с 0,05% Tween 20.
  4. Добавьте в колодцы сплавленный GST антигенный белок (0,05 пм. в 100 л блокирующего раствора), запечатайте тарелку и насигите 2 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: GST-слитый антигенный белок выражается в бактериях и очищается GSH Sepharose.
  5. Повторите шаг 5.3 для мытья тарелки.
  6. Добавьте 1 антитело 4G2 или 1 антитело pmol 4G2 плюс другие лиганды: антиген, FC-III или DCAF1 в серийных количествах (0,1 пмоль, 1 пмоль, 10 пмоль, 100 пмоль и 1000 пм. моль) в 100 л блокирующего раствора/хорошо, запечатайте пластину и инкубаните 2 ч при комнатной температуре на акваке.
  7. Повторите шаг 5.3 для мытья тарелки.
  8. Добавьте Анти-мышь IgG, связанное с HRP антитела (1:20,000 разбавления) в 100 л блокирующего раствора/хорошо, запечатайте пластину и инкубировать 30 мин при комнатной температуре на шейкере.
  9. Вымойте каждый хорошо 6 раз с помощью PBS с 0,05% Tween 20.
  10. Смешайте TMB реагент A и B 1:1 в объеме непосредственно перед использованием, добавьте 100 л/также, а затем инкубировать 30 минут при комнатной температуре в темноте.
  11. Добавьте 100 л/хорошо стоп-решения и используйте считыватель пластин для измерения значений OD450 для каждой скважины в течение 30 минут.

6. ELISA анализа взаимодействия между Fc-III и Молекула IgG

  1. Пальто 96-хорошо микротитер пластины с 1 пмоль анти-CA антитела (см. Таблица материалов) в 100 злитель покрытия буфера / хорошо, печать пластины и инкубировать его при 4 кв С ночь на шейкер.
  2. Повторите шаги от 5,2 до 5,3.
  3. Добавьте в скважины fc-III или Fc-III-4C сплавленный ca-белок (0,01, 0,05, 0,1, 0,5 и 1 пм. в 100 л блокирующего раствора), запечатайте тарелку и насигните в течение 2 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Fc-III или Fc-III-4C слитый белок CA выражается в бактериях и очищается Ni-NTA.
  4. Повторите шаги с 5,7 до 5,11 и проверьте результаты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Диаграмма потока для маршрута синтеза по родной химической перевязки в этой статье показана на рисунке 1. Рисунки 2-6 показывают хроматограммы(A)и масс-спектры (B) химического синтезированного гидразина производного пептида Fc-III, рекомбинантного выраженного связующим и антигенной части, очищенного продукта от реакции NCL, очищенного продукт от реакции десульфуризации и очищенный конечный продукт DCAF1, соответственно. Хроматограммы показыв...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол здесь описывает полусинтез и обнаружение DCAF1 с помощью подхода NCL, который показан на рисунке 1. Короче говоря, два фрагмента DCAF1 являются химическими синтезированными и рекомбинантно выраженными, соответственно; Затем молекула DCAF1 по всей длине собирается, модифицируется и очищается. Для гидроцина, полученного синтезом фрагментов FC-III, очень важно использование малой емкости 2-Cl-ресивери, так как высокая мощность оказывает негативное воздействие на выработку гидразина и п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана Фондом Университета Цинхуа-Гейтс (нет. OPP1021992), Национальный фонд естественных наук Китая (No 21502103, 21877068 и 041301475), а также Национальная программа ключевых исследований и разработок Китая (No 2017YFA0505103).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-ХлортритилсмолаTianjin Nankai HECHENG S& T
1-[Бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазоло-[4,5-b]пиридиния гексафторфосфат 3-оксидGL Biochem00703
2-(6-хлор-1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиниумгексафторфосфатGL Biochem00706
2,2′-Азобис[2-(2-имидазолин-2-ил)пропан] дигидрохлоридJ& K Scientific503236
4G2 антителоThermoMA5-24387
4-меркаптофенилуксусная кислотаAlfa AesarH27658
96-луночные микротитровые пластиныNEST701001
ацетонитрилThermo-FisherA955MS
Grade AgOAcSinopharm Химический реагент30164324
анти-GST антителоAbclonalAE001
Anti-mouse IgG, HRP-связанное антителоCell Signaling Technology7076P2
BSABeijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD спектрометрApplied Photophysics Ltd
диализный мешокSbjbioSBJ132636
дихлорметанХимический реагент Sinopharm80047360
диэтиловый эфирХимический реагент Sinopharm 10009318
набор для экстракции геля ДНКBeyotimeD0056
Масс-спектрометр Fusion LumosThermo
GSH SepharoseGE Lifesciences
Гуанидина гидрохлоридХимический реагентSinopharm
Гидрат гидразинаХимический реагент Sinopharm80070418
Химический реагент соляная кислотаSinopharm 10011018
имидазолSIGMA12399-100G
Изопропил&бета;-D-тиогалактозидSIGMA5502-5G
канамицинBeyotimeST101
МетанолThermo-FisherA456MS марки
N, N-диизопропилэтиламинGL Biochem90600
N, N-диметилформамидSinopharm химический реагент8100771933
NcoIThermoER0571
PBS буферSolarbioP1022
пептид BEH C18 колонкавод186003625
пиперидинSinopharm Химический реактив80104216
набор для экстракции плазмидSangon BiotechB611253-0002
QIAexpress KitQIAGEN32149
Набор для быстрого лигирования ДНКBeyotimeD7002
Дигидрат дигидрофосфата натрияSinopharm Химический реагент20040718
Гидроксид натрияХимический реагент Sinopharm10019762
нитрит натрияХимический реагент Sinopharm 10020018
натрием  хлоридSinopharm Химический реагент10019318
стандартные Fmoc-защищенные аминокислотыGL Biochem
стерилизующий горшокTomySX-700
SUMO ProteaseThermo Fisher12588018
стоп растворBiolegend423001
всю последовательность генов, которая может экспрессировать SUMO-линкер-антигенРеагент Taihe Biotechnology Compay
TMBBiolegend421101
трифторуксусная кислотаSIGMAT6508
ТриизопропилсиланGL Biochem91100
Трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлоридАладдинT107252-5г
триптонOXOIDLP0042
Tween 20SolarbioT8220
Ultimate 3000 HPLCТермовакуумный
насосYUHUASHZ-95B
XhoIThermoIVGN0086
дрожжевой экстрактOXOIDLP0021
30095516

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. Human Physiology (4th ed.). , Thomson Learning. (2003).
  2. Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
  3. Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
  4. Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
  5. Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
  6. Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259(2016).
  7. Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
  8. Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
  9. Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
  10. Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
  11. Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
  12. Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
  13. Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
  14. Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи