Разработка двойного функционального конъюгированного антигенного пептида и миметики FC-III (DCAF) является новым для устранения вредных антител. Здесь мы описываем подробный протокол для синтеза молекулы DCAF1, который может избирательно блокировать антитела 4G2 для устранения эффекта повышения антител, зависящих от них во время инфицирования вирусом Денге.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Целенаправленная блокировка антител двойным функциональным конъюгированным антигенным пептидом и миметикой FC-III (DCAF)
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Устранение вредных антител из организмов является ценным подходом для вмешательства антител связанных заболеваний, таких как геморрагическая лихорадка денге и аутоиммунных заболеваний. Поскольку тысячи антител с различными эпитопами циркулируют в крови, ни один универсальный метод, за исключением двойного функционального конъюгирования антигенного пептида и миметики Fc-III (DCAF), не был направлен на конкретные вредные антитела. Развитие молекул DCAF вносит значительный вклад в прогресс целевой терапии, которые были продемонстрированы для устранения антител зависимых повышение (ADE) эффект в модели инфекции вируса Денге (ДЕНВ) и повысить ацетилхолин активности рецепторов в модели миастении gravis. Здесь мы описываем протокол для синтеза молекулы DCAF (DCAF1), который может избирательно блокировать антитела 4G2, чтобы замять эффект ADE во время инфекции вируса Денге, и проиллюстрировать связывание DCAF1 к 4G2 антитела анализа ELISA. В нашем методе DCAF1 синтезируется путем спряжения гидразина, производного пептида FC-III, и рекомбинантного, выраженного длинной селиксом с антигенной последовательностью через местную химическую перевязку (NCL). Этот протокол был успешно применен к DCAF1, а также другие молекулы DCAF для ориентации их cognate антител.
Введение
Антитела играют важную роль в гуморальном иммунном ответе для нейтрализации патогенных бактерий и вирусов1. Тем не менее, некоторые антитела проявляют вредное воздействие на организмы, такие как кросс-реактивные антитела в эффекте ADE во время инфекции DENV и сверхреактивные антитела в миастении gravis, которая является аутоиммунным заболеванием2,3. ADE эффект опосредован кросс-реактивных антител, которые делают мост для подключения DENV и Fc рецепторов представления клеток4,5, в то время как миастения gravis вызвано чрезмерными....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Химический синтез гидразина, производного пептида FC-III
- Преобразование 2-Cl-(Trt)-Cl сгоны до 2-Cl-(Trt)-NHNH2 сена
- Взвесить 625 мг 2-Cl-(Trt)-Cl смолы (0,25 ммоль) в 25 мл пептид синтеза сосуда.
- Добавьте 5 мл N,N-диметилформамид (DMF) в суслив с верхней части сосуда, положите крышку назад, аккуратно встряхните сосуд на 15 с, а затем слейте его. Повторите dMF мыть еще два раза.
- Добавьте 5 мл дихлорметана (DCM) в сосуд, положите крышку назад, аккуратно встряхните сосуд на 15 с, а затем слейте его. Повторите DCM мыть еще два раза.
- Повторите шаг 1.1.2 три раза.
- Используйте 6 м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Диаграмма потока для маршрута синтеза по родной химической перевязки в этой статье показана на рисунке 1. Рисунки 2-6 показывают хроматограммы(A)и масс-спектры (B) химического синтезированного гидразина производного пептида Fc-III, рекомбинантного выраженного связующим и антигенной части, очищенного продукта от реакции NCL, очищенного продукт от реакции десульфуризации и очищенный конечный продукт DCAF1, соответственно. Хроматограммы показыв.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол здесь описывает полусинтез и обнаружение DCAF1 с помощью подхода NCL, который показан на рисунке 1. Короче говоря, два фрагмента DCAF1 являются химическими синтезированными и рекомбинантно выраженными, соответственно; Затем молекула DCAF1 по всей длине собирается, модифицируется и очищается. Для гидроцина, полученного синтезом фрагментов FC-III, очень важно использование малой емкости 2-Cl-ресивери, так как высокая мощность оказывает негативное воздействие на выработку гидразина и п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана Фондом Университета Цинхуа-Гейтс (нет. OPP1021992), Национальный фонд естественных наук Китая (No 21502103, 21877068 и 041301475), а также Национальная программа ключевых исследований и разработок Китая (No 2017YFA0505103).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2-Хлортритилсмола | Tianjin Nankai HECHENG S& T | ||
| 1-[Бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазоло-[4,5-b]пиридиния гексафторфосфат 3-оксид | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-хлор-1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиниумгексафторфосфат | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Азобис[2-(2-имидазолин-2-ил)пропан] дигидрохлорид | J& K Scientific | 503236 | |
| 4G2 антитело | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-меркаптофенилуксусная кислота | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-луночные микротитровые пластины | NEST | 701001 | |
| ацетонитрил | Thermo-Fisher | A955 | MS |
| Grade AgOAc | Sinopharm Химический реагент | 30164324 | |
| анти-GST антитело | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-связанное антитело | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD спектрометр | Applied Photophysics Ltd | ||
| диализный мешок | Sbjbio | SBJ132636 | |
| дихлорметан | Химический реагент Sinopharm | 80047360 | |
| диэтиловый эфир | Химический реагент Sinopharm 10009318 | ||
| набор для экстракции геля ДНК | Beyotime | D0056 | |
| Масс-спектрометр Fusion Lumos | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Гуанидина гидрохлорид | Химический реагент | Sinopharm | |
| Гидрат гидразина | Химический реагент Sinopharm | 80070418 | |
| Химический реагент соляная кислота | Sinopharm 10011018 | ||
| имидазол | SIGMA | 12399-100G | |
| Изопропил&бета;-D-тиогалактозид | SIGMA | 5502-5G | |
| канамицин | Beyotime | ST101 | |
| Метанол | Thermo-Fisher | A456 | MS марки |
| N, N-диизопропилэтиламин | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-диметилформамид | Sinopharm химический реагент | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS буфер | Solarbio | P1022 | |
| пептид BEH C18 колонка | вод | 186003625 | |
| пиперидин | Sinopharm Химический реактив | 80104216 | |
| набор для экстракции плазмид | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Набор для быстрого лигирования ДНК | Beyotime | D7002 | |
| Дигидрат дигидрофосфата натрия | Sinopharm Химический реагент | 20040718 | |
| Гидроксид натрия | Химический реагент Sinopharm | 10019762 | |
| нитрит натрия | Химический реагент Sinopharm 10020018 | ||
| натрием хлорид | Sinopharm Химический реагент | 10019318 | |
| стандартные Fmoc-защищенные аминокислоты | GL Biochem | ||
| стерилизующий горшок | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| стоп раствор | Biolegend | 423001 | |
| всю последовательность генов, которая может экспрессировать SUMO-линкер-антиген | Реагент Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB | Biolegend | 421101 | |
| трифторуксусная кислота | SIGMA | T6508 | |
| Триизопропилсилан | GL Biochem | 91100 | |
| Трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорид | Аладдин | T107252-5г | |
| триптон | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Термовакуумный | ||
| насос | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| дрожжевой экстракт | OXOID | LP0021 |
Ссылки
- Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. Human Physiology (4th ed.). , Thomson Learning. (2003).
- Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
- Gammon, G., Sercarz, E.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
