Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Платформа трансплантации костного мозга для изучения роли дендритных клеток в трансплантации против хост болезни

7.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60083

⸱

17 марта 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Трансплантация против хозяина болезнь является одним из основных осложнений после аллогенной трансплантации костного мозга. Дендритные клетки играют важную роль в патогенеза болезни трансплантата против хозяина. В настоящей статье описывается новая платформа трансплантации костного мозга для изучения роли дендритных клеток в развитии трансплантата против хозяина болезни и трансплантата против лейкемии эффект.

Аннотация

Аллогенная трансплантация костного мозга (BMT) является эффективной терапией гематологических злокачественных новообразований из-за трансплантата против лейкемии (GVL) эффект для искоренения опухолей. Тем не менее, его применение ограничено развитием трансплантата против хозяина болезни (GVHD), основное осложнение BMT. GVHD вызывается, когда Т-клетки в донорских трансплантатах распознаюталонантиген, выраженный клетками-реципиентами, и монтируют нежелательные иммунологические атаки против здоровых тканей реципиента. Таким образом, традиционные методы лечения предназначены для подавления донорской Т-клеточной аллореактивности. Однако эти подходы существенно ухудшают эффект GVL, чтобы выживаемость реципиента не улучшилась. Понимание влияния терапевтических подходов на BMT, GVL и GVHD, таким образом, имеет важное значение. Благодаря антиген-представлению и цитокин-секретов способности стимулировать донора Т-клеток, получатель дендритных клеток (DCs) играют значительную роль в индукции GVHD. Таким образом, таргетинг получателя DCs становится потенциальным подходом для управления GVHD. Эта работа предоставляет описание новой платформы BMT, чтобы исследовать, как принимающие DCs регулируют ответы GVH и GVL после трансплантации. Также представлена эффективная модель BMT для изучения биологии GVHD и GVL после трансплантации.

Введение

Аллогенная гематопоатическая трансплантация стволовых клеток (BMT) является эффективной терапией для лечения гематологических злокачественных новообразований31,,2 через трансплантат-против лейкемии (GVL) эффект 3 . Тем не менее, донорские лимфоциты всегда монтировать нежелательные иммунологические атаки против тканей реципиента, процесс, называемый трансплантата против хозяина болезни (GVHD)4.

Murine модели GVHD являются эффективным инструментом для изучения биологии GVHD и GVL ответ5. Мыши являются экономически эффективной моделью исследования животных. Они небольшие и эффективно дозируются с молекулами и биопрепаратами на ранних стадиях развития6. Мыши являются идеальными исследованиями животных для генетических исследований манипуляции, потому что они генетически хорошо определены, что идеально подходит для изучения биологических путей и механизмов6. Несколько мышь основных гистосовместимости комплекса (MHC) MHC-несоответствие модели GVHD были хорошо созданы, такие как C57BL/6 (H2b) к BALB/c (H25,7d) и FVB (H2q) )b Это особенно ценные модели для определения роли отдельных типов клеток, генов и факторов, влияющих на ГВХД. Трансплантация от C57/BL/6 (H2b) родительским донорам получателям с мутациями в MHC I (B6.C-H2bm1)и/или MHC II (B6.C-H2bm12) показала, что несоответствие как в классе MHC I, так и в классе II является важным требованием для развития острого GVHD. Это говорит о том, что для развития болезни необходимы какCD4, так иCD8 - Т-клетки7,,8. GVHD также участвует в воспалительном каскаде, известном как «провоспалительный цитокиновый шторм»9. Наиболее распространенным методом кондиционирования в моделях мурина является полное облучение тела (TBI) рентгеновским снимком или 137Cs. Это приводит к абляции костного мозга реципиента, тем самым позволяя донору прививать стволовые клетки и предотвращая отторжение трансплантата. Это делается путем ограничения распространения Т-клеток реципиента в ответ на донорские клетки. Кроме того, генетическое неравенство играет важную роль в индукции заболеваний, которая также зависит от незначительных MHC-несоответствие10. Таким образом, доза миелоабливного облучения варьируется в различных штаммов мыши (например, BALB/c'C57BL/6).

Активация т-клеток донора хост антигеном, представляя клетки (APCs) имеет важное значение для развития GVHD. Среди БТР, дендритные клетки (ДК) являются наиболее мощными. Они наследуют способны индуцировать GVHD из-за их превосходного поглощения антигена, экспрессии Т-клеточных костимулирующих молекул, и производства провоспалительных цитокинов, которые поляризуют Т-клетки в патогенные подмножества. Получатель DCs имеют решающее значение для облегчения Т-клеток грунтовки и Индукции GVHD после трансплантации11,12. Соответственно, DCs стали интересными целями в лечении GVHD12.

TBI требуется для повышения донорской клетки прививование. Благодаря эффекту TBI, реципиент DC активируются и выживают в течение короткого времени после трансплантации12. Несмотря на значительные достижения в области использования биолюминесценции или флуоресценции, создание эффективной модели для изучения роли получателя DCs в GVHD по-прежнему является сложной задачей.

Поскольку донорские Т-клетки являются движущей силой для активности GVL, стратегии лечения с использованием иммуносупрессивных препаратов, таких как стероиды для подавления Т-клеточной аллореактивности часто вызывают рецидив опухоли или инфекции13. Таким образом, таргетинг получателя DCs может обеспечить альтернативный подход для лечения GVHD при сохранении эффекта GVL и избежать инфекции.

Короче говоря, текущее исследование предоставляет платформу, чтобы понять, как различные типы сигнализации в получатель DCs регулирует развитие GVHD и эффект GVL после BMT.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Университета Центральной Флориды.

1. Индукция GVHD

ПРИМЕЧАНИЕ: Аллогенная трансплантация клеток костного мозга (БМ) (шаг 1.2) выполняется в течение 24 ч после облучения. Все описанные ниже процедуры выполняются в стерильной среде. Выполните процедуру в капюшоне культуры тканей и используйте фильтрованные реагенты.

  1. День 0: Подготовка получателя мышей.
    1. Используйте самки диких мышей типа (WT) на фоне BALB/c (CD45.2и H2kd)), 10-12 недель в качестве получателей.
    2. Ухо-тег и взвесить получателей до TBI. Затем поместите до 11 мышей в камеру облучения и держите его в облучении. Облучить в разовой дозе 700 cGy в течение 10-15 мин.
    3. Вернуть облученных животных в клетки и разместить их в патогенных учреждениях до трансплантации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальная масса тела получателей должна быть около 20 г. Используйте этот вес в качестве ссылки для расчета потери веса тела в течение экспериментального периода.
  2. День 1: Подготовка Т-клеток истощенного костного мозга (TCD-BM) от донорских мышей.
    1. Эвтанизировать CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 мышей CO2 удушья и ждать 2'3 мин, пока они не будут без сознания. Выполните вывих шейки матки как вторичную эвтаназию, если это необходимо.
    2. Поместите каждую мышь на чистую рабочую доску. Обезвить мех и кожу с 70% изопропанола.
    3. Соберите голени и бедренной кости с обеих ног с помощью щипков и ножниц. Положите их в ледяной RPMI, содержащий 1% FCS и 100 U/mL пенициллин / стрептомицин и 2 мМ L-глутамин (1% RPMI) в 50 мл конических труб. Очистите бедренную кейстер и кости голени тщательно, удалив все мышечные ткани с помощью щипц и ножниц. Перенесите бедренную кость и голени из конических труб 50 мл в чашку Диаметром 92 мм, содержащую 1% RPMI.
    4. Используя ножницы, вырезать концы бедренной кости или голени. Заполните трубку 50 мл с 25 мл 1% RPMI 1640 средних. Используйте это, чтобы заполнить 3 мл шприц, прикрепленный к 26 G иглы с 3 мл 1% RPMI. Вставьте этот шприц в кость и нажмите поршень, чтобы смыть костный мозг (БМ) из полости в трубку сбора с 1% RPMI (3 мл / кости).
    5. Повторите шаг 1.2.4 для всех оставшихся костей голени и бедренной кости от других мышей-доноров. Храните все трубки коллекции на льду.
    6. Сделать одноклеточной подвески путем промывки костного мозга штук через 75 мкм сетки ячейки ситечко. Соберите одноклеточную подвеску в трубке 50 мл.
    7. Центрифуги трубки при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Аспирируй и отбрасывай супернатант. Приостановить гранулы в буфере PBS, содержащий 0,5% бычьего сыворотки альбумина (BSA) на 20 x 106 клеток/мл. Сохранить aliquot 2 х 106 клеток для очистки чистоты.
    8. Добавить антитела Thy 1 при 0,05 мкг/106 клеток14 и инкубировать в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия. Вымойте один раз с 25 мл ледяной PBS. Resuspend на 20 x 106/mLв 0.5% BSA/10% молодой дополнение кролика/2% DNase (10,000 U/mL в стерильных H2O). Инкубировать в течение 45 мин при 37 градусах По Цельсию и мыть 2x, как раньше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Т-клетки истощаются с помощью mAb, специфичный для Thy1, белка, выраженного всеми Т-клетками, но не другими лейкоцитами.
    9. Resuspend клетки в 20 мл pbS буфера, содержащего 0,5% BSA. Подсчитайте клетки костного мозга в 1% уксусной кислоты с помощью геоцитометра. Держите aliquot 2 х 106 клеток для проверки чистоты по течению цитометрии после очистки клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одна донорская мышь обычно генерирует около 25 х 106 TCD-BM.
    10. Используйте цитометрию потока, чтобы подтвердить успешное истощение Т-клеток. Пятно 1 х 106 клеток, сохраненных от шагов 1.2.7 (до истощения Т-клеток) и 1.2.9 (TCD-BM после истощения Т-клеток) со следующими антителами: q-CD3 (17A2), q-CD4 (GK1.5) и К-CD8 (53-6,7).
  3. День 1: Подготовка Т-клеток от мышей-доноров
    1. Используйте в качестве доноров для Т-клеток мышей CD45.2и H2kb' C57BL/6 диких типов (WT).
    2. Эвтаназия C57BL/6 мышей при углекислом газе (CO2) удушье, как описано в 1.2.1.
    3. Тщательно очистите мех и кожу мыши с помощью 70% этанола. Акцизные селезенки и лимфатические узлы и отделить их на одну клеточную подвеску спленоцитов с помощью шприца поршень и 40 мкм сетки strainers. Вымойте ситечко и шприц поршень с 1% RPMI (1% FBS, содержащий RPMI СМИ), чтобы собрать все спленоциты.
    4. Центрифуги яточной подвески при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Добавьте 5 мл lysing буфера ACK (1 мМ Na2EDTA, 10 мМ KHCO3,144 мМ NH4Cl, pH 7.2) после отбрасывания супернатанта. Инкубировать клеточную подвеску в течение 5 мин при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ACK лиза буфер используется для лиза красных кровяных телец.
    5. Добавьте 5 мл 1% RPMI, чтобы остановить лиза. Центрифуга при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Отбросьте супернатант.
    6. Подготовка ледяной магнитно-активированной сортировки ячейки (MACS) буфер (0.5% BSA, 2 мМ EDTA в PBS, pH 7.2). Дега буфер перед использованием. Отрежь пеллеты клеток в 5 мл буфера MACS.
    7. Подсчитайте спленоциты и проверьте живые и мертвые клетки с помощью гемоситометра и 1% трипан синий. Сохранить аликвот 2 х 106 клеток для оценки урожайности очистки с циклометрии анализа потока.
    8. Приостановите спленоциты в концентрации 2006х 10 6/мл в буфере MACS. Добавьте 0,03 л биотина против мыши-Тер-119, 0,03 л биотина против мыши-CD11b, 0,03 л биотина против мыши-CD45R и 0,03 л биотин анти-мышки-DX5 на 106 клеток. Инкубировать в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Biotin anti-mouse-Ter-119, biotin anti-mouse-CD11b, biotin anti-mouse-CD45R, и biotin anti-mouse-DX5 были использованы для того чтобы прореагировать с эритроидами, granulocytes, B-клетками, и клетками NK соответственно. Таким образом, эти подмножества клеток истощаются в следующем шаге15.
    9. Добавьте 10 мл ледяного буфера MACS в суспензию ячейки. Центрифуга при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Отбросьте супернатант.
    10. Приостанавливать действие клеточных гранул в буфере MACS в6концентрации 100 x 10 6/мл. Добавьте антибиотиновые микробусы (0,22 л/106 клеток) к суспензии. Хорошо перемешайте и инкубировать еще 15 мин при 4 градусах Цельсия. Вымойте суспензию ячейки один раз с 10 мл ледяного буфера MACS. Центрифуга при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах по Цельсию и отбрасывайте супернатант.
    11. Поместите магнитную отделяющую колонку в магнитное поле. Промыть столбец с 3 мл буфера MACS. Опустите подвеску ячейки на столбец. Соберите поток через состоящий из несвязанных, обогащенных Т-клеток, в новой 15 мл конической трубки. Вымойте колонку MS с 3 мл ледяного буфера MACS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что столбец пуст перед выполнением стирки.
    12. Центрифуги яточной подвески при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Отрежь пеллетку ячейки в 5 мл буфера MACS.
    13. Подсчитайте клетки в 1% трипан синий с помощью гемоцитометра. Сохранить aliquot 2 х 106 клеток для проверки чистоты по потоку цитометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Средняя урожайность селезенки Т-клеток, изолированных этим методом, составляет 20-25 х 106 ячеек на мышь.
    14. Подтвердите выход Т-клеточного обогащения цитометрией потока. Пятно 1 х 106 клеток, сохраненных от шагов 1.3.7 (до истощения Т-клеток) и 1.3.13 (TCD-BM после истощения Т-клеток), со следующими антителами: q-CD3 (17A2), q-CD4 (GK1.5) и К-CD8 (53-6.7).
  4. День 1: Впрыскивать облученных мышей с донорскими Т-клетками и ТКД-БМ.
    1. Вымойте TCD-BM и Т-клетки 2x с PBS (800 х г в течение 5 мин при 4 C). Приостанавливайте действие клеток в ледяном PBS для инъекций. Отрегулируйте концентрацию клеток6до 20 x 10 6/мл для ТКД БМ и 4 х 106/млдля Т-клеток.
    2. Нагрейте животное с помощью нагревательной лампы, чтобы увеличить видимость двусторонних хвостовых вен. При необходимости поместите мышь в удерживатель.
    3. Очистите поверхность хвоста с помощью 70% изопропанола. Впрысните TCD-BM (5 x 106 клеток/мышь) с или без T-клеток (0.75 x 106 ячеек/мышь). Будьте осторожны, чтобы не ввести воздух в шприц.
    4. Снимите иглу и нанесите антисептический тампон непосредственно к месту инъекции 5–10 с, чтобы остановить кровотечение.
  5. Оцените GVHD в дни 2–80.
    1. Следите за выживанием животных. Мониторинг клинических признаков GVHD адаптированы из системы скоринга, установленной ранее Кук и др.16 и массы тела мышей-реципиента 2x в неделю. Используйте вес тела определяется до TBI для расчета потери веса тела.
    2. Взвешивать каждую мышь по отдельности. Оценка потери веса следующим образом: класс 0 и менее 10%; 1-й класс - 10%-20%; 2 класс - более 20%.
    3. Оценка знака осанки получателей: оценка 0 - нет предчувствия; сорт 0,5 - небольшое предчувствие, но выпрямляется при ходьбе; 1-й класс - животное остается сгорбившись при ходьбе; сорт 1.5 - животное не выпрямляет; класс 2.0 - животное стоит на задних носовых ясниках.
    4. Оценка знака мобильности получателей: оценка 0 и очень активная; сорт 0,5 - медленнее, чем наивные мыши; сорт 1.0 - перемещается только тогда, когда ткнул; сорт 1.5 - слегка перемещается при ткнуле; класс 2.0 - не двигается, когда ткнул.
    5. Оценка кожи получателей: класс 0 - без ссадин, поражений или масштабирования; сорт 0,5 - покраснение в одной конкретной области; 1-й класс - ссадины в одной области или легкая ссадины в двух областях; 1.5 - серьезные ссадины в двух или более областях; 2.0 - тяжелые ссадины, растрескивание кожи, высохшая кровь.
    6. Оценка меха получателей: оценка 0 - нет ненормальных признаков; класс 0,5 - преодоление на стороне живота или затылка, класс 1.0 - преодоление поперек или стороны живота и шеи; класс 1.5 - неопрятный спутанный и ржавый мех; класса 2.0 - плохо спутанный мех на животе и спине.
    7. Оценка диареи получателей: класс 0 и без диареи; сорт 0,5 - легкий и мягкий стул; сорт 1.0 - мягкий (желтый стул); 1,5 - умеренный (желтый стул с небольшим количеством крови); класс 2 - тяжелый (светло-желтый и кровавый стул, "сушеный торт стул" появляются на анальной области).

2. Модель котрансплантации

  1. Генерация дендритных клеток костного мозга (BM-DCs).
    1. Изолировать костный мозг от бедренной кости и tibias WT или фактор B (fB)-/- мыши на фоне B6, как описано в шагах 1.2.3'1.2.4. Спин клетки на 800 х г в течение 5 мин.
    2. Приостановите гранулы в 5 мл lysing буфера ACK для лиза красных кровяных телец. Инкубировать клеточную подвеску на 5 мин на льду. Добавьте 10 мл 1% RPMI к суспензии клетки, чтобы остановить лисис и центрифугу при 800 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант.
    3. Повторное использование клеточных гранул в 10 мл культурных носителей (RPMI 1460, содержащих 10% FBS, 100 U/mL пенициллина/стрептомицина, 2 мМ л-глютамина и 50 мМ-меркаптоэтанола) и отрегулируйте объем, чтобы соответствовать конечной концентрации 2 х 106 клеток/мл.
    4. Добавьте 20 нг/мЛ гранулоцитов-макрофаг колонии-стимулирующего фактора (GM-CSF) в клеточной подвеске. Культура клеток костного мозга в 100 х 15 мм Петри блюда при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 в течение 6 дней.
    5. Замените половину текущих культурных носителей (около 5 мл) свежими носителями, содержащими 40 нг/мл GM-CSF на 3-й день.
    6. Разогреть культуры средств массовой информации в водяной бане на 37 градусов по Цельсию. Соберите около 5 мл средств массовой информации из костного мозга культуры блюд. Центрифуга при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Отбросьте супернатант. Отрептить клеточные гранулы в среду 5 мл культурных носителей, содержащих 40 нг/мл GM-CSF.
    7. Добавить 25 мкг/мл липополисахарида (LPS) в средствах массовой информации на 6-й день культуры для созревания BM-DCs. Сохранить aliquot 2 х 106 клеток, чтобы определить эффективность ДИфференциации DC по потоку цитометрии.
    8. Соберите созрели BM-DCs: Используйте подъемники для мягкого соскребать DCs из посуды Петри. Соберите все клеточные суспензии в конические трубки 50 мл. Центрифуга при 800 х г,в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант. Вымойте клеточные гранулы 3x с 50 мл ледяной PBS. Сохранить около 2 х 106 BM-DCs для иммунологического анализа фенотипа с помощью цитометрии потока.
  2. Выполните дендритную клеточную котрансплантацию БМТ (DC-котрансплантационирующая BMT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте FVB (H2kq) мышей в качестве доноров для Т-клеток и БМ-клеток. Облучение B6 Ly5.1 мышей-реципиентов в дозе 1100 cGy (2 дозы, 3 ч интервал). Подробности смотрите в шаге 1.1.
    1. Изолировать БМ от бедренной кости и tibias из FVB донора мышей. Подробности смотрите в шагах 1.2.3-1.2.10.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте общий изолированный костный мозг вместо TCD-BM в этой модели.
    2. Очистка Т-клеток от селезенок и лимфатических узлов мышей-доноров FVB. Подробности смотрите в шагах 1.3.1-1.3.13.
    3. Впрыскивает БМ (5 x 106/мышь), Т-клетки (0,5 х 106/мышь) с БМ-Код (2 x 106/мышь) в день 0 экспериментального курса.
    4. На 3-й день после трансплантации, изучить донора DC восстановления потокциометрии.
      1. Собирайте кровь из глаз получателей.
      2. Анестезия CD45.1/Ly5.1 B6 мышей на 3% изолюранинга. Проверьте глубину анестезии на отсутствие реакции на щепотку ног.
      3. Поместите стерильную стеклянную трубку пипетки в медиальной кантоны глаза, направленной caudally под углом 30-45 "от плоскости носа. Нанесите давление при мягкой вращении трубки.
      4. Опустите кровь в 10 йл гепариносодержащих стерильных 1,5 мл микроцентрифуговых труб. Перенесите 50 л крови в трубы потока стекла 5 мл.
      5. Добавьте 2 мл lysing буфера ACK. Инкубировать при 37 градусах Цельсия в водяной бане в течение 45 мин. Добавить 2 мл буфера окрашивания FACS. Центрифуга при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Отбросьте супернатант.
      6. Отстегивай теплат с 200 qL буфера FACS, содержащего соответствующие тексируя антитела потока (живой/смертельный желтый, з-H-2Kb,q-CD45.1, q-CD45.2, q-CD11c, и q-MHCII). Инкубировать в течение 15 минут при 4 градусах по Цельсию в темноте. Вымойте 2x с буфером 1 мл FACS. Повторное удаление клеточных гранул в 200-х годах буфера FACS и выполнение анализа цитометрией потока.

3. GVHD/GVL Модели БМТ

  1. Выполните индукцию GVHD/GVL.
    1. Культура люциферазы транс-лимфомы клеток A20 B в средствах культуры RPMI.
    2. Облучение BALB/c фон WT или Ly5.1 получателя на 700 cGy (разовая доза). Подробности смотрите в шаге 1.1.
    3. Изолировать TCD-BM из бедренной кости и tibias B6. Ly5.1 донорские мыши. Подробности смотрите в шагах 1.2.1-1.2.10.
    4. Очистка Т-клеток от селезенки и лимфатических узлов мышей-доноров C57BL/6. Подробности смотрите в шагах 1.3.1-1.3.15.
    5. Вымойте лимфомы A20 2x с 25 мл PBS. Отдохните пеллеты клетки в 10 ml ледяного PBS. Возьмите аликот суспензии клетки (10 qL) и подсчитайте клетки, используя 1% трипан синий и гемоцитометр. Отрегулируйте концентрацию клеток до 20 000 клеток/мл.
    6. Впрысните TCD-BM (5 x 106/мышь) с или без T-клеток (0.75 x 106/mouse)и лимфомы A20 (5000 клеток/мышей).
    7. Следите за выживаемость реципиента, клинические признаки GVHD и потеря веса тела во время экспериментального курса. Подробности смотрите в шаге 1.5.
  2. Выполните биолюминесцентную визуализацию.
    1. Мониторинг роста опухоли у пересаженного реципиента путем введения мышей-реципиента с 4 мг D-люциферина. Инкубировать в течение 5 минут, чтобы обеспечить люциферин реагирует с люциферазы.
    2. Анестезия мыши с помощью 3% изофлуран в камере биолюминесценции изображения и изображения получателей в течение 5 минут в поле D и время экспозиции 1 мин.
    3. Анализ данных с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Измените масштаб псевдоцветных изображений для достижения наилучших результатов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все фотографии должны быть в одинаковом масштабе в экспериментах.
    4. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для определения регионов, представляющих интерес, и количественной оценки плотности сигнала путем расчета потока (фотон/ы), испускаемого из каждой области, представляющих интерес.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Основная модель MHC-mismatched B6b(H2k b)-BALB/C (H2kd)тесно соответствовала развитию GVHD после трансплантации(рисунок 2). Все шесть клинических признаков ГВХД, установленных ранее Cooke et al.16, произошли у реципиентов, пересаженных СВ-В6 Т-клеток, но не у реципиентов, пересаженных только с БМ (шаг 1.5), которые представляли GVHD-отрицательную группу. В этой модели есть два этапа разработки GVHD. Во-первых, пик...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Использование стволовых клеток в соответствии с конкретным человеком является эффективным подходом для лечения передовых и устойчивых раковых заболеваний18. Малые молекулы фармацевтических препаратов, однако, уже давно остается основным направлением персонализированной терапии рака. С другой стороны, в клеточной терапии множество взаимодействий между донором и хозяином может решительно влиять на исходы лечения, такие как развитие GVHD после BMT1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование поддерживается Университетом Центральной Флориды колледж медицины запуска гранта (для HN), Университет Питтсбурга Медицинский центр Хиллман онкологический центр Хиллман онкологический центр запуска гранта (в HL), Соединенные Штаты NIH Грант #1P20CA210300-01 и Вьетнамского Министерства здравоохранения Грант #4694 / КД-BYT (к PTH). Мы благодарим д-ра Сюэ Чжун Ю в Медицинском университете южной Каролины за предоставление материалов для исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,5 М ЭДТА pH 8,0 100 млFisher ScientificBP2482100MACS буфер
10X PBSFisher ScientificBP3994MACS буфер
A20 В-клеточная лимфомаУниверситет Центральной ФлоридыВнутреннийэксперимент GVL
ACC1 fl/flJackson Lab30954GVL эксперимент
ACC1 fl/fl CD4creУниверситет Центральной ФлоридыЭксперимент GVL
Антибиотин МикрошарикиMiltenyi Biotec130-090-485Обогащение Т-клеток
Анти-человек/мышь CD45R (B220)Thermo Fisher Scientific13-0452-85Обогащение Т-клеток
Анти-мышь B220 FITCThermo Fisher Scientific10452-85Анализ проточной цитометрии Антимышь
CD11c-AF700Thermo Fisher Scientific117319Анализ проточной цитометрии
Anti-mouse CD25 PEThermo Fisher Scientific12-0251-82Проточное окрашивание
Anti-mouse CD4 BiotinThermo Fisher Scientific13-0041-86Обогащение Т-клеток
Anti-mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® замена)Thermo Fisher Scientific48-0042-82Окрашивание под воздействием Flow
CD45.1 PEThermo Fisher Scientific12-0900-83Анализ проточной цитометрии
Anti-mouse CD8a APCThermo Fisher Scientific17-0081-83Анализ проточной цитометрии
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710Thermo Fisher Scientific46-5958-82Анализ проточной цитометрии
Anti-mouse MHC Class II-антитела APCThermo Fisher Scientific17-5320-82Анализ проточной цитометрии
Антимышиный TER-119 БиотинThermo Fisher Scientific13-5921-85Обогащение Т-клеток
Anti-Thy1.2Bio ExcelBE0066BM поколение
B6 fB-/- мышиУниверситет Центральной ФлоридыВ домеПолучатели
B6. Ly5.1 (CD45.1+) мышиCharles River564Доноры
BALB/c мышиCharles River028Реципиенты трансплантатов
C57BL/6 мышиCharles River027Доноры/реципиенты
CD11bThermo Fisher Scientific13-0112-85Обогащение Т-клеток
CD25-биотиномThermo Fisher Scientific13-0251-82Обогащение Т-клетками
CD45RThermo Fisher Scientific13-0452-82Обогащение Т-клеток
CD49b Моноклональное антитело (DX5)-биотинThermo Fisher Scientific13-5971-82Обогащение Т-клеток
Клеточный фильтр 40мкМ Thermo Fisher Scientific22363547Клеточный препарат Клеточный
фильтр 70 мкМThermo Fisher Scientific22363548Клеточный препарат
D-LuciferinGoldbioLUCK-1GСыворотка для визуализации плода
крупного рогатого скота (FBS)Atlanta Bilogicals R& D systemD17051Cell Culture
Проточная цитометрия ПробиркиFisher Scientific352008Анализ проточной цитометрии
FVB/NCrlCharles River207Доноры
Липополисахарид (ЛПС)Millipore SigmaL4391-1MGDC зрелая
колонка LSMitenyi Biotec130-042-401Клеточный препарат
MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302Обогащение Т-клеток
Нью-Брансуик Galaxy 170R инкубаторEppendorfGalaxy 170 RКлеточная культура
Пенициллин+стрептомицинПенициллин/стрептомицин (10 000 единиц пенициллина / 10 000 мг/мл стрептококка)GIBCO15140Медиа
RPMI 1640Thermo Fisher Scienctific11875-093Медиа
TER119Thermo Fisher Научный13-5921-82Обогащение Т-клеток
Ксеноген IVIS-200Перкин ЭлмерКсеноген IVIS-200Визуализация живых животных
X-RAD 320 Биологический облучательПрецизионный рентгеновскийX-RAD 320Облучение всего тела
аппарат

Ссылки

  1. Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
  2. Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
  3. Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
  4. Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
  5. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
  6. Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006(2018).
  7. Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
  8. Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
  9. Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
  10. Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
  11. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  12. Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
  13. Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
  14. Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  15. Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
  16. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  17. Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
  18. McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417(2013).
  19. Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
  20. Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
  21. Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
  22. Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
  23. Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
  24. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

BMHCA20
Платформа трансплантации костного мозга для изучения роли дендритных клеток в трансплантации против хост болезни
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.